本发明涉及一种基于cas14a酶的rna检测方法，其特征在于：可用于生物分析领域。
背景技术：
crispr（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）被称为规律成簇间隔短回文重复，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统[1]。目前发现的crispr相关联crispr-cas系统效应蛋白分为两大类[2]。其中cas9与tracrrna、引导crrna组成效应复合物切割靶dna[3]；cas12a不需要tracrrna，其单独使用crrna作为指导，向目标双链dna中引入交错切割，一旦切割靶标，cas12a的附带切割活性即可被激活，可以切割ttatt序列的dna单链[4]；cas13a是rna引导的rna酶，一旦rna靶标与sgrna相结合，cas13a的“附带切割”活性即可被激活成为非特异性的rnase[5]。基于这种激活附带切割的性能，crispr-cas系统被广泛应用于dna、rna和病原微生物的检测。crispr-cas14酶是近期发现的一种新的crispr-cas家族的蛋白,其分子量较小，具有靶向切割dna的活性，本发明能够相应的提供一种rna激活cas14a“附带切割”活性实现对rna的检测，对生物分析领域具有重要意义；
[1]jackson,s.a.;mckenzie,r.e.;fagerlund,r.d.;kieper,s.n.;fineran,p.c.;brouns,s.j.,crispr-cas:adaptingtochange.science2017,356(6333).
[2]shmakov,s.;smargon,a.;scott,d.;cox,d.;pyzocha,n.;yan,w.;abudayyeh,o.o.;gootenberg,j.s.;makarova,k.s.;wolf,y.i.;severinov,k.;zhang,f.;koonin,e.v.,diversityandevolutionofclass2crispr-cassystems.natrevmicrobiol2017,15(3),169-182.
[3]chen,j.s.;doudna,j.a.,thechemistryofcas9anditscrisprcolleagues.naturereviewschemistry2017,1(10).
[4]maxa.english;luisr.soenksen;raphaelv.gayet;helenadepuig;nicolaasm.angenent-mari;angelos.mao2;peterq.nguyen;collins,j.j.,programmablecrispr-responsivesmartmaterials.science2019.
[5]abudayyeh,o.o.;gootenberg,j.s.;essletzbichler,p.;han,s.;joung,j.;belanto,j.j.;verdine,v.;cox,d.b.t.;kellner,m.j.;regev,a.;lander,e.s.;voytas,d.f.;ting,a.y.;zhang,f.,rnatargetingwithcrispr–cas13.nature2017,550(7675),280-284。
技术实现要素：
本发明的目的是针对crispr-cas系统检测rna存在的问题，提供一种基于cas14a酶的rna检测方法，为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
向含有单链引导rna(sgrna)-cas14a复合体和单链dna荧光猝灭探针(f-ssdna-q)的溶液中加入待检测rna,以荧光信号变化强度实现对rna的定量与定性分析；所述sgrna-cas14a复合体的制备方法为混合sgrna和cas14a酶，在0-60oc混合孵育0-300分钟；所述sgrna浓度为0-100mm；所述cas14a的浓度为0-100mm；所述sgrna的序列为:uucacugauaaaguggagaaccgcuucaccaaaagcugucccuuaggggauuagaacuugagugaaggugggcugcuugcaucagccuaaugucgagaagugcuuucuucggaaaguaacccucgaaacaaauucauuugaaagaauaaggaaugcaac 间隔序列；所述单链dna荧光猝灭探针(f-ssdna-q)的序列为f-(t)n-q(n≥5),如n=5，序列长度为f-ttttt-q；所述间隔序列为含有与待检测rna互补5-40bp长度的序列。
附图说明
图1不同种类microrna的荧光强度柱状图；
图2不同浓度mirna-221的荧光强度柱状图；
图3标准曲线。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明作进一步说明，有助于本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明；
实施例1：
单链引导rna(sgrna)-cas14a复合体的制备：将500nmsgrna、500nmcas14a和100nmfq探针在25mmnacl,20mmtris-hcl,1mmdtt和10mmmgcl2混合均匀后与30oc孵育30分钟；
sgrna序列（红色下划线区为间隔序列）：uucacugauaaaguggagaaccgcuucaccaaaagcugucccuuaggggauuagaacuugagugaaggugggcugcuugcaucagccuaaugucgagaagugcuuucuucggaaaguaacccucgaaacaaauucauuugaaagaauaaggaaugcaaccaacaucagucugauaacu
fq探针序列：fam-tttttttttttt-bhq1
实施例2：
rna定性分析：将100nm的microrna-221和microrna-145加入实施例1中孵育好的sgrna-cas14和fq溶液中，在96孔板中进行荧光检测，以荧光信号变化实现对相应rna的定性检测，以水代替rna作为空白对照组,,每组实验重复三次（参见图1）；
microrna-221序列：uagcuuaucagacugauguuga
microrna-145序列：guccaguuuucccaggaaucccu
由图1可知，含有microrna-221的实验组荧光信号剧烈增强，而micorrna-145和空白对照组荧光信号没有变化，这表明该方法可以用于rna的定性分析；
实施例3：
rna定量分析：将不同浓度的microrna-221入实施例1中孵育好的sgrna-cas14和fq溶液中，在96孔板中进行荧光检测，通过不同浓度microrna对应的荧光强度实现对相应rna定性分析（参见图2和图3）；
由图2可知，随着microrna-221浓度的增加，荧光信号逐步增强，由图3可知，micorrna-221浓度的对数值和荧光信号值呈现出很好的线性关系，r2=0.99721，这表明该方法可用于rna的定量分析。
1.一种基于cas14a酶的rna检测方法，其特征在于：向含有单链引导rna(sgrna)-cas14a复合体和单链dna荧光猝灭探针(f-ssdna-q)的溶液中加入待检测rna,以荧光信号变化强度实现对rna的定量与定性分析。
2.按权利要求1所述的一种基于cas14a酶的rna检测方法，其特征在于：所述sgrna-cas14a复合体的制备方法为混合sgrna和cas14a酶，在0-60oc混合孵育0-300分钟。
3.按权利要求1所述的一种基于cas14a酶的rna检测方法，其特征在于：所述sgrna浓度为0-100mm；所述cas14a的浓度为0-100mm。
4.按照权利1所述一种rna激活crispr-cas14a酶附带切割效应的方法，其特征在于：所述sgrna的序列为ttcactgataaagtggagaaccgcttcaccaaaagctgtcccttaggggattagaacttgagtgaaggtgggctgcttgcatcagcctaatgtcgagaagtgctttcttcggaaagtaaccctcgaaacaaattcatttgaaagaatgaaggaatgcaac 间隔序列。
5.按照权利1所述一种rna激活crispr-cas14a酶附带切割效应的方法，其特征在于：所述单链dna荧光猝灭探针(f-ssdna-q)的序列为f-（t）n-q(n≥5),如n=5，序列长度为f-ttttt-q。
6.按照权利5所述sgrna序列，其特征在于：间隔序列为含有与待检测rna互补5-40bp长度的序列。
技术总结