本发明涉及海珍品苗种生产技术领域，具体涉及一种纯种底栖硅藻大规模保种和扩培方法。
背景技术：
底栖硅藻是海胆、海参、鲍等多种水产动物人工育苗中的优质饵料，底栖硅藻的足量供应能显著提高这些水产动物的苗种成活率和生长速度。目前，大多数育苗企业采用现接现用的方法培养底栖硅藻饵料，即首先通过洗刷海区中海藻等物体的表面获得含底栖硅藻的海水，再将透明的片状pvc波纹板(厚1mm，33cm×40cm)置于此底栖硅藻海水中完成接种，接种于波纹板上的底栖硅藻经过数十天的培养即可用于采苗。也有部分企业将上一年在波纹板上培育的底栖硅藻保存至下一年，作为藻种洗刷下来，过滤后接种到波纹板上再次使用。两种方法的优点是能快速获得大量的底栖硅藻，在海珍品苗种规模化生产中使用，缺点是硅藻种类及组成不确定，不能保证硅藻质量。
单种的底栖硅藻较容易获得，将筛选出的具有不同特征的优良单种底栖硅藻规模化扩培，然后按需求将不同单种合理搭配，规模化培养优良混合藻种，对海珍品苗种生产具有很大的实际意义。目前单种的底栖硅藻的保种方法主要有固体培养基保存、液体培养基保存和固定化保存三种。其中固体培养基保存是将底栖硅藻接种于含营养盐的琼脂培养基上，液体培养基保存是将底栖硅藻接种于含有液体培养基的培养容器底部或内壁，固定化保存主要是利用褐藻酸钠制备胶珠，使底栖硅藻附着于胶珠上生长。然而，这些方法均仅适用于小规模保种，无法用于大规模保种和苗种生产中的大规模扩培，因此无法在实际生产中得到应用，海珍品苗种生产中急需大规模单种保种和扩培底栖硅藻的技术方法。
技术实现要素：
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种纯种底栖硅藻大规模保种和扩培方法，通过本发明的方法能够实现纯种藻液的大规模保种和扩培，解决了目前纯种底栖硅藻只能小规模保种，无法用于大规模保种和苗种生产中大规模扩培的问题，便于在实际生产中推广和应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种纯种底栖硅藻大规模保种和扩培方法，包括如下步骤：
(1)将附着基放置于培养瓶内，对培养瓶和附着基消毒，消毒后清洗培养瓶和附着基，然后向培养瓶内加入基础液；
(2)在基础液中加入营养液，摇匀，制得培养液；
(3)将经分离纯化得到的一种纯种底栖硅藻藻液加入培养液内，分离纯化技术采用微吸管分离法；
(4)扩增培养，在培养期间每天摇动培养瓶，15-20天得到纯种底栖硅藻，剧烈摇瓶得到纯种高浓度藻液，重复步骤(1)和步骤(2)制得培养液，将纯种高浓度藻液分成多份，每份占纯种高浓度藻液的20％-30％，每份纯种高浓度藻液倒入一份培养液中；
(5)重复步骤(4)，逐步获得含有大量纯种底栖硅藻的藻液。
优选的，步骤(1)中，所述附着基包括中空的透明管状结构，在透明管状结构两端的内壁上分别设置内凸起，在两个内凸起之间的透明管状结构内设置能活动的透明圆球。
优选的，所述管状结构为透明的pet或pvc硬质透明圆管，厚2mm，高30mm，外直径10mm，内直径6mm。
优选的，所述内凸起距离透明圆管端部2mm，内凸起突出于管状结构内壁2mm。
优选的，所述圆球为pet或pvc硬质透明圆球，圆球的直径为5mm。
优选的，所述培养瓶为锥形瓶，锥形瓶的容量为5l。
优选的，步骤(1)中，所述消毒是向培养瓶内倒入消毒溶剂并没过附着基进行浸泡消毒，消毒溶剂为100mg/l的二氧化氯溶液，浸泡消毒15-25分钟。
优选的，二氧化氯溶液的体积占培养瓶容积的75％-85％。
优选的，步骤(1)中，清洗是采用经煮沸4-6min并冷却至40℃以下的海水清洗附着基和培养瓶内壁3-4次。
优选的，步骤(1)中，步骤(1)中，基础液为煮沸4-6min并冷却至15-25℃的海水。
优选的，步骤(2)中，营养液与基础液的体积比为(2-3)ml：1l；所述营养液包括体积比为1:1的第一营养液和第二营养液，设置两种营养液可以防止九水硅酸钠和乙二胺四乙酸二钠直接形成络合物，影响营养盐使用效果。本发明营养液的配方有助于硅藻分化、生长，一般使用时现将第一营养液倒入基础液中混匀，再加入第二营养液混匀，降低九水硅酸钠和乙二胺四乙酸二钠直接形成络合物的风险。
第一营养液包括尿素、磷酸二氢钾、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸二钠和纯净水，尿素、磷酸二氢钾、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸二钠和纯净水的固液比为(10-13)g:(3-5)g:1g:(9-11)g：(0.7-0.8)l；
第二营养液包括按固液比为(12-18)g：1l的九水硅酸钠和纯净水。
优选的，步骤(4)中，培养的第1-5天内，每天摇动培养瓶不少于2次，第5天后，除每天摇动培养瓶不少于2次外，每2天剧烈摇动培养瓶1次。
通过摇动培养瓶，使附着基外壁间相互撞击、摩擦，附着基外壁与培养瓶内壁间相互撞击、摩擦，以及附着基内小球与附着基内壁间的相互撞击、摩擦，大部分附着基内外壁上的底栖硅藻进入基础液中形成较高浓度的藻液。
优选的，步骤(4)中，在封瓶、培养前，先用基础液定容，使液体体积占培养瓶容积的75％-85％。
优选的，用基础液定容后，藻细胞的浓度大于或等于5000个/ml。
步骤(4)中，封瓶是通过灭菌的定量滤纸进行密封。所述定量滤纸是在121℃高压灭菌20min。
优选的，步骤(4)中，培养条件是在1000-3000lux的光照度，15-25℃的室温，40％-60％的湿度下培养。
本发明的第二方面，提供利用上述方法制备得到的纯种底栖硅藻。
本发明的第三方面，提供上述纯种底栖硅藻在制备特定藻种的复合底栖硅藻藻液中的应用。
本发明的有益效果：
1、通过本发明的方法能够实现纯种藻液的大规模保种和扩培，解决了目前纯种底栖硅藻只能小规模保种，无法用于大规模保种和苗种生产中大规模扩培的问题，便于在实际生产中推广和应用。
2、本发明通过在培养瓶内放置附着基，能够增加了单位空间中底栖硅藻的生长面积，包括附着基内外壁及小球表面，有效提高了藻种产量；通过摇动培养瓶，可使附着基外壁间相互撞击、摩擦，附着基外壁与培养瓶内壁间相互撞击、摩擦及附着基内小球与附着基内壁间相互撞击、摩擦，使底栖硅藻从附着基和培养瓶脱落至培养瓶中培养液内。
3、通过本发明的方法能够大规模生产出纯种藻液，将不同种类的纯种藻液按比例搭配，能够制成优质复合藻液，可直接替代冲刷海藻获得的藻液用于苗种生产中的大规模接种，能够为养殖生物提供更优质、营养的底栖硅藻混合饵料。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分介绍的，目前单种的底栖硅藻的保种方法主要有固体培养基保存、液体培养基保存和固定化保存三种，其中固体培养基保存是将底栖硅藻接种于含营养盐的琼脂培养基上，液体培养基保存是将底栖硅藻接种于含有液体培养基的培养容器底部或内壁，固定化保存主要是利用褐藻酸钠制备胶珠，使底栖硅藻附着于胶珠上生长。这些方法均仅适用于小规模保种，无法用于大规模保种和苗种生产中的大规模扩培。
基于此，采用本发明纯种底栖硅藻大规模保种和扩培方法，在培养瓶内放置附着基，增加了单位空间中底栖硅藻的生长面积，并配合优化营养液的配方，实现纯种底栖硅藻稳定、快速的培养，保证了纯种藻液的大规模保种和扩培。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例
(1)将附着基散落放置于5l的锥形瓶内，使散落的附着基上表面约在锥形瓶3l刻度线处，所述附着基包括透明的pet或pvc硬质圆管，厚2mm，高30mm，外直径10mm，内直径6mm，在硬质圆管两端的内壁上分别设置内凸起，内凸起距离圆管端部2mm，内凸起突出于管状结构内壁2mm，在两个内凸起之间的管状结构内设置能活动的pet或pvc硬质透明圆球，透明圆球的直径为5mm；
向培养瓶内倒入100mg/l的二氧化氯溶液并没过附着基进行浸泡消毒，浸泡消毒15-25分钟，二氧化氯溶液的体积占培养瓶容积的80％，对培养瓶和附着基消毒；
消毒后，采用经煮沸4-6min并冷却至40℃以下的海水清洗附着基和培养瓶内壁3-4次，然后向培养瓶内加入基础液3l，基础液为煮沸4-6min并冷却至15-25℃的海水；
(2)在基础液中加入营养液，摇匀，制得培养液，营养液与基础液的体积比为2ml：1l；所述营养液包括体积比为1:1的第一营养液和第二营养液，使用时先将第一营养液倒入基础液中混匀，再加入第二营养液混匀；
第一营养液包括尿素、磷酸二氢钾、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸二钠和纯净水，尿素、磷酸二氢钾、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸二钠和纯净水的固液比为12g:4g:1g:10g：0.75l；
第二营养液包括按固液比为15g：1l的九水硅酸钠和纯净水；
(3)将经分离纯化得到的舟形藻(naviculasp.)藻液加入培养液内；
(4)用基础液定容，使液体体积占培养瓶容积的80％，定容后，藻细胞的浓度大于或等于5000个/ml；
通过灭菌的定量滤纸封瓶、培养，所述定量滤纸是在121℃高压灭菌20min；
培养条件是在1000-3000lux的光照度，15-25℃的室温，40％-60％的湿度下培养；在培养的第1-5天内，每天摇动培养瓶不少于2次，第5天后，除每天摇动培养瓶不少于2次外，每2天剧烈摇动培养瓶1次，培养15-20天后，得到纯种底栖硅藻，剧烈摇瓶得到高浓度的藻液，重复步骤(1)和步骤(2)制得培养液，将纯种高浓度的藻液分成多份，每份占纯种高浓度藻液的25％，每份纯种高浓度藻液倒入一份培养液中；
(5)重复步骤(4)，逐步获得含有大量纯种底栖硅藻的藻液。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
1.一种纯种底栖硅藻大规模保种和扩培方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将附着基放置于培养瓶内，对培养瓶和附着基消毒，消毒后清洗培养瓶和附着基，然后向培养瓶内加入基础液；
(2)在基础液中加入营养液，摇匀，制得培养液；
(3)将经分离纯化得到的一种纯种底栖硅藻藻液加入培养液内；
(4)扩增培养，在培养期间每天摇动培养瓶，培养后，得到纯种底栖硅藻，剧烈摇瓶得到纯种高浓度藻液，重复步骤(1)和步骤(2)制得培养液，将纯种高浓度藻液分成多份，每份占纯种高浓度藻液的20％-30％，每份纯种高浓度藻液倒入一份培养液中；
(5)重复步骤(4)，逐步获得含有大量纯种底栖硅藻的藻液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述附着基包括中空的透明管状结构，在透明管状结构两端的内壁上分别设置内凸起，在两个内凸起之间的管状结构内设置能活动的透明圆球。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述消毒是向培养瓶内倒入消毒溶剂并没过附着基进行浸泡消毒，消毒溶剂为100mg/l的二氧化氯溶液，浸泡消毒15-25分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，基础液为煮沸4-6min并冷却至15-25℃的海水。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，营养液与基础液的体积比为(2-3)ml：1l；所述营养液包括体积比为1:1的第一营养液和第二营养液，使用时先将第一营养液倒入基础液中混匀，再加入第二营养液混匀。
第一营养液包括尿素、磷酸二氢钾、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸二钠和纯净水，尿素、磷酸二氢钾、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸二钠和纯净水的固液比为(10-13)g:(3-5)g:1g:(9-11)g：(0.7-0.8)l；
第二营养液包括按固液比为(12-18)g：1l的九水硅酸钠和纯净水。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，培养的第1-5天内，每天摇动培养瓶不少于2次，第5天后，除每天摇动培养瓶不少于2次外，每2天剧烈摇动培养瓶1次。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，在扩增培养前，先用基础液定容，使液体体积占培养瓶容积的75％-85％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，培养条件是在1000-3000lux的光照度，15-25℃的室温，40％-60％的湿度下培养。
9.利用权利要求1-8任一项所述方法制备得到的纯种底栖硅藻。
10.权利要求9所述纯种底栖硅藻在制备特定藻种的复合底栖硅藻藻液中的应用。
技术总结