技术领域：
本发明涉及荧光探针领域，具体涉及一类近红外荧光探针及其在检测谷胱甘肽硫转移酶中的应用。
背景技术：
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谷胱甘肽硫转移酶(gst)是多功能蛋白，其中最主要的一项功能就是作为ii期解毒酶广泛存在于原核生物及真核生物中。它主要分为三大类型，即胞浆型、线粒体型和微粒体型，其中胞浆型gst包括多种同工酶。人体中的胞浆型gst有七种——α，μ，π，σ，θ，ζ，ω——而其中α、μ、π是最重要的三种，即gsta、gstm、gstp。gst能催化谷胱甘肽(gsh)对外源性物质和内源性亲电体的亲核加成反应，生成的加合物随后会通过谷胱甘肽复合物转运蛋白被排出体外，从而达到解毒的效果。gst在很多癌细胞中会过表达，与化疗过程中癌细胞对药物的抗性密切相关。因此，发展能够监测哺乳动物肿瘤细胞中gst同工酶含量的高灵敏性探针是十分必要的。
荧光探针技术是有效检测gst的手段之一，因为该技术相对来说技术性要求并不高，易于实用化，而且检测灵敏度高。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、合成简单等优点。tetsuonagano等人公开了一种用于检测gst的荧光探针dnat-me(结构见图1，tetsuonaganoetal.，j.am.chem.soc.,2008,130,14533)，该探针经gst催化与gsh加合后因为对光致电子转移效应(pet)的抑制而使得荧光增强，从而能检测到gst的存在,但是该探针检测机制涉及的荧光性能严重依赖于环境的ph,从而在一定程度上限制了它的应用。于是后来yuutafujikawa等人针对这一问题又继续开发了对ph不敏感的荧光探针3,4-dnadcf(结构见图1，yuutafujikawaetal.，chem.commun.,2015,51,11459)。不过，上述两种探针都只对p亚型gst有特异性响应，而在实际应用中有时需要对各种同工酶具有广谱性响应的荧光探针。因而ralfmorgenstern等人公开了一种用于检测各种gst同工酶的近红外荧光探针dns-cv(结构见图1，ralfmorgensternetal.，j.am.chem.soc.,2011,133,14109)，然而该探针在没有gst的催化作用下依然能与gsh发生一定程度的非酶促反应而产生较大的背景噪音。
我们最近研发了一类以萘酰亚胺为荧光母体的双光子荧光探针，然而，虽然这种荧光探针已然具备较高的灵敏度和信噪比，但其在检测过程中产生的荧光不属于近红外波段，因而导致其生物穿透性不理想，难以用于活体成像，因此，开发高灵敏度和信噪比、兼具近红外激发和近红外荧光的、可用于生物体外水环境及生物样品如活体肿瘤中各种gst同工酶检测的荧光探针具有重要意义。
技术实现要素：
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本发明就是针对上述问题，提供了一种可用于近红外荧光检测生物体外水环境及生物样品如活体肿瘤中的各种gst同工酶的荧光探针，此探针可以在生理条件下经gst催化而被gsh加合，所得产物荧光强度相对于原探针显著增强，而且探针与gsh加合产物所发出的荧光属于近红外波段，因而具有较强的生物穿透性。
本发明采用如下技术方案：在具有近红外吸收和发光性能的荧光母体上引入优化后的硝基苯结构作为与谷胱甘肽硫转移酶识别及反应的活性中心，利用反应物与产物的荧光强度差别，实现近红外荧光检测谷胱甘肽硫转移酶。所述荧光探针的通式为：
通式ⅰ中，r1、r2、r5、r6、r7为h、烷基、芳基或含杂原子的取代基，r3、r4为o或n原子。
通式ⅰ中r1、r2、r5、r6、r7为烷基、芳基时，为c1～c20的烷基、芳基，优选为c1～c10的烷基、芳基；r1、r2、r5为含杂原子的取代基时，为磺酸基、羧基、羟基、氨基、胺基、卤素、烷氧基、氰基或硝基；r6、r7为含杂原子的取代基时，为卤代甲基、卤素、磺酸基、羧基、羟基、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基。
对通式i表示的化合物采用近红外光激发用于检测生物体外水环境及生物样品如人癌细胞或肿瘤中的谷胱甘肽硫转移酶，经酶作用后生成具有通式ii结构的化合物，从而导致产生强度大且穿透性强的近红外荧光，此过程可实现对谷胱甘肽硫转移酶的近红外荧光检测。
通式ii中，r1、r2、r5为h、烷基、芳基或含杂原子的取代基，r3为o或n原子，r4为-oh、-o-或nh2。
通式ii中，r1、r2、r5为烷基、芳基时，一般为c1～c20，最佳为c1～c10；r1、r2、r5为含杂原子的取代基时，为含有磺酸基、羧基、羟基、卤素、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基的取代基。
本发明的有益效果：
本发明将硝基氟苯类化合物与亚硫酸钠在水醇混合溶剂中发生的芳香亲核取代(snar)反应制得优化后的识别基团骨架，再与具有近红外荧光性能的半花菁荧光母体进行连接来制备所需的荧光探针，该荧光探针在各种gst同工酶存在下荧光强度均发生显著增强，由于发出的荧光属于近红外波段，因而更容易穿透生物样品，减少背景荧光对检测结果的影响，能够高灵敏性地检测生物体外水环境及生物样品如人癌细胞及活体肿瘤中的各种gst同工酶，这对于深入研究gst在生物体内的生理和病理作用具有重要意义。
附图说明：
图1背景技术中所举的已公开的用于检测gst的荧光探针；
图2实施例1～4中合成荧光探针hcyn的流程图；
图3实施例5中荧光探针hcyf对提取自肝脏的gst的荧光光谱响应；
图4实施例6中荧光探针hcyg对各种gst同工酶的酶促响应曲线；
图5实施例7中荧光探针hcyg对人癌细胞中gst的检测
图6实施例8中荧光探针hcyf对异种移植活体肿瘤中gst的检测成像
具体实施方式：
实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。
实施例1探针hcyn识别基团对应的硝基氟苯化合物的合成：
在1000ml三口烧瓶中加入6.25g(30mmol)1,5-二氟-2,4-二硝基苯和300ml甲醇，0℃下逐滴加入15ml质量浓度10％koh溶液。开动搅拌器，室温下搅拌48h，过滤，水洗，干燥，得淡黄色固体5.45g，即为hcyn识别基团对应的硝基氟苯化合物，产率84％。
实施例2探针hcyn识别基团对应的带有磺酸基的硝基化合物的合成：
在500ml三口烧瓶中加入90mmolhcyn识别基团对应的硝基氟苯化合物、150ml乙醇、20ml甲醇，加热得透明溶液，另用105ml水溶解14.22g亚硫酸钠并向其中加入60ml乙醇得到悬浊液，将该悬浊液加入到前述溶液中，75℃下搅拌回流20h，反应冷至室温后旋干得黄白色固体。
实施例3探针hcyn识别基团的合成：
向100ml三口烧瓶中加入5mmolhcyn识别基团对应的带有磺酸基的硝基化合物和50mmol氯化亚砜，80℃搅拌4h，旋干得探针hcyn的识别基团。
实施例4探针hcyn的合成：
在100ml三口烧瓶中加入0.2g(0.38mmol)半花菁和0.18g(0.55mmol)碳酸铯，氮气保护下加入15ml二氯甲烷，冷至0℃，逐滴加入溶于10ml二氯甲烷中的hcyn识别基团，逐渐升至室温，搅拌1.5h，旋干，上样，过硅胶柱，洗脱剂为甲醇：二氯甲烷＝6:500～12:500，旋干，得深蓝色固体0.222g，即为探针hcyn(通过核磁和紫外检测确定化合物的结构)。
实施例5探针hcyf对提取自肝脏的gst的荧光光谱响应：
图3所示，在终体积为200μl的酶标板小孔里含有终浓度为20μm的hcyf、1mmgsh和0.0125mg/ml的提取自肝脏的gst，缓冲液为ph7.4的hepes，用酶标仪检测1h内荧光光谱的变化，可以看出随着时间的推移，荧光强度明显增强，因而探针nif可以实现对gst的荧光检测。
实施例6探针hcyg对各种gst同工酶的酶促响应曲线：
图4所示，同实施例5的过程，不同之处在于通过改变hcyg的浓度，可以测得hcyg对a、m、p亚型的gst的米氏方程曲线，由此可知hcyg对各种gst同工酶均有荧光响应。
实施例7探针hcyg对人癌细胞中gst的检测
图5所示，用10μmhcyg分别孵育富含gst的肝癌细胞hepg2、肺癌细胞a549、宫颈癌细胞hela以及阴性对照细胞mhcc97l细胞30min，并用荧光共聚焦显微镜(激发波长为633nm)观察，荧光收集通道为700-800nm，可以看出含有gst的阳性细胞均产生了强烈的荧光，而阴性对照细胞荧光很微弱，从而证明了hcyg可以检测人癌细胞中的gst。
实施例8探针hcyf对异种移植活体肿瘤中gst的检测
将人肝癌细胞hepg2异种移植到小鼠腋下(左右)，成瘤后左侧瘤内注射100μl浓度为20μm的荧光探针hcyf，右侧注射100μlph7.4的hepes缓冲溶液，10min后可以明显地看到注射荧光探针的一侧肿瘤发出了强烈的红色荧光。
结论：由以上附图和实施例可见，本发明在具有近红外吸收和发光性能的荧光母体上引入优化后的硝基苯结构作为与谷胱甘肽硫转移酶识别及反应的活性中心，利用反应物与产物的荧光强度差别，实现近红外荧光检测谷胱甘肽硫转移酶，同时由于发出的荧光也属于近红外波段，故穿透性和信噪比得到增强而增加了其实用性。
1.一种近红外荧光探针，其特征在于：所述荧光探针的结构如通式ⅰ所示：
通式ⅰ中，r1、r2、r5、r6、r7分别为h、烷基、芳基或含杂原子的取代基，r3、r4为o或n原子；
r1为h、烷基、芳基或含杂原子的取代基中的一种、二种、三种或四种，个数为1-4个；
r6、r7分别为h、烷基、芳基或含杂原子的取代基中的一种或二种，个数为1-2个。
2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：所述的通式ⅰ中r1、r2、r5、r6、r7分别为烷基、芳基时，为c1～c20的烷基、芳基，优选为c1～c10的烷基、芳基；
r1、r2、r5分别为含杂原子的取代基时，为磺酸基、羧基、羟基、氨基、胺基、卤素、烷氧基、氰基或硝基；r6、r7分别为含杂原子的取代基时，为卤代甲基、卤素、磺酸基、羧基、羟基、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基。
3.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：具有如下结构的化合物hcyf、hcyg、hcyh、hcyi、hcyl、hcyn中的一种或二种以上；
4.一种权利要求1、2或3所述的荧光探针在检测水环境或生物样品中的谷胱甘肽硫转移酶过程中的应用。
5.根据权利要求4所述的荧光探针的应用，其特征在于，对通式i表示的化合物采用近红外光激发用于检测生物体外水环境及生物样品(如人癌细胞或活体肿瘤)中的谷胱甘肽硫转移酶，经酶作用后生成具有通式ii结构的化合物，从而导致产生强度大且穿透性强的近红外荧光，此过程可实现对谷胱甘肽硫转移酶的近红外荧光检测；
通式ii中，r1、r2、r5为h、烷基、芳基或含杂原子的取代基，r3为o或n原子，r4为-oh、-o-或nh2。
6.根据权利要求5所述的荧光探针的应用，其特征在于，r1、r2、r5分别为烷基、芳基时，一般为c1～c20，最佳为c1～c10；r1、r2、r5分别为含杂原子的取代基时，为含有磺酸基、羧基、羟基、卤素、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基的取代基。
7.根据权利要求5所述的荧光探针的应用，其特征在于，荧光探针具有如下结构的化合物hcyf、hcyg、hcyh、hcyi、hcyl、hcyn中的一种或二种以上，均可用于存在于模拟生理环境(ph为7.4的hepes缓冲溶液)中的谷胱甘肽硫转移酶的检测，生成半花菁，在ph为7.4时，有一部分半花菁的羟基会脱去质子；
8.根据权利要求4-7任一所述的荧光探针应用，其特征在于，用于近红外荧光检测谷胱甘肽硫转移酶，谷胱甘肽硫转移酶的测定包括以下工序：
(a)使具有通式i结构的化合物与谷胱甘肽硫转移酶反应；
(b)测定由上述工序中的反应引起的荧光强度变化。
技术总结