本研究领域涉及动物组织中糖原含量测定方法，特别是涉及蒽酮比色法测定牡蛎组织糖原含量的操作方法。
背景技术：
：糖原，又称动物淀粉，是人类等动物储存糖类的主要形式，是多糖的一种，由葡萄糖脱水缩合作用而成。主要生物学功能是作为动物的能量储存物质。研究表明，糖原具有解酒保肝、抗疲劳、抗肿瘤等生物活性。糖原亦是大多数水产贝类体内最直接有效的储能物质，在其生理代谢方面发挥着至关重要的作用。牡蛎的糖原含量通常占其干重的20％-40％，可以直接被人体吸收利用，大量研究表明，糖原是影响牡蛎肉质肥美的主要呈味物质之一。因此，糖原含量作为牡蛎的重要肉品质性状，是影响消费者购买意愿的关键因素，直接决定牡蛎产品的市场价值。2016年，我国牡蛎养殖面积高达15万公顷，产量483万吨，居贝类首位。牡蛎亦是世界性养殖物种，在欧洲，牡蛎是一种传统必备而又令人情有独钟的食材，生食牡蛎在许多国家都有着悠久的历史。中国牡蛎产量占全世界的80％以上，但出口量却不足世界贸易量的5％。因此，选育高糖原含量的牡蛎是水产领域工作中的重要方向，确立准确高效的牡蛎糖原测定方法显得至关重要。目前，贝类糖原含量测定的主流方法为蒽酮比色法，早在1955年就有学者应用于小鼠肝脏糖原含量测定，此法也一直沿用至今，目前国内市场上两款主流的糖原测定试剂盒，肝/肌糖原测定试剂盒(南京建成，中国)、糖原含量检测试剂盒(solarbio，中国)亦是应用的此法，其具体原理在于糖原在酸的作用下水解为葡萄糖，葡萄糖与浓硫酸作用生成糠醛衍生物，糠醛衍生物与蒽酮反应生成蓝色化合物，此物质在620nm处有最大吸收峰，测定其吸光度可计算得糖原含量。并且糖原在浓碱溶液中性质稳定，可用浓碱加热破坏其余组织。在国际上，亦有enzychromtmglycogenassaykit试剂盒(bioassaysystems，美国)，其原理为糖原酶促分解为葡萄糖，葡萄糖与显色剂反应，产物在570nm处有最大吸收峰，此试剂盒对样品前处理要求高，且成本颇高，1800元/48样品，国内学者多青睐于国产试剂盒。于此同时，在现代贝类遗传育种或贝类生物信息学分析工作中，通常需要大量的基本生物学数据作为支撑条件，即便是国产试剂盒法也很难适用于高重复大批量的样品测定。王卫军等(长牡蛎生长和肉质性状的遗传参数研究[d].中国海洋大学,2015)通过构建牡蛎糖原含量的近红外(nir)光谱模型，通过近红外(nir)光谱分析技术检测糖原含量，能准确高效的完成大批量的样品测定工作，但模型的构建亦需要依赖传统的糖原检测方法，且近红外法对仪器设备要求较高，且不同物种需要建立不同的分析模型，较难推广使用。刘思玮(长牡蛎糖原代谢酶基因多态性与生长及糖原含量相关性研究[d].中国海洋大学,2013.)、从日浩(长牡蛎快速生长品系选育及重要功能基因与生长和糖原含量相关性研究[d].中国海洋大学,2014.)、等用传统的蒽酮比色方法完成了大批量的样品糖原测定工作，用于其研究分析的基本支撑数据。传统方法每反应使用5ml蒽酮硫酸显色剂，反应体系达5.5ml，由此带来的工作量非常大，且测定效率不高，大量浓硫酸的使用也会给实验人员带来潜在的风险。现有的蒽酮比色法在糖原测定过程中，往往要求在取样过程中需要精确称取某一特定量的样品，或稀释成某一特定的倍数，如刘思玮、从日浩等精确称取30.0mg的样品，然后进行下一步处理，李春燕(牡蛎营养品质等重要经济形状的遗传定位与基因解析[d].中国科学院大学，2017.)、高珊，童英，熊晓燕，等.(蒽酮法与试剂盒法测定糖原含量的比较研究[j].首都公共卫生，2011)在取样过程中分别精确称取了30.0mg与100.0mg样品，然后进行下一步的处理。诚然，此种固定某一量的取样方法会方便后续的糖原含量的计算，但需要称量大批量样品时，此种取样方法操作效率过低，此外，精确称取特定样品量，高精度分析天平(十万分位天平，精度0.01mg)称量是最理想的仪器，而实验室常规分析天平为万分之一天平(精度0.1mg)，使用常规分析天平在实际操作过程中较为困难。技术实现要素：本发明要解决的技术问题在于提供一种测定牡蛎组织中糖原含量的方法，本发明方法取样简单，使用的化学试剂少，反应体系小，节省检测成本，同时降低了实验的危险性。本发明是通过如下技术方案来实现的：一种测定牡蛎组织中糖原含量的方法，所述方法包括待测液的制备、制作标准曲线、样品糖原含量测定；在所述待测液的制备中样品称取的步骤，称取18.0-22.0mg区间范围的任一质量的干重样品，如使用高精度分析天平精确到小数点后2位；所述待测液的制备中离心的步骤为取0.8-1.2ml定容后的消化液于ep管中，8000-12000g，室温离心8-10min；在所述待测液的制备中消化定容的方法中，用移液枪精确移取溶液；在所述的制作标准曲线步骤中葡萄糖标准液浓度范围应在0.01-0.28mg/ml；在所述制作标准曲线步骤中取1.5mlep管加入0.2％蒽酮硫酸试剂200μl，置于冰浴中，移液枪沿管壁缓慢分别加入不同浓度葡萄糖溶液100μl；在所述样品糖原含量测定步骤中，取1.5mlep管加入0.2％蒽酮硫酸试剂200μl，置于冰浴中；沿着管壁缓慢加入90μl蒸馏水；然后移液枪精确取10μl待测液缓慢打入到溶液上层；在所述样品糖原含量测定步骤中，显色剂与检测液比例为200μl：100μl，共300μl；在所述样品糖原含量测定步骤中精确沸水浴10min，取出后流水冷却；在所述样品糖原含量测定步骤中，通过如下公式计算可得样品糖原含量，c＝c0*(5ml/w)*10*0.9；其中c为样品糖原含量，单位为mg/g；c0为根据标准曲线计算得到反应液中葡萄糖的相当含量，单位为mg/ml；其中w为所取样品质量，单位为g；5ml为样品消化完成后最终定容时的体积，即待测液总体积；5ml/w为样品的稀释倍数；10为待测液在测定过程中的稀释倍数；0.9为葡萄糖与糖原之间的转换系数，即100μg葡萄糖与蒽酮试剂显色相当于90μg糖原与蒽酮试剂显色。本发明还提供具体的一种测定牡蛎组织中糖原含量的方法，所述方法具体步骤如下：1)待测液的制备(i)测定样品干重糖原含量待测液制备(1)取新鲜样品冷冻干燥48h，实际操作中取适量样品于1.5mlep管中，方便批量干燥；(2)将样品研磨成粉末状，贝类肌肉组织较难研磨至粉末状，呈絮状即可，不影响后续消化过程；(3)称取18.0-22.0mg样品于10ml刻度试管中，移液枪精确加入1ml30％koh溶液；(4)盖上试管塞，防止溶液挥发，沸水浴消化30min，期间每隔3-5min摇晃试管使其消化完全，至澄清透明。贝类的外套膜和鳃难以消化的组织可延长消化时间至40min-60min；(5)消化完全后，用蒸馏水定容至5ml，摇匀，实际操作过程中，用移液枪精确加入4ml蒸馏水即可；(6)取0.8-1.2ml稀释后的消化液于ep管中，8000-12000g，室温离心8-10min，取上清液至于新ep管中，即为冻干样品待测液，可置于-80℃冰箱保存数周。或者(ii)测定样品鲜重糖原含量待测液制备(1)取新鲜待测样品，用滤纸吸干表面水分；(2)称取新鲜样品90.0-110.0mg，适当剪碎后置于10ml刻度试管中；(3)移液枪精确加入900μl30％koh溶液；后续步骤同上述(i)冻干样品待测液制备中(4)(5)(6)；2)标准曲线制作制作标准曲线时，葡萄糖标准液浓度范围应在0.01-0.28mg/ml之间，葡萄糖标准液浓度过高或过低均会影响吸光度的准确测定。(1)由1mg/ml葡萄糖标准液配置成如下浓度的葡萄糖溶液(2)取7支1.5mlep管(其中一支为空白组)加入0.2％蒽酮硫酸试剂200μl，置于冰浴中；(3)移液枪沿管壁缓慢加入上述葡萄糖溶液100μl，切忌猛烈快速打入，反应体系瞬间放出大量热会使反应时间提前，造成误差；(4)设置空白组，空白组加入100μl蒸馏水；(5)混匀后，精确沸水浴10min，取出流水冷却；(6)取200μl反应液于96孔板上，酶标仪在620nm处测定吸光值，绘制标准曲线。3)样品糖原含量测定(1)取ep管加入0.2％蒽酮硫酸试剂200μl，置于冰浴中；(2)沿着管壁缓慢加入90μl蒸馏水；(3)移液枪精确取10μl待测液打入到溶液上层；(4)混匀后，精确沸水浴10min，取出后流水冷却；(5)取200μl冷却后反应液于96孔板中，静置20-30min，利用酶标仪在620nm处测定吸光值；(6)根据标准曲线计算得到检测液中葡萄糖的相当含量c0，单位为mg/ml；(7)根据公式，c＝c0*(5ml/w)*10*0.9，计算可得样品糖原含量；其中c为样品糖原含量，单位为mg/g；c0为根据标准曲线计算得到检测液中葡萄糖的相当含量，单位为mg/ml；w为所取样品质量单位为g；5ml为样品消化完成后最终定容时的体积，即待测液总体积；5ml/w为样品稀释倍数；10为待测液在测定过程中的稀释倍数；0.9为葡萄糖与糖原之间的转换系数，即100μg葡萄糖与蒽酮试剂显色相当于90μg糖原与蒽酮试剂显色。本发明与现有技术相比的有益效果：本发明构建了小反应体系下(300μl体系)蒽酮比色法测定糖原含量的整套操作流程，本发明糖原测定反应在普通1.5mlep管中即可进行，并且本发明通过糖原含量计算公式的改进，取适当的区间范围质量的样品即可，解决了实际操作过程中难以取某一特定质量数样品从而带来的实验误差，本发明亦根据所用实验室常规仪器设备对每一步的试剂的添加量，实际操作方法与各个反应条件进行了改进，使得本发明所构建的操作流程更加合理，测定的糖原含量更加稳定准确。且本发明构建的糖原含量的方法更加实用、经济。在现有技术中，在称取样品时必须称取整数质量的样品，比如20mg、30mg或者50mg，在样品中糖原含量计算时只需乘以特定的稀释倍数即可，如总定容体积为3ml，则分别稀释了150倍，100倍，60倍；在本发明技术方案中，只需称取某一区间范围内的质量即可，比如称取18.0-22.0mg区间范围内任一质量数的样品，能够精确到小数点后2位，在计算样品中糖原含量时，由待测液总体积算出实际的稀释倍数，以实际稀释倍数代入公式，以矫正因称取量差异造成的误差，因此，本发明有益效果是由计算公式控制称量误差，使得测定结果更加精确，同时使样品称量更简单。在本发明技术方案中，定容后取0.8-1.2ml稀释后的消化液于ep管中，8000-12000g，室温离心8-10min，其有益效果是去除溶液中不能用浓碱溶液消化的杂质，防止其在测定过程中杂质影响测定结果，使得测定结果更加准确。在本发明技术方案中，使用移液枪精确加入4ml蒸馏水稀释，其有益效果是排除了由精确度较差的刻度试管定容时所造成的误差，使得样品稀释倍数更加精确可靠，操作也更加高效。在本发明技术方案中，在显色反应时，加入0.2％蒽酮硫酸试剂200μl，置于冰浴中，移液枪沿管壁缓慢加入葡萄糖溶液100μl，其有益效果是冰浴与缓慢加入控制了浓硫酸稀释放出大量热给实验带来的影响，并且200μl：100μl体系是本发明中牡蛎糖原测定时的最佳比例，显色剂用量少，ep管中操作即可，批量进行显色反应也十分方便。在本发明技术方案中，在显色反应时，精确沸水浴10min，取出后流水冷却，其有益效果是体系反应完全且不会过度反应，避免反应物进一步脱水，反应体系由蓝色变黑色，造成较大实验误差。在本发明技术方案中，在显色反应时，移液枪精确取10μl待测液打入上层溶液中，其有益效果是10μl可由移液枪精确控制，并且此取样量在本发明中，最终所测得的吸光值会落在标准曲线上。打入上层溶液中是防止待测液提前与浓硫酸接触，防止反应提前，使得反应时间能够精确控制。附图说明图1为不同浓度的葡萄糖标准液与吸光度值，其中公式中x代表葡萄糖浓度，y代表吸光度。具体实施方式下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的技术方案不受实施例任何形式上的限制。实施例11.试剂与仪器(1)试剂：蒽酮(anthrone>98.0％(gc)，日本，tokyochemicalindustryco.,ltd)；葡萄糖标准品(d( )-无水葡萄糖标准品，中国，北京索莱宝科技有限公司)；氢氧化钾(优级纯，中国，科密欧化学试剂有限公司)；浓硫酸(优级纯，中国，国药集团化学试剂有限公司)。(2)仪器：酶标仪(multiskanskymicroplatespectrophotometer，美国，thermoscientifictm)；微孔板(96-wellclearflatbottompolystyrenenbsmicroplate，美国，corning)；选择普通平底96孔板即可满足常规均相非结合的吸收光分析实验需求，无需使用昂贵的特殊表面处理微孔板。冷冻干燥仪(operatingmanualfreeze-dryeralpha1-4ldplus，德国，christ)；移液枪(eppendorfplus，量程为10μl、200μl、1ml、5ml，德国，eppendorf)；电子分析天平(cp124c，美国，ohaus)；研钵2.试剂配置(1)0.2％(w/v)蒽酮硫酸溶液，现配现用，精确称取蒽酮若干，加入500倍体积的浓硫酸既得，此试剂现配现用。注：蒽酮试剂应避免在强光下配置，配置完成后需避光放置，配置好的蒽酮试剂应为澄清透明的淡黄色溶液；实际操作过程中，较难精确称取特定毫克量的蒽酮，可通过实际称取的蒽酮质量计算得到浓硫酸的加入量，通过移液枪或瓶口分液器精确控制浓硫酸加入量即可。(2)30％(w/w)氢氧化钾溶液，称取氢氧化钾30g，加入70ml水即得。(3)1mg/ml的葡萄糖标准液3.样品处理(i)测定样品干重糖原含量待测液制备(1)取新鲜测样品冷冻干燥48h，实际操作中取适量样品于1.5mlep管中，方便批量干燥；(2)将样品研磨成粉末状，贝类肌肉组织较难研磨至粉末状，呈絮状即可，不影响后续消化过程；(3)称取18.0-22.0mg样品于10ml刻度试管中，记录具体取样量，移液枪精确加入1ml30％koh溶液；此步骤在实际操作过程中较难精确控制在20mg，可称取18.0-22.0mg之间，最后由待测液总体积算出实际的稀释倍数，以实际稀释倍数代入公式，以矫正因称取不准造成的误差；(4)盖上试管塞，防止溶液挥发，沸水浴消化30min，期间每隔3-5min摇晃试管使其消化完全，至澄清透明。贝类的外套膜和鳃难以消化的组织可适当延长消化时间至40min-60min；(5)消化完全后，用蒸馏水定容至5ml，摇匀，实际操作过程中，用移液枪精确加入4ml蒸馏水即可；(6)取1ml稀释后的消化液于ep管中，8000-12000g，室温离心8-10min，取上清液至于新ep管中，即为冻干样品待测液，可置于-80℃冰箱保存数周。也可以制备鲜样品待测液：(ii)测定样品鲜重糖原含量待测液制备(1)取新鲜待测样品，用滤纸吸干表面水分；(2)精确称取新鲜样品90-110mg，适当剪碎后置于10ml刻度试管中；(3)移液枪精确加入900μl30％koh溶液；后续步骤同上述(i)冻干样品待测液制备中(4)(5)(6)。4.标准曲线制作制作标准曲线时，葡萄糖标准液浓度范围应在0.01-0.28mg/ml之间，葡萄糖标准液浓度过高或过低均会影响吸光度的准确测定。(1)由1mg/ml葡萄糖标准液配置成如下浓度的葡萄糖溶液具体操作如下，此系列浓度可由1mg/ml葡萄糖标准液一次性配置，移液枪取1mg/ml葡萄糖200μl，加入600μl水吹打均匀得a浓度葡萄糖溶液，取a液400μl，加入100μl水吹打均匀得b液，取200μlb液加200μl水得c，依次类推可得d、e、f浓度葡萄糖标准液。(2)取7支1.5mlep管(其中一支为空白组)加入0.2％蒽酮硫酸试剂200μl，置于冰浴中；(3)移液枪沿管壁缓慢加入上述葡萄糖溶液100μl，切忌猛烈快速打入，反应体系瞬间放出大量热会使反应时间提前，造成误差；(4)设置空白对照，空白管加入100μl蒸馏水；(5)混匀后，精确沸水浴10min，取出流水冷却；(6)取200μl反应液于96孔板上，酶标仪在620nm处测定吸光值，绘制标准曲线。5.样品糖原含量测定(1)取ep管加入0.2％蒽酮硫酸试剂200μl，置于冰浴中；(2)沿着管壁缓慢加入90μl蒸馏水；(3)移液枪精确取10μl待测液打入上层蒸馏水相中；(4)混匀后，精确沸水浴10min，取出后流水冷却；(5)取200μl冷却后反应液于96孔板中，静置20-30min，利用酶标仪在620nm处测定吸光值；(6)根据标准曲线计算得到检测液中葡萄糖的相当含量c0，单位为mg/ml；(7)根据公式，c＝c0*(5ml/w)*10*0.9，计算可得样品糖原含量。其中c为样品糖原含量，单位为mg/g；c0为根据标准曲线计算得到检测液中葡萄糖的相当含量，单位为mg/ml；其中w为所取样品质量，单位为g；5ml为样品消化完成后最终定容时的体积，即待测液总体积；5ml/w为样品稀释倍数；10为待测液在测定过程中的稀释倍数；0.9为葡萄糖与糖原之间的转换系数，即100μg葡萄糖与蒽酮试剂显色相当于90μg糖原与蒽酮试剂显色。具体原理为糖原水解为葡萄糖需要一分子的h2o，相对分子质量为18，葡萄糖相对分子质量为180，糖原可视为由若干分子脱水葡萄糖组成，则糖原与葡萄糖之间的转换系数可得(180-18)/180＝0.9。实施例2相同牡蛎个体相同组织不同取样量糖原含量(干重)测定1.糖原待测液制备(1)取适量新鲜牡蛎闭壳肌、鳃、外套膜、肝胰腺、性腺、唇共6种组织置于1.5mlep管中(ep管中组织不应过多，1g以内为宜，防止冷冻干燥不完全)，使用冷冻干燥仪主干燥过程冷冻干燥48h；(2)将冻干后的样品研磨成粉末状，其中闭壳肌与外套膜较难研磨至粉末状，呈絮状即可；(3)分析天平称取两只牡蛎冷冻干燥后的组织18.0-22.0mg，称取量如下表1。表1.称取两只牡蛎冷冻干燥后的组织重量，单位为mg(2)将上述样品加入到10ml刻度试管中，移液枪精确加入1ml30％koh溶液；(4)盖上试管塞，防止溶液挥发，试管塞不应塞得过紧，防止因加热试管塞迸出发生危险，沸水浴消化30min，期间每隔5min摇晃试管使其消化完全，至澄清透明。其中外套膜和鳃两种组织消化时间为45min，至溶液澄清透明；(5)消化完全后，用移液枪精确加入4ml蒸馏水，摇匀；(6)取1.0ml稀释后的消化液于ep管中，8000g，室温离心10min，将上清液倒入新ep管中，即制成待测液，可置于-80℃冰箱保存。2.标准曲线制作(1)由1mg/ml葡萄糖标准液配置成如下表所示浓度的葡萄糖溶液(2)取7支1.5mlep管加入0.2％蒽酮硫酸试剂200μl，置于冰浴中；(3)移液枪沿管壁缓慢加入上述葡萄糖溶液100μl，切忌猛烈快速打入，瞬间放出大量热会使反应时间提前，造成误差；(4)设置空白组，空白组管加入100μl蒸馏水；(5)混匀后，精确沸水浴10min，取出流水冷却；(6)取200μl反应液于96孔酶标板上，酶标仪在620nm处测定吸光值，测定吸光度值如下表2所示，绘制标准曲线，如图1。表2.测定吸光度值如下表所示3.样品糖原含量测定(1)取1.5mlep管加入0.2％蒽酮硫酸试剂200μl，置于冰浴中；(2)沿着管壁缓慢加入90μl蒸馏水；(3)移液枪精确取10μl样品待测液打入上层蒸馏水相中，每管待测液测需做3次平行实验；(4)混匀后，精确沸水浴10min，取出后流水冷却；(5)取200μl反应液于96孔酶标板上，酶标仪在620nm处测定吸光值；(6)根据上述标准曲线计算得到检测液中葡萄糖的相当含量c0，单位为mg/ml。(7)根据公式，c＝c0*(5ml/w)*10*0.9，其中c为样品糖原含量，单位为mg/g；c0为根据标准曲线计算得到检测液中葡萄糖的相当含量，单位为mg/ml；w为样品干重，单位为g；5ml/w为待测液稀释倍数；10为待测样品在测定过程中的稀释倍数；0.9为葡萄糖与糖原之间的转换系数，即100μg葡萄糖与蒽酮试剂显色相当于90μg糖原与蒽酮试剂显色。(8)将每组织3次平行实验算得的糖原含量取平均值，最终得3次重复下不同组织糖原含量如下表3。表3.贝类样品不同个体和组织中的糖原含量，单位为mg/g(9)相同个体相同组织3次平行3组重复实验，分别计算所得的糖原含量做单因素方差分析如下表4。表4.糖原含量做单因素方差分析(10)结果分析由表3不难看出，相同个体相同组织不同重复实验所测得的糖原含量相差不大，由表4可以看出，相同个体相同组织中糖原含量数据方差分析，均有f<fcrit，且p-value>0.05，说明相同个体相同组织不同重复实验所测得的糖原含量无显著性差异，可以证明取样量在18.0-22.0mg之间，最终由公式进行计算糖原含量完全合理可行。实施例3不同显色剂与糖原检测液的比例对测定结果的影响其中0.2％蒽酮硫酸试剂即为显色剂，糖原检测液即在测定过程中稀释后的糖原待测液。(1)糖原待测液制备取牡蛎6种组织制备糖原待测液，具体步骤同上述实施例2中糖原待测液制备。(2)设置不同显色剂与糖原检测液的比例，反应体系各成分加入量如下表5。表5.不同显色剂与糖原检测液的比例(3)标准曲线制作不同反应体系应制作各自的标准曲线，具体步骤同上述实施例2中标准曲线制作。(4)糖原含量测定具体步骤同上述实施例2中样品糖原含量测定，各个成分的加入量参考(2)中表格，糖原含量的计算应用各自反应体系的标准曲线。(5)不同体系下所测得的糖原含量如下表6所示。表6.不同体系下所测得的糖原含量单位为mg/g(6)对200μl：100μl，2ml：1ml，400μl：200μl三种体系所测糖原含量做单因素方差分析表7.三种体系所测糖原含量做单因素方差分析方差分析闭壳肌鳃外套膜肝胰腺性腺唇f3.7411.4664.6651.1401.8843.254fcrit5.1435.1435.1435.1435.1435.143p-value0.0880.3030.0600.3800.2320.110(7)结果分析其中100μl：100μl体系无颜色反应，且会生成白色沉淀，证明此体系不可取；其中300μl：100μl，400μl：100μl两个反应体系虽有颜色反应，但最终反应体系呈现黑色，此两种体系亦不可取；由表7可以看出，200μl：100μl，2ml：1ml，400μl：200μl三种体系所测得的糖原含量无明显差异，单因素方差分析均有f<fcrit，且p-value>0.05，说明所测糖原含量无显著性差异，由此可以说明本发明中200μl：100μl体系合理可靠，400μl：200μl亦可适用，但考虑到节约性与操作的方便性，最终我们采取了200μl：100μl体系。当前第1页1 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技术特征：1.一种测定牡蛎组织中糖原含量的方法，所述方法包括样待测液的制备、制作标准曲线、样品糖原含量测定；其特征在于：
在所述待测液的制备中样品称取的步骤，称取18.0-22.0mg区间范围的任一质量的干重样品，如使用高精度分析天平精确到小数点后2位；
所述待测液的制备中离心的步骤为取0.8-1.2ml定容后的消化液于ep管中，8000-12000g，室温离心8-10min；
在所述待测液的制备中消化定容的方法中，用移液枪精确移取溶液；
在所述的制作标准曲线步骤中葡萄糖标准液浓度范围应在0.01-0.28mg/ml；
在所述制作标准曲线步骤中取1.5mlep管加入0.2％蒽酮硫酸试剂200μl，置于冰浴中，移液枪沿管壁缓慢分别加入不同浓度葡萄糖溶液100μl；
在所述样品糖原含量测定步骤中，取1.5mlep管加入0.2％蒽酮硫酸试剂200μl，置于冰浴中；沿着管壁缓慢加入90μl蒸馏水；然后移液枪精确取10μl待测液缓慢打入到溶液上层；在所述样品糖原含量测定步骤中，显色剂与检测液比例为200μl：100μl，共300μl；
在所述样品糖原含量测定步骤中精确沸水浴10min，取出后流水冷却；在所述样品糖原含量测定步骤中，通过如下公式计算可得样品糖原含量，c＝c0*(5ml/w)*10*0.9；
其中c为样品糖原含量，单位为mg/g；
c0为根据标准曲线计算得到检测液中葡萄糖的相当含量，单位为mg/ml；
其中w为所取样品质量，单位为g；
5ml为样品消化完成后最终定容时的体积，即待测液总体积；
5ml/w为样品的稀释倍数；
10为待测液在测定过程中的稀释倍数；
0.9为葡萄糖与糖原之间的转换系数，即100μg葡萄糖与蒽酮试剂显色相当于90μg糖原与蒽酮试剂显色。
2.权利要求1所述的一种测定牡蛎组织中糖原含量的方法，所述方法具体步骤如下：
1)待测液的制备
(i)测定样品干重糖原含量待测液制备
(1)取新鲜样品冷冻干燥48h，实际操作中取适量样品于1.5mlep管中，方便批量干燥；
(2)将样品研磨成粉末状，贝类肌肉组织较难研磨至粉末状，呈絮状即可，不影响后续消化过程；
(3)称取18.0-22.0mg样品于10ml刻度试管中，移液枪精确加入1ml30％koh溶液；
(4)盖上试管塞，防止溶液挥发，沸水浴消化，期间每隔3-5min摇晃试管使其消化完全，至澄清透明；
(5)消化完全后，用蒸馏水定容至5ml，摇匀，实际操作过程中，用移液枪精确加入4ml蒸馏水即可；
(6)取0.8-1.2ml稀释后的消化液于1.5mlep管中，8000-12000g，室温离心8-10min，取上清液至于新ep管中，即为冻干样品待测液，可置于-80℃冰箱保存数周；
或者(ii)测定样品鲜重糖原含量待测液制备
(1)取新鲜待测样品，用滤纸吸干表面水分；
(2)称取新鲜样品90.0-110.0mg，适当剪碎后置于10ml刻度试管中；
(3)移液枪精确加入900μl30％koh溶液；
后续步骤同上述(i)测定样品干重糖原含量待测液制备中的(4)(5)(6)；
2)标准曲线制作
制作标准曲线时，葡萄糖标准液浓度范围应在0.01-0.28mg/ml之间，葡萄糖标准液浓度过高或过低均会影响吸光度的准确测定；
(1)由1mg/ml葡萄糖标准液配置成如下浓度的葡萄糖溶液
(2)取7支1.5mlep管加入0.2％蒽酮硫酸试剂200μl，其中一支为空白对照，置于冰浴中；
(3)移液枪沿管壁缓慢加入上述葡萄糖溶液100μl，切忌猛烈快速打入，反应体系瞬间放出大量热会使反应时间提前，造成误差；
(4)设置空白组，空白组ep管中加入100μl蒸馏水；
(5)混匀后，精确沸水浴10min，取出流水冷却；
(6)取200μl反应液于96孔板上，酶标仪在620nm处测定吸光值，绘制标准曲线；
3)样品糖原含量测定
(1)取ep管加入0.2％蒽酮硫酸试剂200μl，置于冰浴中；
(2)沿着管壁缓慢加入90μl蒸馏水；
(3)移液枪精确取10μl待测液打入到溶液上层；
(4)混匀后，精确沸水浴10min，取出后流水冷却；
(5)取200μl冷却后反应液于96孔板中，静置20-30min，利用酶标仪在620nm处测定吸光值；
(6)根据标准曲线计算得到检测液中葡萄糖的相当含量c0，单位为mg/ml；
(7)根据公式，c＝c0*(5ml/w)*10*0.9，计算可得样品糖原含量；
其中c为样品糖原含量，单位为mg/g；
c0为根据标准曲线计算得到检测液中葡萄糖的相当含量，单位为mg/ml；
w为所取样品质量单位为g；
5ml为样品消化完成后最终定容时的体积，即待测液总体积；
5ml/w为样品稀释倍数；
10为待测液在测定过程中的稀释倍数；
0.9为葡萄糖与糖原之间的转换系数，即100μg葡萄糖与蒽酮试剂显色相当于90μg糖原与蒽酮试剂显色。
技术总结本发明提供了一种测定牡蛎组织中糖原含量的方法，属于动物组织中糖原含量测定领域，所述方法包括待测液的制备、制作标准曲线、样品糖原含量测定；在所述的样品称取步骤，称取18.0‑22.0mg区间范围的任一质量的干重样品，如使用高精度分析天平精确到小数点后2位；同时本发明构建了小反应体系下(300μL体系)蒽酮比色法测定糖原含量的整套操作流程。本发明方法取样简单，使用的化学试剂少，反应体系小，节省检测成本，同时降低了实验的危险性。
技术研发人员：陈夕;刘志鸿;吴彪;周丽青;孙秀俊;杨爱国
受保护的技术使用者：中国水产科学研究院黄海水产研究所
技术研发日：2020.03.19
技术公布日：2020.06.09
