本发明属于生物防治技术领域，涉及一种农杆菌介导的炭角菌科真菌sj18转化子菌株及其制备方法和应用。
背景技术：
化学农药的使用在一定程度上造成了食品安全和生态环境问题，随着这一问题的不断严重，高安全性的生物农药在农林业可持续发展中的需求更加突出。生物农药主要包括农用抗生素、细菌杀虫制剂、昆虫病毒杀虫剂和真菌生物农药等。真菌是最大的杀灭病虫害微生物类群之一，某些具有生物防护作用的真菌（简称生防真菌）能通过侵染、破坏、毒性代谢物和抑制营养吸收等多种方式有效杀灭特定类群的病虫害。真菌杀灭病虫害的特点，决定了生防真菌具有高效性（不容易引起病虫害产生抗性）、安全性（对人畜无毒和对天敌伤害较少）和低成本（常规的发酵培养即可）等诸多优势。因此，生防真菌的防治机理和应用已成为当前国内外生物农药领域的研究重点方向之一。尤其是植物内生真菌，不仅能产生杀灭病虫害的活性物质，还能够激发植物对病虫害的抵抗力。另外，有些植物内生真菌还能促进植物生长，提高植物抗逆能力等。因为这些植物内生真菌与植物共生，因此其使用和维持的成本很低，适合大面积推广使用。本研究团队在前期报导了一种新的具有生物农药开发前景的炭角菌科炭团菌属真菌sj18（专利申请号：201710795984.0），它不但具有驱虫、抑制病菌的生长，还能与植物根部共生促进植物的根生长，提高植物的抗逆性，这对于我国生防真菌的开发和利用有着重要的意义。本发明是在sj18真菌分离和功能挖掘的基础上，进一步建立该真菌的转基因体系。一方面该技术可用于sj18真菌功能基因的挖掘和遗传调控，特别是针对该菌没有孢子、转基因筛选困难的情况下，本技术利用荧光标签，为后续遗传转化提供容易鉴别的插入位点，大大地提高转基因筛选的效率。另一方面，在转入荧光蛋白等标记基因后，方便了真菌侵染植物根部时的外部追踪，从而有助于sj18菌剂在各种植物防病虫害应用时的优化。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种农杆菌介导的sj18转化子菌株，本发明的第二个目的是提供上述的sj18转化子菌株的制备方法，本发明的第三个目的是提供上述的sj18转化子菌株的应用。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
农杆菌介导荧光蛋白基因转化sj18菌株。
作为优选，所述的农杆菌采用农杆菌菌株agl-1、农杆菌菌株gv3101或农杆菌菌株eha105。最优选，农杆菌为农杆菌菌株eha105。
作为优选，所述的农杆菌的基因表达载体采用ppk2载体为骨架，通过infusion的同源重组方法插入各种目的片段构建所需表达载体，并用来自构巢曲霉gpda（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,三磷酸甘油醛脱氢酶基因)启动子和hsp70(heat-shockprotein70-encodinggene,热激蛋白基因)启动子作为基因在真菌中组成性表达的启动子。也可以通过改造其它载体来实现，比如将植物表达载体pcambia1301改造为真菌表达载体，主要是替换启动子。
作为优选，所述的ppk2表达载体中插入适用于真菌系统以及便于筛选操作的egfp(增强的绿色荧光蛋白基因)报告基因，或sgfp(人工合成编码的绿色荧光蛋白)，或潮霉素抗性基因。这个报告基因也可以是其它荧光报告基因，如rfp(红色荧光蛋白)；或其它抗性基因，如新霉素磷酸转移酶ii位点或g418（遗传霉素）等。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：
上述的农杆菌介导荧光蛋白基因转化sj18菌株的制备方法包括以下的步骤：
(1)真菌表达载体的制备；
(2)农杆菌感受态的制备；
(3)待转化真菌的准备；
(4)农杆菌介导的梯度转化；
(5)目的菌株的多层次筛选。
作为优选，上述的步骤(1)包括以下的步骤：
①通过pcr方法用高保真酶从其它质粒中获得带有酶切位点的gpda、hsp70启动子序列、egfp、sgfp基因、以及终止子trpc片段，进行酶切并接入t载体中；
②以ppk2载体为骨架，通过infusion的同源重组方法插入各种目的片段构建所需表达载体。
作为优选，上述的步骤(2)包括以下的步骤：
①将-80℃保存的甘油菌株在lb平板上划线后，在28℃下过夜培养活化；
②挑选平板上的单克隆，转入5ml的lb管中振荡培养过夜；
③转移5ml小摇菌液至100mllb的摇菌瓶中，28℃下250rpm振荡培养4-5小时,定时测定菌液od600值，培养2小时后每30min测定一次，当od600值达到0.3-0.4时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上充分冷却；
④菌液转到预冷的50ml离心管中，4℃4000g以下离心15分钟；小心地倒掉上清液，用20ml预冷的无菌水洗涤重悬菌体，此步骤有时可以重复一次；
⑤4℃4000g以下离心20分钟后，用10ml预冷的10%甘油重悬浮菌体；
⑥4℃4000g以下离心20分钟后，用2-3ml预冷的10%甘油重悬浮菌体；
⑦按100μl等份装入预冷的1.5ml离心管中，于-80℃保存。
作为优选，上述的步骤(3)包括以下的步骤：
①sj18菌株在培养基平板（如pda）上20-34℃活化3-7天；
②打孔或刮取健壮菌丝块加入液体培养基（如pdb）中，按100ml培养基接入一块约0.5cm菌丝块的比例，同时加入2-5mm直径的玻璃珠（3颗/100ml以上），在最佳生长条件（28-34℃）下振荡培养3天左右，观察无团状菌丝即可；
③菌丝进行梯度稀释涂板，并根据菌落统计，控制菌丝聚团生长，打散均匀，菌生长密度达106cfu左右时，0-4℃冰箱冷藏备用。如果涂板发现菌丝形成的菌落不够细密，可以在离心管里用玻璃珠进一步快速打散。
作为优选，上述的步骤(4)包括以下的步骤：
①于-80℃冰箱中取出农杆菌1000μl、sj18菌株1000μl，冰浴化冻；
②将农杆菌用pdb培养基稀释至0.3左右(od600，以空白pdb为对照，比色管值)，取4ml加入比色管，加入诱导剂as（2‰），30℃、600rpm诱导培养，诱导至od值0.6-0.8附近；
③sj18菌株稀释100倍后，4℃4000g离心5分钟，去掉上清液后，加入诱导好的农杆菌悬液混匀，为克服菌丝不均一的可能影响，通常将sj18分成从10：1到1：10内的几个浓度；
④混匀后的菌悬液先25℃振荡培养2-3h，然后将菌体均匀涂在pda平板（加有2‰诱导剂as）的微孔滤膜上，25℃培养箱黑暗静置培养2天。
作为优选，上述的步骤(5)包括以下的步骤：
①培养完成后，将微孔滤膜直接转接至含1‰tmt，2‰hyg的pda初筛培养基中，32℃培养5-7天进行初筛；
②将初筛中长出的菌落从微孔滤膜上刮下，重悬于pdb培养基中（5-10ml培养基，3%hyg，加2-3颗4-5mm玻璃珠）,28-32℃振荡培养24h，充分打散；
③菌液涂布在pda（含3‰hyg）复筛培养基平板上，32℃培养7-14天；
④挑取复筛培养基平板上长出的菌落进行单独液体培养，培养方法参照上述②的方式，然后分别涂板，涂板培养参照③；
⑤每一平板的菌落长出后，进行荧光显微镜镜检，利用显微操作仪选取荧光信号较强的菌落，在少量无菌水中打散，再利用显微操作仪吸取荧光信号较强的菌丝片段到新的平板中继续筛选和培养；
⑥长出的菌丝片段经进一步的荧光显微镜确认，基本完成筛选和纯化过程，然后再进一步pcr验证目的基因。
为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：
上述制备的炭角菌科真菌sj18转化子菌株用于sj18功能基因研究和作为生防真菌侵染规律研究。
本发明由于采用了上述的技术方案，特别是针对不产孢子的丝状真菌进行了转化和筛选的优化，不需要制备复杂的原生质体，受体来源简单，真菌的孢子、菌丝都可以直接用于转化；采用的农杆菌介导方法转化效率高；双元载体与受体基因组无同源性时，t-dna以随机插入的方式整合进基因组，当与受体基因组有同源性时，相当数量的t-dna以同源整合的方式插入基因组；另外，得到的转化子单拷贝比率大，有利于获得标记基因。这使得t-dna标签法(t-dnatagging)可以作为研究真菌基因功能和发育分子生物学的有效方法。本发明转入的荧光蛋白基因(egfp和sgfp）前端留有ncoi单酶切位点，可供后续其它功能基因酶切和接入，或将载体酶切后通过infusion方法接入，以融合方式表达目的基因，便于筛选和功能基因表达的追踪。
本发明转入了绿色荧光蛋白这个外源基因后，也进一步可以通过直接追踪绿色荧光蛋白来追踪菌的侵染。也就是说，这个荧光蛋白基因既是作为转基因成功的标记，又是作为菌的标记（在育种研究中用），因为在植物中通过显微镜直接观察菌丝是非常困难的，而染色法的步骤又比较繁琐，且由于处理方法的问题带来实验的重复性难度大等问题，如果用gfp标记了菌株后，在激光共聚焦显微镜下，就可以直接观察到菌在植物组织中的分布位置和密度。
附图说明
图1、2为本发明构建ppk2表达载体及涉及的酶切位点。
具体实施方式
实施例1载体系统构建
我们通过infusion的同源重组方法（即clontech的in-fusion技术，只要插入的dna片段末端与载体末端具有15个同源碱基序列就可以完成克隆重组）插入各种目的片段构建所需表达载体。如图1、图2所示，具体步骤如下：
(1)利用前期已构建好的其它表达载体，用高保真taq酶将ecori-pgpda-saci-gfp-psti-ttrpc-hindiii片段扩增出来（所用引物为pgpdaf02：gaattccggagaatatggagcttcatcg，ttrpcr：aagctttcgagtggagatgtggagtg），该片段可以结合pmd-19tsimple载体作为中间载体，标记为t-pgpda-gfp，用于替换成其它启动子；
(2)替换时采用in-fusion方法可以不需要考虑酶切位点问题。对于将要替换的真菌启动子，如热激蛋白启动子phsp70、质粒pmf2-1c的碳源控制型启动子pcrg1、质粒pmf2-2c的氮源控制型的启动子pnar1等，用pcr方法在启动子两端加上15bp碱基，该碱基序列与t-pgpda-gfp载体ecori和saci两个酶切位点外侧同源得到的15bplb-phsp70-15bprb、15bplb-pcrg1f-15bprb和15bplb-pnar1-15bprb，与本步骤1）中的载体t-pgpda-gfp（ecori和saci双酶切后）大片段连接，构建中间载体t-phsp70-gfp-ttrpc、t-pcrg1-gfp-ttrpc和t-pnar1-gfp-ttrpc；
(3)将常用真菌抗生素carboxin、hygromicin、zeocin、neomycin的抗性基因通过infusion法在线设计引物工具（http://bioinfo.clontech.com/infusion/）设计引物，用这些引物扩增抗性基因的片段，再通过infusion反应连接到saci和psti双酶切的步骤2的载体中，最终获得以下中间载体；
(4)将以上这些片段左边界和右边界连入ppk2载体的hindiii和kpni酶切位点的15bp同源序列，这样就能构建好多种不同类型的启动子和多种不同抗性基因的农杆菌转化载体；
通过重复步骤（3）和步骤（4），可以将抗性基因换成需要表达的目的基因,构建t-启动子-目的基因-终止子类型的载体，然后再次通过infusion方法连入ppk2载体的ecori和kpni酶切位点之间，这样可以构建成兼具表达基因和抗性基因的农杆菌载体，构建过程中不需要考虑酶切位点问题，灵活方便选择余地很大。
实施例2转化有关菌体系的制备
1、农杆菌感受态的制备
(1)将-80℃保存的甘油菌株（gv3101或eha105）在lb（50mg/lrif）平板上划线，在28℃下过夜培养活化；
(2)挑选平板上的单克隆，转入5ml的lb（50mg/lrif）管中摇菌振荡培养过夜；
(3)转移5ml小摇菌液至100mllb的摇菌瓶中，28℃下250rpm振荡培养4-5小时,定时测定菌液od600值，培养2小时后每30min测定一次，当od600值达到0.3-0.4时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上充分冷却（通常需30分钟左右）；
(4)菌液转到预冷的50ml离心管中，4℃4000g以下离心15分钟。小心地倒掉上清液，用20ml预冷的无菌水洗涤重悬菌体，此步骤有时可以重复一次；
(5)4℃4000g以下离心20分钟后，用10ml预冷的10%甘油重悬浮菌体；
(6)将（5）所得的重悬浮菌体在4℃4000g以下离心20分钟后，用2-3ml预冷的10%甘油重悬浮菌体；
(7)按100μl等份装入预冷的1.5ml离心管中，于-80℃保存。
2.真菌待转化状态的准备
(1)sj18菌株在培养基平板（如pda）上20-34℃活化3-7天；
(2)打孔或刮取健壮菌丝块加入液体培养基（如pdb）中，按100ml培养基接入一块0.5cm左右菌丝块的比例，同时加入2-5mm直径的玻璃珠（3颗/100ml以上）用以搅散菌丝块，在最佳生长条件（28-34℃）摇菌振荡培养3天左右，观察无团状菌丝即可；
(3)菌丝进行梯度稀释涂板，并根据菌落统计，控制菌丝打散均匀，菌生长密度达106cfu左右，0-4℃冰箱冷藏备用。如果涂板发现菌丝形成的菌落不够细密，可以在离心管里用玻璃珠进一步快速打散。
实施例3农杆菌介导荧光蛋白基因egfp转化sj18菌的转化和筛选
1．农杆菌介导的梯度转化
(1)从冰箱中取出农杆菌感受态细胞悬液1000μl、sj18菌株待转化菌丝悬液1000μl，冰浴；
(2)将农杆菌用pdb培养基稀释至0.3左右，加入诱导剂as（2‰），30℃、600rpm诱导培养，诱导至od值0.6-0.8附近；
(3)sj18菌株稀释100倍后，4℃4000g离心5分钟，去掉上清液，加入诱导好的农杆菌悬液混匀，为克服菌丝不均一的可能影响，通常将sj18菌液分成从10：1到1：10内的几个浓度；
(4)混匀后的菌悬液先25℃摇菌2-3h，然后将菌体均匀涂在pda平板（加有2‰诱导剂as）的微孔滤膜上，25℃培养箱黑暗静置培养2天。
2.目的菌株的多层次筛选
(1)培养完成后，将微孔滤膜直接转接至pda（1‰tmt，2‰hyg）初筛培养基中，32℃培养5-7天进行初筛；
(2)将初筛中长出的菌落从微孔滤膜上刮下，重悬于pdb培养基中，（5-10ml培养基，含3%hyg，加2-3颗4-5mm玻璃珠）,28-32℃摇菌振荡培养24h，充分打散；
(3)菌液涂布在pda（3‰hyg）复筛培养基平板（无微孔滤膜）上，32℃培养7-14天进行复筛；
(4)挑取长出的菌落进行单独液体培养，培养方法参照上述②的方式，然后分别涂板培养，涂板培养参照③；
(5)每一平板的菌落长出后，进行荧光显微镜镜检，利用显微操作仪选取荧光信号较强的菌落，在少量无菌水中打散，再利用显微操作仪吸取荧光信号较强的菌丝片段到新的平板中继续筛选和培养；
(6)长出的菌丝片段经进一步的荧光显微镜确认，基本完成筛选和纯化过程，然后再进一步pcr验证目的基因。
实施例4sj18转化子核酸提取
本发明优化核酸提取工艺，无需液氮研磨处理，便可以同时进行批量样品的dna和rna提取，提取的dna用于基因插入的pcr检测模板，提取的rna主要用于基因表达的rt-pcr检测。核酸提取的主要步骤为：将菌落离心，取沉菌1μl左右加入至50μl的细菌裂解液中，于pcr仪中95℃加热10分钟后，放置在冰浴器上冷却3分钟。
实施例5sj18转化子基因插入pcr验证
对于转化子的鉴定，通常先检测农杆菌中的质粒片段是否插入基因组中。本方案选择检测荧光基因（egfp），其特征性扩增片段长度为246bp，区域为ppk-gpda-hyg-gpda-egfp(7283-7528)所用引物序列egfp-f1：accatggtgagcaagggcga，egfp-r1：ctgcttcatgtggtcggggtag。
pcr体系（15μl体系）配制根据所用的pcr试剂调整。pcr程序：98℃3min；98℃10s，56℃30s，72℃，40s，共35轮；72℃5min。pcr产物以电泳检测。
实施例6sj18转化子插入基因表达rt-pcr检测
（1）从-80℃中取出rna样品，用dna酶将其中残留的dna去除干净；
（2）在1.5ml管中配制下列模板rna/引物混合液，全量12μl：
模板rna3μg
oligo(dt)12-18primer(50μm)2μl
rnasefreedh2oupto12μl
（3）70℃保温10min后迅速在冰上急冷2min以上；
（4）离心数秒钟使模板rna/引物的变性溶液聚集于microtube管底部；
（5）在上述microtube管中配制下列反转录反应液；
上述模板rna/引物变性溶液12μl
5×m-mlvbuffer4μl
dntpmixture（各10mm）1μl
rnaseinhibitor（40u/μl）0.5μl
rtasem-mlv（rnaseh-）（200u/μl）0.5μl
rnasefreedh2oupto20μl
（6）42℃保温1h；
（7）70℃保温15min后冰上冷却，加入等体积的ddh2o稀释，得到的cdna溶液可直
接用于pcr扩增；
（8）吸取1μlrt产物做模板，pcr检测，pcr程序及检测方法与上面方法相同。
实施例7sj18转化子功能检测
本方案由于转入gfp基因，故可以通过观察荧光标记，快速了解基因的表达情况。检测方式可以用荧光显微镜进行定性检测，也可以用荧光分析仪进行定量检测。
（1）挑取转化子，在5ml液体pdb培养基28℃过夜培养；
（2）取5μl菌液放于载玻片上，先在普通1000倍光学显微镜中观察sj18真菌，然后转入荧光模式，以蓝色波长激发sj18菌，观察转化后的j18菌绿色荧光强度。不同的转化子其转入外源基因的表达强度不同，在同样显微荧光拍摄参数下，细胞绿光越强，表明该基因表达越强。
本发明涉及的pda培养基以及抗生素配方如下：
pdamedium：
potatoextract200g
dextrose20g
agar15g；
hyg（潮霉素）50mg/ml:
hyg1g
ddh2o20ml；
tmt（特美汀）160mg/ml:
tmt160mg
ddh2o1ml；
as（乙酰丁香酮）100mmol/ml（抽滤处理，-20℃冻存）：
as196mg
二甲亚砜10ml。
1.农杆菌介导的炭角菌科真菌sj18转化子菌株，其特征在于：在制备该转化子菌株时，农杆菌感染受体为sj18菌株，其保藏号为cgmccno.12780。
2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的炭角菌科真菌sj18转化子菌株，其特征在于：农杆菌采用农杆菌菌株agl-1、农杆菌菌株gv3101或农杆菌菌株eha105。
3.采用ppk2表达载体，启动子采用来自构巢曲霉gpda启动子和hsp70启动子中的一种或两种，功能基因为egfp或sgfp报告基因。
4.根据权利要求3所述的农杆菌介导的炭角菌科真菌sj18转化子菌株，其特征在于：ppk2表达载体egfp或sgfp报告基因的前端留有单酶切位点可供其它功能基因后续接入，接入后形成融合蛋白，方便转化子筛选和功能研究。
5.一种权利要求1所述的农杆菌介导的炭角菌科真菌sj18转化子菌株的制备方法，其特征在于该方法包括以下几个主要步骤：
(1)真菌表达载体的制备；
(2)农杆菌感受态的制备；
(3)待转化真菌的准备；
(4)农杆菌介导的梯度转化；
(5)目的菌株的多层次筛选。
6..根据权利要求5所述的炭角菌科真菌sj18转化子菌株的制备方法，其特征在于步骤(1)包括以下主要两个步骤：
①通过pcr方法用高保真酶从其它质粒中获得带有酶切位点的gpda或hsp70启动子序列、egfp或sgfp基因、以及终止子trpc片段，进行酶切并接入到t载体中；
②以ppk2载体为骨架，通过infusion的同源重组方法插入各种目的片段，来构建所需表达载体。
7.根据权利要求5所述的炭角菌科真菌sj18转化子菌株的制备方法，其特征在于步骤(3)包括以下步骤：
①sj18菌株在pda培养基平板上20-34℃活化3-7天；
③将获得的打散后的sj18菌进行梯度稀释涂板培养，并根据菌落统计，控制稀释后菌的生长密度达106cfu左右，0-4℃冰箱冷藏备用。
8.根据权利要求5所述的炭角菌科真菌sj18转化子菌株的制备方法，其特征在于步骤(4)包括以下步骤：
③sj18菌株稀释100倍后，4℃、4000g离心5分钟，去掉上清，加入诱导好的农杆菌悬液混匀，为克服sj18菌液不均一的影响，通常将sj18菌液分成从10：1到1：10内的4个浓度比例；
9.根据权利要求5所述的炭角菌科真菌sj18转化子菌株的制备方法，其特征在于步骤(5)包括以下的步骤：
①目的菌株培养完成后，将微孔滤膜直接转接至pda初筛培养基中，这个pda初筛培养基中含有200μg/ml浓度的tmt和200μg/ml浓度的hyg，32℃培养5-7天进行初筛；
②将初筛长出的菌落从微孔滤膜上刮下，重悬于5-10mlpdb培养基中，培养基中含300ug/mlhyg和2-3颗2-5mm直径的玻璃珠，32℃振荡培养24h，充分打散；
③将菌液涂布在pda复筛培养基平板上，该培养基含300μg/mlhyg，32℃培养7-14天；
④挑取单个菌落分别液体培养，培养方法参照本步骤②的方式，然后分别涂板，涂板培养参照本步骤③；
⑤本步骤
⑥长出的菌丝片段经进一步的荧光显微镜确认，基本完成筛选和纯化过程，然后再进一步pcr验证目的基因。
10.权利要求1-4中任一权利要求所述的农杆菌介导sj18菌株转化子菌株用于植物侵染的应用。
技术总结