本发明涉及微生物学领域，特别是指一种凝结芽孢杆菌菌株及其应用。
背景技术：
肠道，被称为人体的第二大脑，肠道健康的重要性不言而喻。对肠道功能的认知，除了常见的消化、营养吸收两项外，还有一直被大多数人忽视的免疫、排毒功能。人一生中摄入的食物大约为70吨，是体重的1000多倍，这些食物都是靠肠道处理。成年人大肠与小肠的总长度约有6至7米，是我们进行营养吸收的重要器官，人体所需的各种营养物质中有99％是从肠道吸收进入。再者，肠道是人体最大的免疫器官，肠道树突细胞等众多免疫细胞和粘液层、上皮抗菌蛋白等一些免疫效应器参与肠道黏膜免疫应答，抵御大量摄入或体内产生的毒素及有害物质。同时，其也是人体最大的排毒器官，人体80％以上的毒素有肠道排出。基于肠道健康对人体整体健康举足轻重的作用，世界胃肠病学组织(wgo)在2005年设立了“世界肠道健康日”。
然而，随着我国社会经济发展，众多社会因素都威胁到了肠道的健康——父母焦虑症背后的儿童抗生素滥用、以瘦为美审美观下的女性泻药依赖、工作生活压力下肠易激综合征(ibs)发病率上升等等。研究显示，我国54.5％的人口存在肠道问题，成人慢性便秘的患病率平均为14％，女性较男性高，可达17.4％，育龄期慢性便秘女性排便次数减少的发生率明显高于中老年组。不当使用促排泄药物，加重便秘、增加肠癌风险和肠道功能紊乱；临床上不遵医嘱随意使用药物，患者也易形成泻药依赖。除此之外，现代生活方式更催生了肠易激综合征(ibs)：整个肠道对刺激的生理性反应有过度或反常现象，如腹痛、腹泻、便秘或腹泻与便秘反复交替。人群ibs患病率为11.2％，近68％的ibs患者症状持续存在超过12年，造成生活质量下降，甚至伴随精神心理障碍。权威调查显示，我国儿童肠道健康现状不佳，2周腹泻发病率为7％、便秘总体患病率为4.7％。家长对抗生素效果的依赖，使得儿童滥用抗生素率高达19.9％，64.4％的儿童应用抗生素后将出现肠道菌群失调。长期的肠道不健康，使得恶性疾病的发生率持续走高。以结直肠癌为例，2015年统计数据显示，我国结直肠癌发生率、死亡率在所有恶性肿瘤中均居第5位，且结肠癌发病率上升显著。我国已成为全球结直肠癌年均新发病例数最多的国家。
上述肠道问题的出现，肠道菌群失衡是主要原因。人体肠道的内腔布满绒毛、微绒毛，其全部展开的总面积可以达到200平方米。在肠道巨大的表面积上，布满了种类超过1000种、数量高达100万亿个肠道细菌，几乎是人体细胞总数的10倍。肠道菌群分为三种：对人体有益的有益菌(乳酸菌、双歧杆菌、酵母菌为代表)、随着人体状况的变化而变化的数量较多的中性菌、容易引发身体疾病的有害菌(产气荚膜梭菌等)。这些细菌连同周围环境构成肠道微生态系统。睡眠质量差、压力大、饮食缺乏蔬果膳食纤维、缺乏运动、依赖泻药造成蒽醌类物质摄入过多、抗生素滥用等主客观原因，造成肠道微生态系统被改变，机体的“体外器官”—肠道菌群的稳定性被破坏，有益菌数量下降，有害菌数量增多。肠道菌群的不稳定直接导致人体健康受损，长期积累引发机体的较大病变，并恶性循环。
对症下药，有益菌的补充成为肠道健康的相当重要及热门的研究方向。2001年，联合国粮农组织(fao)和世界卫生组织(who)共同提出益生菌的定义：益生菌是活的微生物，当摄入足够数量时，能对宿主发挥有益健康的作用。其代表性菌株包括：乳酸杆菌、双歧杆菌、凝结芽孢杆菌。乳酸杆菌、双歧杆菌是目前大众认知最多的益生菌，食品、动物饲料、临床上等方向均有广泛应用。因其不产芽孢的细菌结构限定，乳酸杆菌、双歧杆菌存在不耐高温、对外界环境抵抗能力差的特性，常温条件下的较短贮藏时间就会造成大量活菌凋亡。人体对益生菌的补充大多从消化道摄入，经过胃部强酸性环境及消化酶的处理后到达肠道的双歧杆菌和乳酸杆菌，存活率分别只有5.2％，和5.5％。因此，双歧杆菌和乳酸杆菌的应用，即使做到保持低温储存的外部环境，经人体摄入后其益生效果也会大打折扣，无法达到各类产品包装宣传的效果。
j.r.endres等对凝结芽孢杆菌genedenbc30tm进行了毒理学安全性评估，得到“可安全用于长期人类食用”的结论。美国食品药品监督管理局(fda)与欧洲欧盟食品安全局(efsa)均对凝结芽孢杆菌通过了安全资格认定(qps)。在日本、美国、欧洲等地，凝结芽孢杆菌已经被应用于药品、食品和饲料添加剂等行业。我国农业部亦于2004年在第372号公告中，批准了天津市新星兽药厂将凝结芽孢杆菌tq33作为仔鸡和生长育肥猪的食品添加剂的申请。2005年，由青岛东海药业有限公司生产的凝结芽孢杆菌活菌片，也获得国家食品和药品监督管理局新药证书。
凝结芽孢杆菌与双歧杆菌和乳酸杆菌最大不同之处在于，它生成的芽孢能生存于强酸或强碱等恶劣环境中。有数据显示凝结芽孢杆菌体外100度高温测试10分钟后的存活率达96％以上。研究表明，凝结芽孢杆菌菌株可以在高温、胃酸和胆汁酸等极端条件下生存，而通常食用的益生菌在此条件下会大量死亡。凝结芽孢杆菌在口服后能顺利通过胃酸和消化酶等多重关口并进入肠道“定居”。它们在那里能快速复苏，重新成为活菌。科学研究也表明，凝结芽孢杆菌在缺氧环境下依然可以保持足够的活性，在人或动物肠道内的低氧环境中生长良好，而且能将食物中的糖类物质充分转化为d-型或d，l-型乳酸，而这些乳酸能有效杀死或抑制肠道中的有害微生物。定植后的凝结芽孢杆菌及其产物(包括乳酸、细菌素等)调节肠道内环境，抑制致病菌生长，促进其他有益菌的增加并带动中性菌的有益功能，提高机体免疫能力，健康状态得到改善，发挥减少使用或者替代抗生素的药用作用，从而有效解决泻药依赖及抗生素滥用引起的长期肠道问题。
技术实现要素：
本发明提出一种凝结芽孢杆菌菌株及其应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种凝结芽孢杆菌菌株(bacilluscoagulans)，其保藏编号为cgmccno.17374。
所述的菌株，其16srdna序列如seqidno:1所示。
培养所述的凝结芽孢杆菌菌株得到的发酵产物。
一种发酵产物的制备方法，包括：
一级培养、二级培养、三级扩大培养和固体发酵。
所述的一级培养包括：
将原始菌种接种至一级斜面培养基上，30℃～45℃培养20～48h；
所述一级斜面培养基为按下述比例配制的混合液(g/l)：酵母粉6.0～15.0g/l蛋白胨6.0～15.0g/l葡萄糖2.0～10.0g/l氯化钠5.0～10.0g/l磷酸氢二钾1.0～5.0g/l硫酸锰0.1～3.0g/lph6.6～7.2。
所述二级培养包括：
将所述一级培养的凝结芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量为50～100ml/200ml/300ml/500ml，30℃～45℃、150～300rpm/min条件下培养20～48h得到二级凝结芽孢杆菌种子液；
所述的二级液体培养基为按下述比例配制的混合液(g/l)：葡萄糖10.0～20.0g/l氯化钠1.0～5.0g/l酵母粉3.0～12.0g/l胰蛋白胨10.0～30.0g/l牛肉膏浸出粉5.0～15.0g/l磷酸氢二钾1.0～5.0g/l硫酸镁1.0～5.0g/l硫酸锰0.1～2.0g/l碳酸钙0.5～5.0g/lph6.6～7.2。
所述的三级扩大培养包括：
将所述的二级培养的凝结芽孢杆菌种子液体积百分比0.4％～20.0％，在培养基上与30℃～45℃、160～300rpm/min条件下培养20～48h，得到凝结芽孢杆菌三级种子液；
所述的培养基同步骤二级培养中的培养基。
所述的固体发酵包括：
培养基按5％～15％的重量比接入固体发酵培养基中，培养基含水量控制在49％～58％，ph范围在6.0～7.0，曲房相对湿度保持在85％以上，料温控制在30℃～45℃，采用前期(24～48h)通气恒温、后期(48～72h)密闭并停止加热的温度控制模式，发酵48～72h；发酵结束后，放入4℃环境下4～24h。芽孢率达到85％以上，芽孢达到2.0×1010cfu/g。
固体发酵培养基为按下述比例配制：麸皮35.0％～45.0％，玉米粉2.0％～10.0％，豆粕粉20.0％～30.0％，葡萄糖0.1％～2.0％，氯化钠2.0％～5.0％，磷酸氢二钾0.2％～1.0％，硫酸锰0.1％～0.5％，碳酸钙0.5％～2.0％，硫酸铵0.5％～1.0％，ph6.6～7.2。
含有所述发酵产物的微生物制剂。
所述微生物制剂为活菌定量为1.5×108～3.0×108cfu/颗胶囊。
所述微生物制剂适用于人体肠道不适症状的缓解和治愈：所述不适症状包括长期或者短期便秘、泻药依赖型便秘、季节性或者普通腹泻、酒精性结肠炎、腹胀等肠道疾病症状。
一种微生物制剂的制备方法，包括权利要求1所述凝结芽孢杆菌菌株的培养步骤。
有益效果
(1)本发明筛选的菌株具有高产芽孢、高产酸的特性。
(2)本发明提供的凝结芽孢杆菌与其他同属菌株具有明显的差异，芽孢形成率非常高，耐热性能好，发酵水平高。
(3)本发明提供的凝结芽孢杆菌是一种益生菌，具有一般乳酸菌维持肠道平衡，刺激免疫，提高机体健康水平等作用。
(4)本发明提供的凝结芽孢杆菌可作为益生素类(微生物制剂)应用于人体肠道不适症状(长期或者短期便秘、泻药依赖型便秘、季节性或者普通腹泻、酒精性结肠炎、腹胀等肠道疾病症状)的缓解和治愈。
(5)本发明提供的凝结芽孢杆菌可以产生大量的l-乳酸，在厌氧条件下，可以产生0.9ug/ll-乳酸。
(6)本发明采用固体发酵工艺，非均相系统更有利于凝结芽孢杆菌的繁殖及芽孢的形成，与传统的液体发酵工艺相比，芽孢率提高35％～50％。与本公司之前的发酵工艺相比，芽孢率提高5％～10％。本发明采用前后期通气量控制的固体发酵工艺，结合对发酵产物的低温刺激，既解决了代谢产物中产酸不足和杂菌污染问题，又可以促进芽孢的快速形成。
(7)本发明提供的凝结芽孢杆菌可以在营养较匮乏的培养基内繁殖，采用麸皮、豆粕等成本较低的工业残渣，节省成本，操作简便，可以取得更好的产品。
(8)本发明提供的凝结芽孢杆菌因其产芽孢的特性，具有很强的抗逆性，可以避免在运输、加工、贮藏过程中菌量的较大损失。
(9)本发明应用提供的凝结芽孢杆菌制成的微生物菌剂，包含有凝结芽孢杆菌菌体、芽孢及其发酵过程中的代谢产物。
(10)应用提供的凝结芽孢杆菌制成的微生物菌剂胶囊，制备方法可行，工艺简单易操作，提高微生物菌剂的利用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例3受试者服用效果对比图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
生物保藏：
凝结芽孢杆菌菌株(bacilluscoagulans)，于2019年3月20日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号：cgmccno.17374。
生物鉴定：
1.形态学鉴定
(1)在改良ypd琼脂培养基上菌落直径为2.0mm～3.0mm，平台状，边缘整齐，不透明，有光泽，无色素，表面湿润，质地较软。
(2)对该凝结芽孢杆菌菌落进行革兰氏染色，油镜观察菌株形态特征，发现此菌为革兰氏阳性菌，菌体大小(0.6～1.0)μm×(2.5～5.0)μm，菌体形态呈杆状，芽孢椭圆、端生。
2.生理生化鉴定
进行不同条件下的生长试验、v.p.试验、不同底物消化试验、产酸试验等多种生化鉴定试验，结果如下表1所示。
表1凝结芽孢杆菌的生化鉴定结果
注： 代表结果呈阳性，－代表结果呈阴性。
试验证明，该菌株可在厌氧、7％氯化钠、ph5.7的条件下生长，v.p.试验呈阳性，可水解淀粉、液化明胶、利用丙酸盐，产酸，符合凝结芽孢杆菌特性。
该菌株在有氧条件下可以增加菌量，发酵过程总代谢产生少量l-乳酸；在厌氧条件下可以产芽孢，并能产出较多l-乳酸。
实施例1
杭州保安康生物技术有限公司筛选出一株凝结芽孢杆菌菌株(bacilluscoagulans)，其保藏编号为cgmccno.17374，其为一株新菌株。
其发酵工艺如下：
(1)凝结芽孢杆菌的一级斜面培养：
将原始菌种接种至一级斜面培养基上，30℃～45℃培养20～48h。所述一级斜面培养基为按下述比例配制的混合液(g/l)：酵母粉6.0～15.0g/l蛋白胨6.0～15.0g/l葡萄糖2.0～10.0g/l氯化钠5.0～10.0g/l磷酸氢二钾1.0～5.0g/l硫酸锰0.1～3.0g/lph6.6～7.2
(2)凝结芽孢杆菌的二级培养：
将步骤(1)中的一级凝结芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量为50～100ml/200ml/300ml/500ml，30℃～45℃、150～300rpm/min条件下培养20～48h得到二级凝结芽孢杆菌种子液。
所述的二级液体培养基为按下述比例配制的混合液(g/l)：葡萄糖10.0～20.0g/l氯化钠1.0～5.0g/l酵母粉3.0～12.0g/l胰蛋白胨10.0～30.0g/l牛肉膏浸出粉5.0～15.0g/l磷酸氢二钾1.0～5.0g/l硫酸镁1.0～5.0g/l硫酸锰0.1～2.0g/l碳酸钙0.5～5.0g/lph6.6～7.2。
(3)凝结芽孢杆菌三级扩大培养：
将步骤(2)中得到的二级凝结芽孢杆菌种子液体积百分比0.4％～20.0％，在培养基上与30℃～45℃、160～300rpm/min条件下培养20～48h，得到凝结芽孢杆菌三级种子液。
所述的培养基同步骤(2)中的培养基。
(4)凝结芽孢杆菌的固体发酵：
培养基按5％～15％的重量比接入固体发酵培养基中，培养基含水量控制在49％～58％，ph范围在6.0～7.0，曲房相对湿度保持在85％以上，料温控制在30℃～45℃，采用前期(24～48h)通气恒温、后期(48～72h)密闭并停止加热的温度控制模式，发酵48～72h。发酵结束后，放入4℃环境下4～24h。芽孢率达到85％以上，芽孢达到2.0×1010cfu/g。
固体发酵培养基为按下述比例配制：麸皮35.0％～45.0％，玉米粉2.0％～10.0％，豆粕粉20.0％～30.0％，葡萄糖0.1％～2.0％，氯化钠2.0％～5.0％，磷酸氢二钾0.2％～1.0％，硫酸锰0.1％～0.5％，碳酸钙0.5％～2.0％，硫酸铵0.5％～1.0％，ph6.6～7.2。
上述凝结芽孢杆菌，通过现有固体发酵生产技术培养，获得高密度、高产孢率的凝结芽孢杆菌培养物。经固体发酵培养48小时，活菌数达1.0×1010cfu/g，芽孢数可达5×109cfu/g，芽孢率偏低仅为50％左右，有待进一步提高。经过进一步试验，我们发现，培养条件的调整可以优化凝结芽孢杆菌的芽孢转化率。培养基组分方面：碳源充足利于菌体生长，碳源缺乏能促使芽孢形成；培养温度方面：低温较中、高温更易使其形成芽孢；呼吸耗能方面：厌氧及兼性厌氧条件下更易生成芽孢。采用高碳源和氮源的营养配方促进菌体生长，待菌量增长进入稳定期后进行低温处理，由此获得了优质凝结芽孢杆菌产品的有效制备方法。
实施例2
凝结芽孢杆菌菌株(bacilluscoagulans)，其保藏编号为cgmccno.17374，该菌株的在微生物菌剂方向的应用。
具体如下：
(1)将实施例1中的凝结芽孢杆菌的固体发酵产物收集并烘干，烘干温度40～60℃，烘干时长18～36h，至含水量为5～10％停止。
(2)将步骤(1)中的烘干物粉碎，颗粒均过60目筛，收集装袋，密封存放于阴凉干燥处。
(3)测定步骤(2)中微生物菌剂的凝结芽孢杆菌活菌量和芽孢数。
(4)以步骤(3)中的测定结果为依据，将步骤(2)中的粉剂定量装入胶囊壳中，活菌定量为1.5×108～3.0×108cfu/颗胶囊。
上述胶囊为市售药用型胶囊壳。
本发明对所述分装和密封的方法没有特殊限定，采用本领域常规的分装和密封方法即可。
实施例3
对实施例2中所述的微生物制剂胶囊进行生物功效检测。
一、对象志愿者50人，自愿参与本研究，并签署知情同意书。
入组标准：
纳入标准：(1)有长期或者短期便秘、泻药依赖型便秘、季节性或者普通腹泻、酒精性结肠炎、腹胀等肠道疾病症状；(2)年龄8至60周岁；(3)自愿参加本研究，签署知情同意书。
二、方法
1.研究方法：对志愿者进行肠道疾病症状测查，选取符合入组标准的50个人，让他们服用应用实例1中所述的凝结芽孢杆菌微生物制剂胶囊，开展为期60天的对比试验，并于停服后继续关注效果。
2.测评依据：志愿者自述，及肠道疾病症状测查。
3.干预流程：
受试者一次1粒胶囊，一日两次，饭后30min内服用。
4.统计方法：采用spss22.0进行统计分析。以p＜0.05为差异有统计学意义。
三、结果
服用前后结果见图1。对肠道疾病症状缓解并治愈的天数对比见表1。
图1结果显示，经60天服用，受试者的服用效果明显，显效与有效的人数共49人，有效率为98.0％，组间差异均显著(p＜0.05)。复发率为6.0％，即服用60天后停用，肠道疾病症状继续出现。推测是凝结芽孢杆菌在肠道定植时间因人而异，结合受试者自身肠道修复能力的差异，定植时间短、肠道自我修复能力差的受试者，可能出现停用微生物制剂胶囊后的病症复发现象。
而由表1可知，随着肠道疾病程度的加重，凝结芽孢杆菌微生物菌剂胶囊缓解或者治愈的时间会相应的延长。此结果也侧面反映了凝结芽孢杆菌进入肠道内开始调节功能后，肠道功能修复的时间长度。
表1不同程度肠道疾病症状缓解或治愈的天数对比
在完全自愿的前提下，选取志愿者进行功能试验。试验结果良好，与文献报道的临床上凝结芽孢杆菌作用一致，且制剂效果优于已有报道中凝结芽孢杆菌与抗生素或者蒙脱石散联合用药治疗腹泻的效果。对酒精性结肠炎、短期或长期便秘、药物依赖性便秘、季节性或普通腹泻、腹涨等不适等症状均有显著性改善，且全员未出现副作用症状，复发率较低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>杭州保安康生物技术有限公司
<120>一种凝结芽孢杆菌菌株及其应用
<141>2019-12-30
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>2
<211>1485
<212>dna/rna
<213>凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)
<400>2
tcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgtgcggaccttttaaaagct60
tgcttttaaaaggttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgcctgtaagat120
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tacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttt1440
acggagccagccgccgaaggtgggacagatgattggggtgaagtc1485
1.一种凝结芽孢杆菌菌株(bacilluscoagulans)，其保藏编号为cgmccno.17374。
2.如权利要求1所述的菌株，其特征在于，其16srdna序列如seqidno:1所示。
3.培养权利要求1所述的凝结芽孢杆菌菌株得到的发酵产物。
4.一种如权利要求3所述的发酵产物的制备方法，包括：
一级培养、二级培养、三级扩大培养和固体发酵。
5.含有如权利要求3所述的发酵产物的微生物制剂。
6.根据权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂为活菌定量为1.5×108～3.0×108cfu/颗胶囊。
7.根据权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂适用于人体肠道不适症状的缓解和治愈：所述不适症状为肠道疾病症状，包括长期或者短期便秘、泻药依赖型便秘、季节性或者普通腹泻、酒精性结肠炎、以及腹胀。
8.一种微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括权利要求1所述凝结芽孢杆菌菌株的培养步骤。
技术总结