本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种电致化学发光传感器用于癌细胞识别的方法。
背景技术：
癌症已对全球公共生活质量造成严重的威胁。癌症的早期诊断可以控制癌症死亡率。因此，需要开发一些可特异性识别癌细胞的检测新方法。过氧化氢（h2o2）在各种细胞过程中起着重要作用，如在癌细胞中过度表达，可用于预测恶性肿瘤。因此，h2o2可以成为诊断和监测恶性癌细胞的候选理想生物标志物。许多用于细胞h2o2的分子传感探针已经被开发出来并应用于癌细胞的细胞内成像。然而，探针的溶解度和靶向能力是生物应用中特别关注的问题。
介孔二氧化硅纳米粒子（msnps）由于其独特的扇形介孔结构和高表面硅烷醇基团的三维结构被认为是一种用于控制释放系统的智能转运体纳米相材料。由于其独特的结构、化学稳定性和在水溶液中的良好分散能力，msnps在设计智能目标触发生物分子释放传感平台方面引起了广泛的关注。msnps通常被用作封装信号分子的多孔支持材料，可以在孔道中装载信号分子。当目标物存在时，可打开门控开关，释放信号分子，进而实现对目标物的定量分析。
由于电致化学发光具有良好的时间分辨率、高灵敏度、低背景和简化的装置，在肿瘤生物标志物检测技术中，电致化学发光是最通用的检测技术之一。该技术已被应用于开发许多针对不同靶点的敏感生物传感器，如叶酸受体、凝血酶、端粒酶、p53dna序列和kras突变基因等。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种电致化学发光传感器用于癌细胞识别的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种电致化学发光传感器用于癌细胞识别的方法：合成高生物相容性的介孔二氧化硅纳米材料，对其孔道进行功能化修饰并装载电致化学发光信号分子，采用金纳米粒子封堵介孔二氧化硅的孔道；当癌细胞与上述处理后的介孔二氧化硅纳米材料混合并孵育，并加入抗坏血酸对癌细胞进行刺激；癌细胞经刺激产生的物质可特异性打开介孔二氧化硅的孔道，释放电致化学发光信号分子，实现对癌细胞进行特异性识别。
本发明步骤如下：
（1）采用十六烷基三甲基溴化铵为模板，正硅酸乙酯为硅源合成介孔二氧化硅纳米材料；
（2）将介孔二氧化硅纳米材料的孔道口修饰上硼酸基团，并装载电致化学发光信号分子；
（3）将经过步骤（2）处理后的介孔二氧化硅纳米材料与金纳米颗粒通过共价键合的形式封堵介孔二氧化硅的孔道，形成介孔二氧化硅可控释放纳米材料；
（4）将介孔二氧化硅可控释放纳米材料通过共孵育的方式与癌细胞混合，并使用抗坏血酸对癌细胞进行刺激，癌细胞在抗坏血酸刺激过程中特异性产生h2o2，从而打开可控释放纳米材料的孔道，并释放电致化学发光信号分子；
（5）对步骤（4）中释放的电致化学发光信号分子进行检测，实现对癌细胞的特异性识别。
步骤（1）中，将十六烷基三甲基溴化铵溶解在水中，并在剧烈搅拌下加入正硅酸乙酯，获得介孔二氧化硅纳米材料。
步骤（2）中，所述电致化学发光信号分子为ru(phen)32 信号分子。
步骤（3）中，所述金纳米颗粒为修饰有多羟基基团的金纳米颗粒。
步骤（4）中，将癌细胞培养在培养皿中，加入介孔二氧化硅可控释放纳米材料进行共孵育，使用抗坏血酸的rpmi1640培养基处理细胞使其细胞内活性氧大量爆发；随后将细胞转移到离心管中，使用细胞裂解液裂解细胞，离心后，取上清液，使用电致化学发光仪对癌细胞进行定量检测。
本发明采用介孔二氧化硅可控释放系统，结合电致化学发光技术，发明了一种电致化学发光传感器用于癌细胞识别的方法，具有以下有益效果：
1、癌细胞在抗坏血酸刺激时可以特异性产生h2o2，该物质可以打开介孔二氧化硅的孔道，并释放ru(phen)32 信号分子，正常细胞不会产生h2o2，利用该性质，可以识别癌细胞；
2、该方法可以实现对癌细胞的定量分析检测；
3、本发明可用于生物样品中癌细胞的高灵敏检测，在癌症早期识别和诊断中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明的原理示意图；
图2为电致化学发光传感器识别癌细胞数量标准曲线；
（a）为0、300、500、1000、5000、10000、50000、100000cells/ml的溶液（a-h）所释放出的电致化学发光信号曲线；
（b）为0、300、500、1000、5000、10000、50000、100000cells/ml所产生的电致化学发光信号曲线与细胞数目的关系。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地说明：
一种电致化学发光传感器用于癌细胞识别的方法：合成高生物相容性的介孔二氧化硅纳米材料，对其孔道进行功能化修饰并装载电致化学发光信号分子，采用金纳米粒子封堵介孔二氧化硅的孔道；当癌细胞与上述处理后的介孔二氧化硅纳米材料混合并孵育，并加入抗坏血酸对癌细胞进行刺激；癌细胞经刺激产生的物质可特异性打开介孔二氧化硅的孔道，释放电致化学发光信号分子，实现对癌细胞进行特异性识别。
实施例1
（1）将十六烷基三甲基溴化铵溶解在120ml蒸馏水中，调节溶液至碱性，80℃水浴20min，在剧烈搅拌下加入1.25ml正硅酸乙酯，可获得介孔二氧化硅纳米材料粗产物；粗产物在盐酸和甲醇混合液（体积比1：60）中回流24h，获得介孔二氧化硅纳米材料；
（2）采用edc-nhs的后修饰法对介孔二氧化硅纳米材料进行硼酸基团功能化，并装载ru(phen)32 电致化学发光染料；
（3）采用葡萄糖还原氯金酸的方法制备多羟基基团修饰的金纳米粒子：0.27g葡萄糖溶解在50ml蒸馏水中，加入氯金酸母液（1g/100ml）混合后，滴加0.05mol的氢氧化钠溶液，直至溶液颜色稳定，即为多羟基基团修饰金纳米粒子溶液。与步骤（2）处理后的介孔二氧化硅纳米材料混合，通过化学键合的形式封堵介孔二氧化硅孔道，形成介孔二氧化硅可控释放纳米材料；
（4）将癌细胞培养在培养皿中，加入约30μg/ml的介孔二氧化硅可控释放纳米材料进行共孵育，使用0.5mmol/l抗坏血酸的rpmi1640培养基处理细胞使其细胞内活性氧大量爆发；随后将细胞转移到离心管中，使用细胞裂解液裂解细胞，13000转/分钟离心15min后，取上清液，使用电致化学发光仪对癌细胞进行定量检测。
根据上述方法，考察了包含0、300、500、1000、5000、10000、50000、100000cells/ml（a--h）的溶液所释放出的电致化学发光信号强度（如图2a所示），响应信号值与细胞个数具有良好的线性关系（y=3040.7lgc-6765.4，r2=0.9901，图2b所示），检测限约208cells/ml（s/n=3）。
1.一种电致化学发光传感器用于癌细胞识别的方法，其特征在于：合成介孔二氧化硅纳米材料，对其孔道进行功能化修饰并装载电致化学发光信号分子，然后封堵介孔二氧化硅的孔道；当癌细胞与上述处理后的介孔二氧化硅纳米材料混合并孵育，并加入抗坏血酸对癌细胞进行刺激；癌细胞经刺激产生的物质可以打开介孔二氧化硅的孔道，释放电致化学发光信号分子，实现对癌细胞的识别。
2.根据权利要求1所述的一种电致化学发光传感器用于癌细胞识别的方法，其特征在于：其包括以下步骤：
（1）采用十六烷基三甲基溴化铵为模板，正硅酸乙酯为硅源合成介孔二氧化硅纳米材料；
（2）将介孔二氧化硅纳米材料的孔道口修饰上硼酸基团，并装载电致化学发光信号分子；
（3）将经过步骤（2）处理后的介孔二氧化硅纳米材料与金纳米颗粒通过共价键合的形式封堵介孔二氧化硅的孔道，形成介孔二氧化硅可控释放纳米材料；
（4）将介孔二氧化硅可控释放纳米材料通过共孵育的方式与癌细胞混合，并使用抗坏血酸对癌细胞进行刺激，癌细胞在抗坏血酸刺激过程中特异性产生h2o2，从而打开可控释放纳米材料的孔道，并释放电致化学发光信号分子；
（5）对步骤（4）中释放的电致化学发光信号分子进行检测，实现对癌细胞的特异性识别。
3.根据权利要求2所述的一种电致化学发光传感器用于癌细胞识别的方法，其特征在于：步骤（1）中，将十六烷基三甲基溴化铵溶解在水中，并在剧烈搅拌下加入正硅酸乙酯，获得介孔二氧化硅纳米材料。
4.根据权利要求2所述的一种电致化学发光传感器用于癌细胞识别的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述电致化学发光信号分子为ru(phen)32 信号分子。
5.根据权利要求2所述的一种电致化学发光传感器用于癌细胞识别的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述金纳米颗粒为修饰有多羟基基团的金纳米颗粒。
6.根据权利要求2所述的一种电致化学发光传感器用于癌细胞识别的方法，其特征在于：步骤（4）、（5）具体如下：将癌细胞培养在培养皿中，加入介孔二氧化硅可控释放纳米材料进行共孵育，使用抗坏血酸的rpmi1640培养基处理细胞使其细胞内活性氧大量爆发；随后将细胞转移到离心管中，使用细胞裂解液裂解细胞，离心后，取上清液，使用电致化学发光仪对癌细胞进行定量检测。
技术总结