本发明属于生化检测、光谱分析领域，具体涉及基于纳米微结构、sers光谱分析的内毒素含量的技术。
技术背景
内毒素对药物治疗、药物生产和食品加工等过程的安全存在着巨大的威胁。对内毒素的高效检查和实时监测成为食品、药物生产及临床用药中必不可少的环节。目前细菌内毒素常见检测方法主要有家兔热源法（therabbitpyrogentest，rpt）、鲎试验法(limulusamoebocytelysateassays,lal)等传统方法，家兔热源法存在个体差异、灵敏度较低、检测时间较长等问题，而lal检测方法，虽然具有检测快速、简便、灵敏度较高等优点，但其对测试条件要求苛刻，结果易受到酶和杂质的影响。近年来发展起来的光、电化学传感器也是内毒素检测的研究热点，其大多是以适配体、结合蛋白、多粘菌素b（polymyxinb，pmb）等作为内毒素识受体与探针，以此实现内毒素的特异性识别和快速响应，再通过传感器将生物识别元件上的生物信号转换成荧光、化学发光、电信号等完成内毒素的检测。然而，这类方法受到适配体、结合蛋白等内毒素识别模式的限制，整个检测时间往往需要数十分钟乃至数小时，难以做到样本中内毒素含量的实时快速监测；同时，其采用传统反应容器，对待测样本的体积有一定要求（通常为几百μl至几ml），难以满足微量样本的检测需求。
sers检测技术因其响应光谱信号的信息丰富、水份干扰小、检测时间短、样本用量少等优势，对生化样本的快速、无损和实时监测具有突出优势。近年来，sers标签的研发和利用，使得sers光谱技术不仅可以在分子水平实现生化样本的高效鉴别，同时还能进一步提高sers定量检测灵敏度，更是使得待测生化样本的特异性识别与高效监测成为可能。目前，针对内毒素的sers光谱鉴别相关研究极少，特别是多种生化体系中的内毒素快速定量检测几近空白。
基于此，本专利针对生化样本中内毒素的定量难题，提出
技术实现要素：
针对生化样本检验中重要指标内毒素检测面临的瓶颈和难题，本发明提出一种阵列式三维仿生纳米结构芯片、具有该芯片的检测系统、系统的用途，以及内毒素快速高效定量检测新方法。本发明将蝉翅作为天然sers模板，并将其集成在阵列式三维sers芯片中，进一步结合金属纳米粒子与适配体修饰的复合式sers标签，解决内毒素本身拉曼信号较弱的缺陷，建立内毒素快速高效检测系统与方法，可实现注射液等生物制剂中内毒素的快速定量检测，也可应用于监测细菌与抗菌药物作用后内毒素含量的变化。
本发明技术方案如下：
本发明的目的之一是提出一种阵列式三维sers仿生纳米微结构芯片，该芯片是将蝉翅作为仿生sers模板，以离子溅射方式在其表面溅射上一层金膜作为sers基底，将其集成在阵列式微米培养腔内，用于生物制剂中内毒素含量的高效检测，细菌与抗菌药物作用后内毒素含量监测，以及血液中细菌原位培养并实时检测内毒素。
所述仿生纳米微结构芯片的具体结构包括以载玻片为衬底粘贴具有阵列小孔的亚历克板形成的阵列式三维sers纳米仿生基底，对位并键合在基底上的pdms打孔层，以及键合在pdms打孔层之上的pdms盖片层与培养基补充层，其中由阵列小孔和对应的pdms打孔层上的孔共同形成的阵列孔就形成所述的阵列式微米培养腔，溅射有金膜的蝉翅粘贴在每个微米培养腔内。
本发明进一步提出一种内毒素检测系统，其包括上述芯片和sers标签。所述sers标签是由核酸适配体修饰的sers标签，所述核酸适配体是氨基或羧基修饰的核酸适配体，所述核酸适配体与拉曼报告分子上的活性基团连接构成sers标签。
具体地，所述sers标签是通过如下方式获得：
利用1,6-己二胺作(1,6-hexamethylenediamine,hmd)为交联剂，将银纳米颗粒制成银纳米粒子二聚体，作为sers增强材料与载体；
通过ag-s键连接带巯基的拉曼报告分子；
加入氨基或是羧基修饰的核酸适配体与拉曼报告分子上的活性基团连接；所述拉曼报告分子包括4-巯基苯甲酸（4-mba）和对氨基苯硫酚（ptap）等。
所述核酸适配体所述核酸适配体选自广谱型内毒素核酸适配体，cttctgcccgcctccttccaccgatccatcgagtttctgagaaaggcccggagaaaccgcgagaggagacgagataggcggacact及ataggagtcacgacgaccagccttctaacagaatgttgttgttagatagctttgaagctggtctatgtgcgtctacctcttga；对绿脓杆菌产的内毒素有着更好特异性的ccttctaacagaatgttgttagatagc；对鼠伤寒沙门氏菌产内毒素有着更好特异性的ataggagtcacgacgacgaccaggggttgtagtaactgacacggcgagaaccaacgcctgggctatgtgcgtctacctcttga，aatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaaga及aatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaagaaatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaaga；对副溶血性弧菌产内毒素有着更好特异性的ctaaaaatgggcaaagaaacagtgactcgttga；对大肠杆菌产内毒素有着更好特异性的ccgaagcttgggagccaacaccacaatcaa及ccgaagcttgggagcca等适配体。
经巯基化的聚乙二醇表面封闭，制成内毒素检测用sers标签。
所述内毒素检测系统用于生物制剂中内毒素含量的检测，用于细菌与抗菌药物作用后内毒素含量监测，以及血液中细菌原位培养并实时检测内毒素。
本发明还提供一种内毒素检测方法，所述方法包括：
将梯度浓度的内毒素标准品加入到上述的阵列式三维sers纳米仿生微结构芯片中，并加入sers标签，结合时间控制在10-600s内；
通过移动阵列式三维sers纳米仿生微结构芯片使得入射光斑恰好在每个检测腔中，采集结合内毒素前后样本的sers光谱，根据峰强比变化(如以ptap为拉曼报告分子，dmso为检测内标，发生明显变化的为i636/i671)确定结合时间，并建立内毒素浓度与峰强比的标准曲线；
在待测样本或反应体系中加入sers标签，在确定的反应时间后采集sers光谱信号，根据所建立的标准曲线得出各个样本或是时间点的内毒素含量。
本发明的优点如下：
本发明的集成阵列式三维仿生sers微结构芯片构建了微量/痕量生化样本的sers原位检测腔，有效提高sers检测通量、灵敏度和重现性。本发明针对sers定量检测内毒素的空白，设计并利用mems加工技术制备获得了以蝉翅为天然模板的三维仿生的新型sers基底，该sers基底具有良好的均一性和检测重现性；将该三维仿生sers基底集成在sers芯片内，制成具有阵列结构的三维仿生sers微结构，由于培养微腔体积为微升级，腔体中样本相对集中，可缩短内毒素与核酸适配体的结合时间。
本发明的检测系统通过设计制备核酸适配体修饰的sers标签，可以特异性识别并检测内毒素，进一步提高sers检测灵敏度，实现的内毒素快速高效定量检测。
本发明中建立的内毒素毒定量检测新方法，不仅可用于待测样本中内毒素含量的高效、快速检测，结合发明的集成阵列式三维仿生sers微结构内阵列式检测/培养微腔，也可用于临床上生化样本中细菌的原位培养以及该过程中内毒素含量的快速检测，同时还可以监测抗菌药物与细菌的抑菌过程中内毒素释放情况，具有广泛的应用空间。
本发明的集成阵列式三维仿生sers微结构制备方法简单，无需复杂的仪器操作，可根据拉曼光谱仪入射光斑大小，相应地制备不同孔径的sers微结构，具有良好的重复性和可操作性，结合蝉翅天然阵列纳米柱结构可表现出更好的检测重现性。
附图说明
图1阵列式三维仿生sers微结构芯片的分解结构示意图
其中(a)是阵列式三维sers纳米仿生基底的分解结构示意图；
（b）是基底与pdms层4和pdms盖片层5键合的示意图；
(c)培养基补充层6的结构示意图;
(d)是培养基补充层6在补充培养基时的状态图。
图2是银纳米粒子二聚体粒径及实物图；
图3是sers标签粒径、tem表征及实物图；
图4为实施例3中头孢他啶与铜绿假单胞菌抑菌体系中加入sers标签不同时间后(10-200s)测得的sers图谱；
图5是i636/i671随时间的变化曲线；
图6为实施例3中头孢他啶与铜绿假单胞菌抑菌体系中加入sers标签不同时间后(1-72h)测得的sers图谱；
图7是头孢他啶与铜绿假单胞菌反应体系中两种内毒素测定方法测得的内毒素含量及相对误差。
具体实施方式
以下结合附图进一步说明本发明：
首先，总体说明一下芯片、sers标签以及检测方法：
1、阵列式三维sers纳米仿生微结构芯片，参见图1:
首先，根据实际测试需求，将sers基底集成在标准(76×26mm)、二分之一(38×26mm)或是四分之一规格(19×26mm)的载玻片上：利用激光雕刻机在相应大小（即选取以上任一规格）的亚力克板1上打孔，小孔为均匀分布的阵列结构，将此亚力克板贴在同样规格的载玻片衬底3上。在每个孔内，采用双面胶贴上喷金后的蝉翅2，制备得到阵列式三维sers纳米仿生基底。
然后，制备1~5mm厚的pdms打孔层4，与前面制得的阵列式三维sers纳米仿生基底准确对位并键合；同时制备厚度为200~800μm的pdms盖片层5与培养基补充层6，键合于pdms打孔层上，构建得到阵列式三维sers纳米仿生微结构芯片，芯片上每个微腔体积约10~50μl，用于待测样本中微生物封闭培养与释放的内毒素原位检测。
2、多种核酸适配体修饰的sers标签：
为实现内毒素的特异性识别，构建复合式sers标签。
利用1,6-己二胺作(1,6-hexamethylenediamine,hmd)为交联剂，将银纳米颗粒制成银纳米粒子二聚体，作为sers增强材料与载体；
通过ag-s键连接带巯基的拉曼报告分子，如:4-巯基苯甲酸（4-mba）和对氨基苯硫酚（ptap）等；
加入氨基或是羧基修饰的核酸适配体，如广谱型内毒素核酸适配体，cttctgcccgcctccttccaccgatccatcgagtttctgagaaaggcccggagaaaccgcgagaggagacgagataggcggacact及对绿脓杆菌产的内毒素有着更好特异性的ccttctaacagaatgttgttagatagc与拉曼报告分子上的活性基团（如4-mba中的羧基，ptap中的氨基等）连接；
经巯基化的聚乙二醇表面封闭，制成内毒素检测用sers标签。
3、基于sers的内毒素毒定量检测方法：
将梯度浓度的内毒素标准品加入到阵列式三维仿生sers微结构中，并加入sers标签，结合时间控制在10-600s内；
通过移动阵列式三维sers纳米仿生微结构芯片使得入射光斑恰好在每个检测腔中，采集结合内毒素前后样本的sers光谱，根据峰强比变化(如以ptap为拉曼报告分子，dmso为检测内标，发生明显变化的为i636/i671)确定结合时间，并建立内毒素浓度与峰强比的标准曲线；
在待测样本或反应体系中加入sers标签，在确定的反应时间后采集sers光谱信号，根据所建立的标准曲线得出各个样本或是时间点的内毒素含量。
以下用具体的实施例和检测数据来进一步说明本发明：
实施例1：参见图1，阵列式三维sers纳米仿生微结构芯片制备利用激光雕刻机在长度为38mm、宽度为26mm、厚度为1mm的亚力克板1上雕刻出均匀分布的的4×7排列的小孔阵列，其中1列用作空白对照实验，其余可用于考察不同时间点的内毒素释放情况。
将蝉翅放入直流离子溅射仪中，以高纯氩气为保护气，以高纯金为靶材，溅射气压为10pa，溅射电流为4ma，溅射速率为4nm/min，采用间歇式溅射方式溅射16个周期，可得镀金层厚度约为50nm的sers基材，再制备成半径为1.5mm的圆形蝉翅2，以制得的亚力克板1为模板，利用双面胶上贴在同样规格的载玻片3上，得sers基底层。再制备厚度为2mm的打孔pdms层4与sers基底层准确键合，得阵列式三维sers纳米仿生微结构，其结构如图1中的（a)和(b)所示。
利用厚度为400μm的塑料薄膜为模板，中间挖空后置于玻璃板上，倒入pdms前聚物和固化剂，再盖上另一块玻璃板，90℃烘箱中干燥60min后用手术刀切出相同规格的pdms盖片层5。
在厚度为1mm的亚力克板上按阵列小孔对应位置打出半径为0.5mm孔位。利用激光雕刻机雕刻出厚度为2μm的框架结构，与底部的亚力克层1紧密贴合，得培养基补充层6，如图1中的(c)。培养基补充层可容纳培养基约19μm3。补充培养基时，将培养基补充层紧贴于pdms腔室上，加入培养基，如图1中的(d)。持续10分钟后，待每个腔室内的培养基因重力作用补充完全。然后，去除补充层，将pdms盖片紧贴于腔体上，用于细菌等样本的密闭培养。该操作在抑菌过程中每24小时重复一次。
实施例2内毒素sers标签制备
制备银纳米粒子二聚体，在200ml去离子水中加入36mgagno3,加热至沸腾，加入4ml质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液，持续沸腾90分钟，即为银纳米溶胶。取2ml银纳米溶胶经过1800g的离心处理后，取沉淀部分分散于去离子水中。取100μl离心后分散的银纳米溶胶，加入3μlpbs缓冲液以及6μlhmd（0.4mg/ml，ph=4.0），反应两分钟后，加入100μl去离子水，得银纳米二聚体溶胶，如图2所示。
以ptap为拉曼报告分子，与银纳米粒子二聚体混合30min。加入mpeg-sh7.6×10-8mol反应10min，加入1×10-8mol的hs-peg-cooh反应20min，以1.5×10-5molmpeg-sh进行二次封闭。加入100μl10nmol/l的内毒素核酸适配体，37℃下反应12h后，离心、清洗得内毒素sers标签，如图3所示。
实施例3抑菌过程中内毒素含量的实时原位检测
在阵列式三维仿生sers微结构中，取梯度浓度的内毒素标准品(3.0625-100.0000ng/ml)与sers标签混合，以dmso为检测内标，检测反应10、30、60、100、200s后的sers光谱，确定sers标签与内毒素结合时间为100s，并建立峰强比i636/i671与浓度的标准曲线，如图4和图5。
过夜培养的铜绿假单胞菌液用lb培养基稀释至105cfu/ml，以2μg/ml的头孢他啶(ceftazidime,caz)为抑菌剂，分别在1、3、6、12、24、48、72h后加入6μl的sers标签溶液，根据建立的标准曲线计算抑菌体系中的内毒素含量变化,并以内毒素elisa检测试剂盒验证其准确性，结果具有优异的一致性，如图6和图7。
1.一种仿生纳米微结构芯片，其特征在于，所述芯片是将蝉翅作为仿生sers模板，在其表面溅射金膜作为sers基底，将其集成在阵列式微米培养腔内而构成。
2.根据权利要求1所述的仿生纳米微结构芯片，其特征在于，所述芯片包括以载玻片为衬底粘贴具有阵列小孔的亚历克板形成的阵列式三维sers纳米仿生基底，对位并键合在基底上的pdms打孔层，以及键合在pdms打孔层之上的pdms盖片层与培养基补充层，其中由阵列小孔和对应的pdms打孔层上的孔共同形成的阵列孔就形成所述的阵列式微米培养腔，溅射有金膜的蝉翅粘贴在每个微米培养腔内。
3.根据权利要求1所述的仿生纳米微结构芯片，其特征在于，所述芯片上的每个微米培养腔体积约10~50μl。
4.一种内毒素检测系统，其特征在于，包括sers标签和权利要求1-3任一项所述的芯片；
所述sers标签是由核酸适配体修饰的sers标签，所述核酸适配体是氨基或羧基修饰的核酸适配体，所述核酸适配体与拉曼报告分子上的活性基团连接构成sers标签。
5.根据权利要求4所述的内毒素sers定量检测系统，其特征在于，所述sers标签是通过如下方式获得：
利用1,6-己二胺作(1,6-hexamethylenediamine,hmd)为交联剂，将银纳米颗粒制成银纳米粒子二聚体，作为sers增强材料与载体；
通过ag-s键连接带巯基的拉曼报告分子；
加入氨基或是羧基修饰的核酸适配体与拉曼报告分子上的活性基团连接；
经巯基化的聚乙二醇表面封闭，制成内毒素检测用sers标签。
6.根据权利要求4所述的内毒素检测系统，其特征在于，所述拉曼报告分子包括4-巯基苯甲酸（4-mba）和对氨基苯硫酚（ptap）等。
7.根据权利要求4所述的内毒素检测系统，其特征在于，所述核酸适配体选自广谱型内毒素核酸适配体，cttctgcccgcctccttccaccgatccatcgagtttctgagaaaggcccggagaaaccgcgagaggagacgagataggcggacact及ataggagtcacgacgaccagccttctaacagaatgttgttgttagatagctttgaagctggtctatgtgcgtctacctcttga；对绿脓杆菌产的内毒素有着更好特异性的ccttctaacagaatgttgttagatagc；对鼠伤寒沙门氏菌产内毒素有着更好特异性的ataggagtcacgacgacgaccaggggttgtagtaactgacacggcgagaaccaacgcctgggctatgtgcgtctacctcttga，aatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaaga及aatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaagaaatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaaga；对副溶血性弧菌产内毒素有着更好特异性的ctaaaaatgggcaaagaaacagtgactcgttga；对大肠杆菌产内毒素有着更好特异性的ccgaagcttgggagccaacaccacaatcaa及ccgaagcttgggagcca等适配体。
8.权利要求5-7所述内毒素检测系统的用途，其特征在于，用于多种生化体系中内毒素含量的检测，用于细菌与抗菌药物作用后内毒素含量监测，以及生化样本中细菌原位培养并实时检测内毒素。
9.一种内毒素检测方法，所述方法包括：
将梯度浓度的内毒素标准品加入到权利要求1-3所述的阵列式三维sers纳米仿生微结构芯片中，并加入sers标签，结合时间控制在10-600s内；
通过移动阵列式三维sers纳米仿生微结构芯片使得入射光斑恰好在每个检测腔中，采集结合内毒素前后样本的sers光谱，根据峰强比变化(如以ptap为拉曼报告分子，dmso为检测内标，发生明显变化的为i636/i671)确定结合时间，并建立内毒素浓度与峰强比的标准曲线；
在待测样本或反应体系中加入sers标签，在确定的反应时间后采集sers光谱信号，根据所建立的标准曲线得出各个样本或是时间点的内毒素含量。
技术总结