本发明属于生物化工领域，具体涉及一种微流控双水相固定化酶催化改性桑椹红色素的装置及方法
背景技术：
桑椹中含有丰富的桑椹红色素，是我国正式批准的48种天然色素之一。桑椹红色素主要含有矢车菊-3-o-葡萄糖苷(cyanidin-3-o-glucoside，c3g)、矢车菊-3-o-芸香糖苷(cyanidin3-o-rutinoside，c3r)、矢车菊-3-o-半乳糖苷和矢车菊-7-葡萄糖苷等四种花色苷和少量的天竺葵色素、飞燕草素等成分(cancerletters,2006,235(2):248-59)。其中，c3r和c3g是桑椹红色素的主要成分，分别约占总量的60％和30％(foodchemistry,2015,171:128-136)。研究表明c3g具有很强的生理功能。c3g作为一种天然抗氧化剂，可以预防和改善糖尿病大鼠的心血管并发症(saudijournalofbiologicalscience,2016,25(3):500-506)。此外，蓝莓中的c3g可以和酸奶中的血管紧张素转化酶(ace)产生协同作用，显着降低肥胖小鼠的体重和高血压(journaloffunctionalfoods,2019,56:92-101)。由于桑椹红色素具有上述诸多的活性功效，目前对桑椹红色素的萃取方法已有诸多报道。如：溶剂提取法(cn101531825)，使用重量比为1.5-5‰的柠檬酸水溶液在30-50℃下浸泡粉碎的桑椹30-180min获得提取液，经过滤、吸附、洗脱、浓缩，制得桑椹红色素，提取率达89％；双水相萃取法(cn107739359a)，使用30-35wt％的乙醇、20-25wt％的硫酸铵、1.8-2.2wt％的氯化钠与余量的水组成双水相体系，在3000-6000r/min的转速下离心10-15min，静置萃取，原花青素提取率达90％以上。但是这些方法仅是对桑椹红色素整体进行萃取，而桑椹红色素中更具有活性功效的c3g的纯度并没有增加。市面上1mg，纯度90％的c3g标准品的价值1500元以上，价格非常昂贵。因此，有必要寻找一种简单有效的方法进一步提高c3g在桑椹红色素中的纯度。c3g和c3r仅相差一个鼠李糖苷键，若采用糖苷酶定向水解c3r的鼠李糖基，可以将c3r特异性转化为c3g，以提高桑椹红色素中c3g的含量，使其含量接近甚至超过90％。
为了给酶催化提供合适的反应环境，本文使用微流控双水相体系(microfluidicaqueoustwo-phasesystem,matps)将c3r定向转化为c3g。matps是在微环境下由两种互不相溶的亲水性液体组成的体系(advancedhealthcarematerials,2017,7:1701036)。近年来，已在多个领域得到了大量的研究和应用。matps可以调节两相流速，实现对反应分离耦合的精确控制。专利cn105112293a公开了一种微流控双水相平行层流酶促反应技术，在双y形微装置中以peg/dex为载体，分离牛血清白蛋白(bsa)，其反应速率和转化率都比常规反应器高500倍。matps还具有比表面积大、传质效率高及反应速率快等优点。cn102179064a公开了一种微流控双水相环隙流萃取技术及装置，仅需21.21秒就可以实现71.1％的回收率，效率远高于烧杯实验。然而，在matps内进行生物转化过程中，亲水性有机相的存在可能会抑制游离酶的活性甚至使其变性失活。考虑到固定化酶具有提高酶的稳定性，可重复使用，从而降低反应成本，减少环境污染等的优点(cn101689638a)，本文使用固定化酶代替游离酶，构建了一种新型的微流控双水相固定化酶催化体系。这种新型的酶催化体系提供了一个全水、微尺度的反应分离耦合平台，可用于强化酶催化反应，便于回收再利用，是个新颖的生物制造过程，进一步丰富了微流控装置类型。
申请人在先前的研究中(cn105969826b)公开了一种微反应器专用纳米粒子固定化酶合成异槲皮苷的方法，与常规反应器相比，异槲皮苷产量增加2.1倍，固定化酶可重复使用6次，且酶活保持在50％以上。在此基础上，将微流控体系与固定化酶结合，集成的微流控固定化酶催化体系具有良好的催化效果，有利于连续的工业化生产。然而，目前尚无关于在微流控双水相体系内使用固定化酶催化改性桑椹红色素的报道。因此，本专利首次在微流控双水相体系内使用固定化酶催化改性桑椹红色素，有望在短时间内提高c3g纯度，且固定化酶可重复使用，符合绿色化学和资源利用理念。
技术实现要素：
解决的技术问题：本发明针对上述问题，本发明提供一种微流控双水相固定化酶催化改性桑椹红色素的装置及方法，设计并构建了一种双y型的平行流微流控反应器分离纯化桑椹红色素，短时间内制备了高纯度c3g的新型高品质的桑椹红色素。
技术方案：一种微流控双水相固定化酶催化改性桑椹红色素的装置，所述装置由输送系统、反应系统及收集系统三个部分组成；所述输送系统由两台恒流泵组成，反应系统为双y型微流控芯片装置，收集系统由两个离心管组成；所述双y型微流控芯片装置的中间设有主通道，主通道长为2-5cm，宽为200-800μm，主通道的两端分别设有y分支，y分支的长度为7mm，宽度为100-400μm，深度为50-200μm；两台恒流泵分别通过聚四氟乙烯管与主通道一端y分支的进样口连接，两个离心管分别通过聚四氟乙烯管与主通道另一端y分支的取样口连接。
利用所述装置进行微流控双水相固定化酶体系催化改性桑椹红色素的方法，通过两恒流泵调节两相流速，在主通道接触形成双水相，进行酶促反应，在双y分支通道末端分离；分别收集反应后的溶液；该方法使用15-30wt.％的乙醇，15-25wt.％的硫酸铵和45-70wt.％的水作为双水相，调整两相流速，当硫酸铵流速为13-18μl/min，乙醇流速为8-13μl/min时，在温度为30-50℃、ph为3-5、底物浓度为0.002-0.015mg/ml的条件下，反应分离纯化桑椹红色素；所述酶为固定化α-l-鼠李糖苷酶。
上述α-l-鼠李糖苷酶固定于多壁碳纳米管上。
优选的，上述中间主通道长为3.5cm、宽为600μm，双y分支的长度为7mm、宽度为300μm，深度均为150μm。
优选的，上述进样口之一通入18wt.％硫酸铵和多壁碳纳米管固定化α-l-鼠李糖苷酶，另一进样口通入27wt.％乙醇和0.008mg/ml桑椹汁底物；在硫酸铵相流速为14.5μl/min，乙醇相流速为10μl/min，温度45℃，ph5条件下反应8.59s。
有益效果：本发明采用了天然来源的桑椹汁为主要原料，使用微流控双水相固定化酶体系，制备高纯度c3g的新型高品质的桑椹红色素。自行设计并构建了一种双y型的平行流微流控反应器分离纯化桑椹红色素，短时间内实现了单一组分c3g的富集，大大提高了回收率；添加固定化酶，提高酶稳定性的同时实现了固定化酶的多次重复利用。两者相辅相成，生成过程速度快，对环境友好，无污染，成本低，回收率高，产物的水溶性与着色性能好，易于工业化应用，具有非常广阔的市场前景。经微流控双水相固定化酶体系分离纯化后，c3g的回收率有望接近或超过90％。
附图说明
图1为本发明反应结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本实施例中使用检测桑椹色素的测定方法为高效液相色谱法，色谱条件：alltimac18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：12％乙腈-5％乙酸-1％磷酸(55:25:5，v/v/v)；检测波长：513nm；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；进样量：20μl。
其中，高效液相色谱检测到两种桑色素，包括矢车菊素-3-o-葡萄糖苷(c3g)和矢车菊素-3-o-芸香糖苷(c3r)。
c3r转化率的计算方法为：
c3g纯度的计算方法为：
其中：c、c0—反应前、后反应物的浓度(mg/ml)
v、v0—反应前、后反应物的体积(ml)
m—c3r的摩尔质量
mc3g、m总—c3g、总色素冻干后的质量(mg)
实施例1
一种双y型的平行流微流控反应装置，该反应装置由输送系统、反应系统及收集系统三个部分组成；所述输送系统由两台恒流泵组成，反应系统为双y型微流控芯片装置，收集系统由两个离心管组成；所述双y型微流控芯片装置的中间设有主通道，主通道长为2-5cm，宽为200-800μm，主通道的两端分别设有y分支，y分支的长度为7mm，宽度为100-400μm，深度为50-200μm；两台恒流泵分别通过聚四氟乙烯管与主通道一端y分支的进样口连接，两个离心管分别通过聚四氟乙烯管与主通道另一端y分支的取样口连接。
实施例2
参照实施例1的装置结构，设计双y型微流控芯片装置并将其打印成光掩模，通过标准光刻、化学湿法刻蚀和常温键合技术反应将其制成微芯片。双y型微芯片尺寸如下：中间主通道长为3.5cm、宽为600μm，双y分支的长度为7mm、宽度为300μm，深度均为150μm。芯片制备好后，通过夹具、接头、垫圈、导管与恒流泵连接，构建微流控双水相操作系统。
进口a通入18wt.％硫酸铵和多壁碳纳米管固定化α-l-鼠李糖苷酶，进口b通入27wt.％乙醇和0.008mg/ml桑椹汁底物。在硫酸铵相流速为14.5μl/min，乙醇相流速为10μl/min，温度45℃，ph5条件下反应8.59s，在出口a，b处收集两相反应后溶液。使用hplc进行定量检测，计算c3r转化率和c3g纯度。经计算，c3r转化率为75.66±1.63％，c3g纯度为88.78±1.59％。
实施例3
设计双y型微流控芯片并将其打印成光掩模，通过标准光刻、化学湿法刻蚀和常温键合技术反应将其制成微芯片。双y型微芯片尺寸如下：中间主通道长为5cm、宽为800μm，双y分支的长度为7mm、宽度为400μm，深度均为200μm。芯片制备好后，通过夹具、接头、垫圈、导管与恒流泵连接，构建微流控双水相操作系统。
进口a通入25wt.％硫酸铵和单壁碳纳米管固定化酶，进口b通入30wt.％乙醇和0.015mg/ml桑椹汁底物。在硫酸铵相流速为18μl/min，乙醇相流速为12.5μl/min，温度50℃，ph4.5条件下反应7.46s，在出口a，b处收集两相反应后溶液。使用hplc进行定量检测，计算c3r转化率和c3g纯度。经计算，c3r转化率为51.29±1.22％，c3g纯度为74.69±2.03％。
实施例4
设计双y型微流控芯片并将其打印成光掩模，通过标准光刻、化学湿法刻蚀和常温键合技术反应将其制成微芯片。双y型微芯片尺寸如下：中间主通道长为3cm、宽为400μm，双y分支的长度为7mm、宽度为200μm，深度均为50μm。芯片制备好后，通过夹具、接头、垫圈、导管与恒流泵连接，构建微流控双水相操作系统。
进口a通入15wt.％硫酸铵和石墨烯固定化酶，进口b通入15wt.％乙醇和0.003mg/ml桑椹汁底物。在硫酸铵相流速为13.5μl/min，乙醇相流速为8μl/min，温度30℃，ph3.5条件下反应10.50s，在出口a，b处收集两相反应后溶液。使用hplc进行定量检测，计算c3r转化率和c3g纯度。经计算，c3r转化率为39.98±1.41％，c3g纯度为60.29±1.87％。
1.一种微流控双水相固定化酶催化改性桑椹红色素的装置，其特征在于所述装置由输送系统、反应系统及收集系统三个部分组成；所述输送系统由两台恒流泵组成，反应系统为双y型微流控芯片装置，收集系统由两个离心管组成；所述双y型微流控芯片装置的中间设有主通道，主通道长为2-5cm，宽为200-800µm，主通道的两端分别设有y分支，y分支的长度为7mm，宽度为100-400µm，深度为50-200µm；两台恒流泵分别通过聚四氟乙烯管与主通道一端y分支的进样口连接，两个离心管分别通过聚四氟乙烯管与主通道另一端y分支的取样口连接。
2.利用权利要求1所述装置进行微流控双水相固定化酶体系催化改性桑椹红色素的方法，其特征在于通过两恒流泵调节两相流速，在主通道接触形成双水相，进行酶促反应，在双y分支通道末端分离；分别收集反应后的溶液；该方法使用15-30wt.%的乙醇，15-25wt.%的硫酸铵和45-70wt.%的水作为双水相，调整两相流速，当硫酸铵流速为13-18µl/min，乙醇流速为8-13µl/min时，在温度为30-50℃、ph为3-5、底物浓度为0.002-0.015mg/ml的条件下，反应分离纯化桑椹红色素；所述酶为固定化α-l-鼠李糖苷酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述α-l-鼠李糖苷酶固定于多壁碳纳米管上。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述中间主通道长为3.5cm、宽为600µm，双y分支的长度为7mm、宽度为300µm，深度均为150µm。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述进样口之一通入18wt.%硫酸铵和多壁碳纳米管固定化α-l-鼠李糖苷酶，另一进样口通入27wt.%乙醇和0.008mg/ml桑椹汁底物；在硫酸铵相流速为14.5μl/min，乙醇相流速为10μl/min，温度45℃，ph5条件下反应8.59s。
技术总结