本发明涉及微藻，尤其涉及一株nanochlorumsp.微藻。同时本发明还涉及该微藻作为水产饵料的应用。
背景技术：
微藻具有生长繁殖快、易培养、营养均衡等特点，通常作为一种优质的活体水产养殖饵料被广泛使用。微藻中的营养物质主要包括蛋白质、多不饱和脂肪酸、色素、微量元素、维生素及甾醇等，可为水产动物幼体和成体提供丰富的营养，从而增强其免疫力，促进其生长，提高育苗成活率，是作为水产动物必不可少的活体饵料之一。微藻在水产养殖业中还可以用于来培养轮虫、卤虫、桡足类等浮游动物，对这些次级饵料生物起到营养强化作用。单细胞藻类作为水产养殖中常用的活体饵料，除了营养全面、摄食方便、容易消化等优点外，还能够吸收养殖水体中的氮磷营养盐，优化和改善养殖环境。
饵料微藻中通常含有较高含量的蛋白质(含量大于20％)、多不饱和脂肪酸(如亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等)、类胡萝卜素及甾醇，其营养价值是人工饲料难以生产和达到的。研究表明：摄入足够的蛋白质对水产动物育苗期尤为重要，直接影响着幼苗的正常发育和变态。水产甲壳类动物(如虾、蟹)的变态发育必须有多不饱和脂肪酸的参与，α-亚麻酸是一种重要的多不饱和脂肪酸，它具有促进是生长代谢、提高免疫力、减少脂肪合成以及提高繁育能力等作用，在水产养殖中常被作为营养强化剂。
常见的饵料微藻有20多个属，包括绿藻、硅藻和金藻等藻种，是贝类、虾苗、鱼苗和海淡水浮游动物最好的天然饵料。现阶段，我国水产养殖业中大多数饵料微藻存在同样问题：1)培养密度小、生物量低，特别是常用作开口饵料的金藻，其生长缓慢、细胞密度低，因此在实际育苗过程中常发生饵料供应不足的现象，严重制约了水产养殖业的发展；而且培养密度低，需要较大的养殖面积才可以满足水产动物的需要，间接增加饵料微藻养殖成本；2)细胞体积较大，如三角褐指藻(10～20μm)和中肋骨条藻(6～22μm)，一般情况下根据藻类的大小来选择合适的饵料微藻，在育苗前期通常选用个体较小微藻作为开口饵料，体积大的微藻不易被水产动物幼苗摄食，在开口饵料的使用上受到很大程度的限制；3)环境耐受性较差，我国市场上大多数饵料微藻(如小球藻、扁藻、中肋骨条藻等)容易受温度、盐度、季节等环境的影响。研究表明，当温度超过30℃时，投喂小球藻会使原生动物大量繁殖，严重污染养殖水体和影响养殖生物的生长；4)藻种品质差，如中肋骨条藻生长周期短，容易急剧衰老并产生有毒物质，从而危害水产动物。目前我国能够进行人工培育的微藻饵料种类有限(40余种)，而且许多藻种本身稳定性差、企业培育和活体保藏技术不成熟，高密度养殖品种少，因此，微藻饵料不足仍是目前国际上水产养殖所面临的共同问题之一。
为解决微藻饵料的不足，行业内不断进行开发研究，如cn201811272762.1公开了一种新型饵料微藻―亚心型四爿藻(tetraselmissubcordiformis)，藻株能够杀灭水产养殖中普遍存在的病害微生物，从而预防和减少水产养殖病害的发生，可应用于水产养殖饵料微藻。该微藻对养殖环境起作用，但文中未提及其是否能促进水产养殖动物生长和发育。cn201510092775.0提供一株拟微型海链藻guh005，分别采用特定的培养液配方对该藻类进行三级扩大培养，并在美洲帘蛤(mercenariamercenaria)d形浮浪幼虫变态36h后进行投喂，饵料效果跟常规贝类饵料没有差别。该发明饵料微藻仅在特定阶段适用于特定养殖动物，应用范围窄。cn201310177711.1提供一种海洋硅藻作为缢蛏饵料的应用，该藻株为威氏海链藻(thalassiosiraweissflogii)，在缢蛏(sinonovaculaconstrictalamarck)稚贝生长到平均体长大于0.45mm后进行投喂。但需要根据提供的特殊投喂方式，才能提高缢蛏稚贝的生长速度，而且并不适用于其它水产动物。cn201510184003.x公开了一种用于贝类育苗的微藻复合活体饵料，是由牟氏角毛藻(chaetocerosmuelleri)、颗石藻(coccolith)、球等鞭金藻(isochrysisgalbana)、雨生红球藻(haematococcuspluvialis)、蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidesa)和亚心形扁藻(platymonassubcordiformis)按不同比例混合的微藻藻液组成。然而，该饵料并不能进行规模化产业化培养，因为海水藻种(牟氏角毛藻)和淡水藻种(蛋白核小球藻)进行混合培养，淡水蛋白核小球藻将会死亡。
但是，经对现有的饵料藻株进行综合分析发现，目前的饵料微藻种类相对较少，且多为硅藻，培养密度低，规模化培养难度大；饵料微藻多数仅针对某一养殖动物，不适用于大多数水产动物。由此可见，目前的微藻藻株并不能完全用于饵料微藻的产业化应用中。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一株nanochlorumsp.微藻。
具体地，所述的nanochlorumsp.微藻，编号为lq-1982，拉丁名称为nanochlorumsp.，保藏号为cctccm20191118，命名为nanochlorumsp.lq-1982。该藻株来源于海洋，分离纯化自东印度洋海域表层海水，是一类无鞭毛、细胞表面平滑、球形或椭球形的单细胞海洋绿藻。微藻nanochlorumsp.lq-1982个体微小，是细胞个体仅为2μm的单细胞海洋绿藻，可作为大多经济水产养殖动物的开口饵料；在正常(常规)培养条件下，干重可以达到0.36g/l，细胞数可以达到3.05×107个/ml，比常规饵料微藻的培养密度提高10倍以上，户外开放池培养最大生物量达0.3g/l，细胞密度可以达到2.54×107个/ml，可以直接稀释利用，降低养殖成本；蛋白质含量达28％以上，不饱和脂肪酸α-亚麻酸(c18:3)含量达28％以上，可满足水产养殖生物的营养需要，提高繁育能力，提高成活率，可作为水产养殖的优质饵料微藻；具有较广的温度和盐度适应范围、较高的光照耐受性和外源环境微生物抵抗力，藻种稳定性好，环境适应性强，不易污染养殖水体。
本发明目的之二提供上述nanochlorumsp.微藻的培养方法。具体地，将上述nanochlorumsp.微藻置于培养基中在自然条件下进行培养。作为本发明的一个优选实施例，所述培养基的组分包含：1l天然海水，硝酸钠0.1-0.5g/l、磷酸二氢钠5-15mg/l、碳酸氢钠0.1-1g/l、edta-铁3.5-5mg/l、硫酸铜0.005-0.01mg/l、钼酸钠0.004-0.007mg/l、硫酸锌0.02-0.03mg/l、氯化钴0.005-0.015mg/l、氯化锰0.15-0.3mg/l。进一步，培养的适宜温度范围为15-30℃；培养基的适宜生长盐度为15-40‰。
本发明的目的之三提供上述nanochlorumsp.微藻的应用。具体地，涉及该饵料微藻作为活体水产饵料的应用。
本发明所述饵料微藻在中国典型培养物保藏中心(chinacenterfortypeculturecollection，简称cctcc)的保藏号为：cctccno:m20191118，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2019年12月26日，分类命名为：nanochlorumsp.。
附图说明
图1为nanochlorumsp.lq-1982细胞形态；
图2为nanochlorumsp.lq-1982的系统进化树；
图3为nanochlorumsp.lq-1982室内培养生长曲线；
图4为nanochlorumsp.lq-1982的脂肪酸组成含量。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
1.微藻采集、分离纯化的过程。
样品取自东印度洋海域表层海水，带回实验室后按体积比1：5的比例接到无菌海水培养基中，在光照强度为200μmolphotonsm-2s-1，温度为20±1℃条件下进行富集培养3-5天。待水样呈现肉眼可见的颜色后，在无菌条件下采用稀释涂布法或划线法对预培养后的培养物用固体平板进行分离纯化，平板置于上述条件的光照培养架培养7-15天，重复多次上述分离步骤，直到得到完全无菌的单藻落。
无菌海水培养基：天然海水中添加以下成分：硝酸钠0.1g/l、磷酸二氢钠10mg/l、碳酸氢钠0.5g/l、edta-铁4.36mg/l、硫酸铜0.009mg/l、钼酸钠0.006mg/l、硫酸锌0.022mg/l、氯化钴0.01mg/l、氯化锰0.18mg/l。
2.微藻鉴定
形态学特性：单细胞海洋绿藻，无鞭毛、细胞表面平滑、球形或椭球形，个体微小，细胞个体仅为2μm。
固体平板上挑取单藻落到含有20ml灭菌海水培养基的三角瓶中，置于光照培养架上连续光照培养，定时进行摇瓶，获得对数期的藻种。离心收集藻细胞，采用植物dna提取试剂盒(hpplantdnakit，厂家：omega，型号：d2485-01)根据ctab法提取藻株dna，以18srdna通用引物pcr扩增细胞的dna，pcr反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性80s，52℃退火1min，72℃延伸2min，36个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。将pcr产物送至上海美吉生物公司测序，获得藻株的18srdna基因序列，于ncbi网址进行同源性比对，结果显示该藻株与nanochlorumsp.相似性为99％，根据18srdna基因序列构建系统发育进化树，如图2所示，可以确定该藻株为nanochlorumsp.微藻。
18srdna通用引物：
18n1：5'ggatcagaattctatctggttgatcctgccag3'
18n11：5'ctcagtaagcttgatccttccgcaggttcacc3'。
灭菌海水培养基：天然海水中添加以下成分：硝酸钠0.1g/l、磷酸二氢钠10mg/l、碳酸氢钠0.5g/l、edta-铁4.36mg/l、硫酸铜0.009mg/l、钼酸钠0.006mg/l、硫酸锌0.022mg/l、氯化钴0.01mg/l、氯化锰0.18mg/l。
实施例一nanochlorumsp.lq-1982的培养条件和生物量
固体平板上挑取单藻落到含有20ml灭菌海水培养基的三角瓶中，置于光照培养架上连续光照培养，定时进行摇瓶，获得对数期的藻种。将上述对数期藻种以初始od750(＝0.2)接种于已灭菌的lq-1号培养基中，培养基盐度为28‰；采用500ml三角瓶，培养体积为300ml，光照强度为200μmolphotonsm-2s-1；温度为20±1℃。由图3可知，lq-1号培养基条件下，藻株nanochlorumsp.lq-1982的最高生物质干重为0.36gl-1，细胞密度是3.05×107个/ml，比生长速率是0.33d-1。
lq-1号培养基组分如下：
天然海水中添加以下成分：硝酸钠0.1g/l、磷酸二氢钠10mg/l、碳酸氢钠0.5g/l、edta-铁4.36mg/l、硫酸铜0.009mg/l、钼酸钠0.006mg/l、硫酸锌0.022mg/l、氯化钴0.01mg/l、氯化锰0.18mg/l。
实施例二nanochlorumsp.lq-1982在温度为25℃、盐度30‰为条件下的生化组成
在lq-1号培养基中，温度为25℃、盐度30‰培养条件下，藻株nanochlorumsp.lq-1982含有蛋白质28.1％，总脂含量为34.4％。脂肪酸组分含量见图4，脂肪酸组成分析发现，该藻株脂肪酸主要以c16和c18为主，占总脂肪酸的98％左右，其中α-亚麻酸(c18:3)含量比较丰富，占34.7％。
实施例三nanochlorumsp.lq-1982在温度为15℃、盐度40‰为条件下的生化组成
在lq-1号培养基中，温度为15℃、盐度40‰培养条件下，藻株nanochlorumsp.lq-1982蛋白质含量稳定不变，为28.2％，总脂含量为30.6％，而α-亚麻酸(c18:3)含量占脂肪酸的28.4％。
实施例四nanochlorumsp.lq-1982在温度为30℃、盐度15‰为条件下的生化组成
在lq-1号培养基中，温度为30℃、盐度15‰培养条件下，藻株nanochlorumsp.lq-1982生化组成基本保持稳定，总脂含量为38.4％，蛋白质含量为27.6％，α-亚麻酸(c18:3)含量占脂肪酸的42.3％。
实施例五nanochlorumsp.lq-1982户外开放池培养
nanochlorumsp.lq-1982在户外220吨水体的开放式跑道池中，光照为2000μmolphotonsm-2s-1连续培养27天。经显微镜观察，培养期间没有发现其它微藻细胞生长。在该培养条件下，该藻株的最大生物量达0.3g/l，细胞密度为2.54×107个/ml，平均生物质产率为8.36gm-2d-1。
以上实施实例对本发明不同的实施过程进行了详细的阐述，但是本发明的实施方式并不仅限于此。所述技术领域的普通技术人员依据本发明中公开的内容，均可实现本发明的目的。
1.一株nanochlorumsp.微藻，编号为lq-1982，拉丁名称为nanochlorumsp.，保藏号为cctccm20191118，命名为nanochlorumsp.lq-1982。
2.如权利要求1所述的nanochlorumsp.微藻的培养方法，其特征是，将所述nanochlorumsp.微藻置于培养基中在自然条件下进行培养。
3.如权利要求2所述的nanochlorumsp.微藻的培养方法，其特征是，所述培养基的组分包含：1l天然海水，硝酸钠0.1-0.5g/l、磷酸二氢钠5-15mg/l、碳酸氢钠0.1-1g/l、edta-铁3.5-5mg/l、硫酸铜0.005-0.01mg/l、钼酸钠0.004-0.007mg/l、硫酸锌0.02-0.03mg/l、氯化钴0.005-0.015mg/l、氯化锰0.15-0.3mg/l。
4.如权利要求2或3所述的nanochlorumsp.微藻的培养方法，其特征是，所述培养的适宜温度范围为15-30℃；培养基的适宜生长盐度为15-40‰。
5.如权利要求1所述的nanochlorumsp.微藻作为活体水产饵料的应用。
技术总结