本发明属于生物技术领域，特别涉及一种嗜碱芽孢杆菌及其产生的碱性木聚糖酶和应用。
背景技术：
国外对木聚糖酶的研究始于20世纪50年代，从菌种构建到产品研发和生产都比较完善，可运用工业化大批量的生产木聚糖酶。目前研究的热点主要集中在微生物木聚糖酶基因的克隆与表达，木聚糖酶的调控机理与诱导、提纯与鉴定，利用纳米技术制备固定化酶等方面。我国对木聚糖酶的研究较晚，目前的研究主要是产木聚糖酶优良菌株的筛选及驯化，产酶条件的优化，酶的纯化和理化性质的研究，木聚糖酶基因克隆、表达和重组等方面。对于适用于造纸业的碱性木聚糖酶，国际上仅有少数可用于工业化生产的碱性木聚糖酶，而在国内还没有一种同时具备嗜热嗜碱这两种性质的木聚糖酶在造纸工业批量使用。因此，急需利用各种技术筛选适合造纸工业生产的碱性木聚糖酶。
碱性木聚糖酶是指最适反应条件为碱性的木聚糖酶。1973年，horikoshi等从嗜碱芽孢杆菌bacillussp.c-59-2中第一次分离得到嗜碱木聚糖酶。嗜碱木聚糖酶由于其独特的高ph耐受性，在造纸工业中，可以将蒸煮过程中再吸附和沉积在纤维表面上木聚糖降解成低聚木糖或木糖，使纤维表面和内部微观结构发生变化，增加漂白化学品对纸浆纤维的可及性，使后续漂白处理时漂白剂易于与残余木素作用，减少漂白过程的漂剂用量，其生物特性与造纸工艺合理衔接，具有广阔的应用前景。
虽然国内外对于木聚糖酶的研究已经有了一定的基础，但迄今为止能够进行大规模生产的高酶活的优良菌株依然不多。不同的行业需要不同特性的酶，为了得到性状优良的、适用于造纸工业的碱性木聚糖酶，方法之一是通过蛋白质工程和基因工程对现有的木聚糖酶进行改造，提高其耐热和耐碱性。二是从极端环境(盐碱地、盐碱沙漠、碱湖和造纸工业的废水)中发掘木聚糖酶资源。利用天然资源从自然界中筛选优良性能的菌株是一种相当有效的手段。因此，亟待筛选获得适合造纸、洗涤等工业生产的碱性木聚糖酶及菌株。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种嗜碱芽孢杆菌bacillussp.wmn1。该嗜碱芽孢杆菌可产生一种碱性木聚糖酶。
本发明的另一目的在于提供上述嗜碱芽孢杆菌bacillussp.wmn1产生的碱性木聚糖酶。该酶具有ph适应范围广，耐热、碱、金属离子和表面活性剂等适用于造纸、洗涤等工业的优良酶学特性。
本发明的再一目的在于提供上述嗜碱芽孢杆菌及其产生的碱性木聚糖酶的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种嗜碱芽孢杆菌，是从土壤中筛选得到的一株具有产碱性木聚糖酶活力的菌株bacillussp.wmn1。
所述菌株保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期：2020年1月3日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：cctccno：m2020007。
菌落形态特征：在lb固体培养基上的菌落边缘较为整齐，颜色为米白色，表面平滑有光泽。
该菌株的选择培养基的配方：木聚糖8.0g/l，kno31.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，nacl15g/l，kh2po41.5g/l，琼脂15～20g/l，ph9.0。
所述的嗜碱芽孢杆菌bacillussp.wmn1产生的碱性木聚糖酶，按照下述方法制得：
(1)粗酶液的制备
将bacillussp.wmn1在发酵培养基中进行液体发酵，在37℃，200rpm的培养条件下发酵5d，于4℃，12000rpm高速冷冻离心25min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，即得粗酶液，用于离子交换层析；
(2)碱性木聚糖酶的分离纯化
(a)碱性木聚糖酶的阴离子交换层析
离子交换层析介质为deaesepharosefastflow；缓冲液体系为ph8.0的tris-hcl缓冲液，平衡液为ph8.0的tris-hcl缓冲液，洗脱液为含naclph8.0的tris-hcl缓冲液；取约60ml介质小心灌入规格为φ1.6cm×40cm的层析柱中，使得凝胶均匀且无气泡；用3～5倍柱体积的平衡液进行平衡，待a280稳定后上样(粗酶液)，穿透峰出现之后进行盐浓度梯度洗脱，分别收集不同盐浓度梯度洗脱出来的峰，检测各个峰的木聚糖酶酶活；使用10kda的超滤管将具有酶活性峰的洗脱液进行浓缩脱盐，得到碱性木聚糖酶的酶液，即浓缩酶液；
(b)碱性木聚糖酶的凝胶过滤
使用预装柱superdex75将进行过阴离子交换层析的酶液再次进行分离；缓冲液体系为ph8.0的tris-hcl缓冲液，用3～5倍体积缓冲液将a280基线冲洗至稳定状态后，取适量步骤(a)获得的浓缩酶液上样，再用1个体积将样品进行洗脱，并收集洗脱峰液，即纯酶液，进行酶活检测和蛋白电泳分析。
所述碱性木聚糖酶的蛋白分子量为36kd左右，酶学特性研究显示，其最适反应ph约为8.5～9，最适温度为50℃左右，具有优良的温度稳定性和ph稳定性，而且还具有耐多种金属离子、表面活性剂以及金属螯合物等特性，但mn2 和cu2 对酶活力有一定的抑制作用。特别是wmn1碱性木聚糖酶在ph5～11范围内稳定，具有宽ph适应性，即具有既耐酸又耐碱的强抗逆特性，在造纸、洗涤等工业中具有良好的应用价值。
从bacillussp.wmn1的基因组dna中扩增得到wmn1木聚糖酶基因的完整表达开放阅读框(orf)，长1308bp。将其酶基因的氨基酸编码序列在ncbi数据库进行blast，发现该氨基酸序列与同为10家族的木聚糖酶jonesiaquinghaiensis具有83％的相似性，结合酶蛋白的分子量大小、等电点、酶活特性等性质，可初步推断编码该氨基酸序列的基因为新的木聚糖酶基因。
所述的嗜碱芽孢杆菌bacillussp.wmn1及其产生的碱性木聚糖酶在造纸、洗涤等工业中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明筛选得到的嗜碱芽孢杆菌bacillussp.wmn1属于耐碱的极端微生物，可在高碱性(ph9.0)条件下培养，更有效防止杂菌污染，更有利于大规模的发酵生产。
(2)本发明嗜碱芽孢杆菌bacillussp.wmn1产生的碱性木聚糖酶最适ph为8.5～9左右，在ph5～11之间，相对酶活力均在80％以上，ph稳定性良好，具有既耐酸又耐碱的强抗逆特性；最适反应温度为50℃左右，在40～60℃之间，相对酶活性均大于50％；在40℃以下酶活性稳定。具有耐多种金属离子、表面活性剂以及金属螯合物等特性，但mn2 和cu2 对酶活力有一定的抑制作用。在洗衣粉的浓度达1.5％时，该酶的相对酶活力仍大于50％，酶性质优良，在洗涤等工业中具有良好的应用价值。
附图说明
图1是bacillussp.wmn1在lb固体培养基中的形态及菌落显微形态。
图2是木糖标准曲线。
图3是bacillussp.wmn1木聚糖酶阴离子交换图谱。
图4是bacillussp.wmn1木聚糖酶分离纯化的电泳图谱，其中m：蛋白marker；1：bacillussp.wmn1粗酶液；2：deaesepharosefastflow阴离子层析的酶活峰液；3：superdex75凝胶过滤层析的酶活峰液。
图5是bacillussp.wmn1碱性木聚糖酶的最适反应温度。
图6是bacillussp.wmn1碱性木聚糖酶温度的稳定性。
图7是bacillussp.wmn1碱性木聚糖酶的最适反应ph。
图8是bacillussp.wmn1碱性木聚糖酶ph的稳定性。
图9是金属离子和表面活性剂对bacillussp.wmn1碱性木聚糖酶活的影响。
图10是洗衣粉对bacillussp.wmn1碱性木聚糖酶的影响。
图11是1％琼脂糖凝胶电泳结果；其中，a：bacillussp.wmn1基因组；b：touchdownpcr克隆wmn1木聚糖酶基因保守序列电泳图，m为dnaladdermarker，1为wmn1保守序列；c：wmn1保守序列的上游基因电泳图，m为dnaladdermarker，1为wmn1木聚糖酶基因保守序列上游基因；d：wmn1保守序列的下游基因电泳图，m为dnaladdermarker，1为wmn1木聚糖酶基因保守序列下游基因。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。
实施例1目标菌株的筛选
(1)富集培养：称取1g采集的土样，充分混匀在100ml的无菌水中，制成菌悬液后，取1ml菌悬液加入到灭菌的5ml富集培养基中，37℃富集培养48h。
富集培养基：木聚糖8.0g，蛋白胨10g，nacl15g，kh2po41.5g，na2hpo4·12h2o9.0g，mgso4·7h2o2.0g，定容至1lddh2o，ph9.0。
(2)平板初筛：将富集培养后的菌液10倍逐级稀释，分别取稀释倍数为10-3、10-5、10-7的菌悬液0.5ml涂布于含有木聚糖的碱性选择培养基平板上，37℃培养48h，筛选出透明圈较大的单菌落挑入碱性斜面培养基，经多次筛选后得到单一菌落，并保藏为原始菌种。
选择培养基：木聚糖8.0g，kno31.0g，mgso4·7h2o0.5g，nacl15g，kh2po41.5g，琼脂15～20g，溶于1lddh2o，ph9.0。
碱性斜面培养基：葡萄糖10g/l，蛋白胨5g/l，酵母提取物5g/l，kh2po41g/l，mgcl20.2g/l，nacl50g/l，na2co310g/l，琼脂15～20g/l，ph9.0。
(3)本文使用其中一株菌株作为研究，利用通用引物(27f和1492r)pcr扩增该菌株的16srdna序列，到genbank上进行比对，比对结果显示，该菌株的16srdna序列与其它多株芽孢杆菌的16srdna序列有99％的相似性，初步确定为芽孢杆菌(bacillussp.)，将其命名为bacillussp.wmn1。
该嗜碱芽孢杆菌，名称为bacillussp.wmn1，所述菌株保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期：2020年1月3日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：cctccno：m2020007。
该菌株在lb固体培养基中和显微镜下的形态如图1，菌落边缘较为整齐，颜色为米白色，表面平滑有光泽。
lb固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，固体培养基中加入15～20g琼脂，定容至1l，121℃高压灭菌20min。
与当前工业用酶菌株相比，bacillussp.wmn1菌属于耐碱的极端微生物，可在高碱性(ph9.0)条件下培养，更有效防止杂菌污染，更有利于大规模的发酵生产。
所述的bacillussp.wmn1菌株的16srdna序列如seqidno：1所示，其长度为1456bp。
实施例2嗜碱芽孢杆菌bacillussp.wmn1产生的碱性木聚糖酶的分离纯化
(一)材料
1、菌种：实施例1获得的嗜碱芽孢杆菌bacillussp.wmn1(cctccno：m2020007)。
2、培养基及缓冲液
(1)发酵培养基：麸皮6g，蛋白胨1g，k2hpo40.7g，溶于100mlgly-naoh缓冲液，ph9.0。
(2)1％木聚糖溶液：1g木聚糖溶解于ph9.0的0.05mgly-naoh缓冲液中，定容至100ml，用前充分摇匀。
(3)gly-naoh缓冲液(0.05m)：甘氨酸3.8g，氢氧化钠0.35g，溶于1lddh2o，ph9.0。
(4)3,5-二硝基水杨酸(dns)溶液：准确称取dns7.5g、氢氧化钠14.0g(缓慢加入)、酒石酸钾钠216g、偏重亚硫酸钠6.0g，搅拌均匀，加入5.6ml预先在60℃水浴中融化的苯酚(有毒，带口罩)，充分溶解，加去离子水定容至1l，贮于棕色瓶中，室温下避光放置一周后使用。
(5)蛋白分离纯化缓冲液：
1.tris-hcl缓冲液a(平衡缓冲液)：20mmtris，用hcl调节ph至8.0。
2.tris-hcl缓冲液b(洗脱缓冲液)：20mmtris，1mnacl，用hcl调节ph至8.0。
3、主要试剂：蛋白marker均购于生工生物工程(上海)有限公司。木聚糖生产于megazyme。阴离子交换层析介质deaesepharosefastflow为ge公司生产。10kda蛋白超滤管购于millipore公司。其他试剂均为国产分析纯。
4、主要仪器：thermo高速冷冻离心机、bio-rad电泳仪、gehealthcare快速蛋白层析系统、thermo超微量紫外分光光度计、thermo低温培养箱、eppendorf大容量高速冷冻离心机、振荡摇床、压力蒸汽灭菌锅、millipore超纯水机、凝胶成像系统、分光光度计、电子天平、水浴锅、电热恒温培养箱、搅拌器、微波炉、鼓风干燥箱、eppendorf移液器、biotek酶标仪。
(二)实验方法
1、粗酶液的制备
将菌株bacillussp.wmn1在发酵培养基中进行液体发酵，在37℃，200rpm的培养条件下发酵5d，于4℃，12000rpm高速冷冻离心25min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，即得粗酶液。测定其内切木聚糖酶活性后，用于离子交换层析。
2、木聚糖酶酶活测定方法
以ph＝9.0的gly-naoh缓冲液制备的1％木聚糖溶液为底物，取其1ml，加入100μl经适当稀释的上述酶液，混匀，于45℃下振荡反应20min后，迅速加入1mldns(3,5-二硝基水杨酸)溶液，沸水浴10min，冷却后于540nm测定还原糖，并扣除空白试验测定值。将上述条件下每分钟由底物产生1μmol木糖所需的酶量定义为一个酶活力单位，用u/ml表示。
3、木糖标准曲线的绘制
精确称量无水木糖1g，定容到100ml后，制成1％的标准木糖溶液，分别取0.1ml、0.15ml、0.2ml、0.25ml、0.3ml、0.35ml定容到10ml，使其木糖浓度分别为0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.35mg/ml，取上述不同浓度溶液各1.1ml于试管中(另外设置一管取1.1ml去离子水作为对照)，加入1mldns，沸水浴显色10min，待其冷却后测定540nm下的吸光值。以吸光值为纵坐标，其对应的标准木糖溶液浓度为横坐标，绘制木糖标准曲线(如图2)。通过此木糖标准曲线和酶活计算公式将od540值换算为酶活力单位(u/ml)。
xylan-dns酶活力计算公式：
公式中：6.66为1mg木糖的μmol数。(1000/150.13＝6.66)
4、碱性木聚糖酶的分离纯化
(a)碱性木聚糖酶的阴离子交换层析
分离纯化使用的离子交换层析介质为deaesepharosefastflow。缓冲液体系为ph8.0的tris-hcl缓冲液，平衡液为ph8.0的tris-hcl缓冲液，洗脱液为含naclph8.0的tris-hcl缓冲液。取约60ml介质小心灌入规格为φ1.6cm×40cm的层析柱中，使得凝胶均匀且无气泡。用3～5倍柱体积的平衡液进行平衡，待a280稳定后上样(粗酶液)，穿透峰出现之后进行盐浓度梯度洗脱，分别收集不同盐浓度梯度洗脱出来的峰，检测各个峰的木聚糖酶酶活。使用10kda的超滤管将洗脱的具有酶活性峰进行浓缩脱盐，得到碱性木聚糖酶的酶液，即浓缩酶液。后进行sds-page蛋白电泳分析，剩下的浓缩酶液放4℃保存，用于后续的凝胶过滤。
(b)碱性木聚糖酶的凝胶过滤
使用预装柱superdex75将进行过阴离子交换层析的浓缩酶液再次进行分离。缓冲液体系为ph8.0的tris-hcl缓冲液，用3～5倍体积缓冲液将a280基线冲洗至稳定状态后，取适量浓缩酶液上样，再用1个体积将样品进行洗脱，并收集洗脱峰液，即纯酶液，进行酶活检测和蛋白电泳分析之后，用于酶学性质的研究。
(c)sds-page蛋白电泳分析
(1)试剂的准备与配制
10％过硫酸铵(w/v)：0.1g过硫酸铵溶解于1ml去离子水中，现配现用。
30％丙烯酰胺、10％sds、ph8.8的分离胶缓冲液、ph6.8的浓缩胶缓冲液、10xtris-glycinesds电泳缓冲液(ph8.3)、5×蛋白质加样缓冲液；
染色液：将2.5g考马斯亮兰r-250溶解于500ml甲醇，加入100ml冰醋酸，混匀，去离子水补至1l。
脱色液：乙醇50ml，乙酸100ml，去离子水定容至1l。
(2)sds-page凝胶的配制：
a.按照下表配制10％的分离胶：
表1sds-page凝胶分离胶配制
b.按照下表配制5％的浓缩胶：
表2sds-page凝胶浓缩胶配制
c.待分离胶聚合之后，倒掉上层的水，加入浓缩胶，并插好梳子，直至完全聚合后开始sds-page凝胶电泳。
(3)电泳的步骤：
a.样品准备：在适量样品中加入5×loadingbuffer，沸水浴5min，然后12000rpm离心10min，取上清备用。
b.向电泳槽的内外槽中加入现配的电泳缓冲液。
c.上样：取30μl上述样品上清加入到孔道中，后加入5μl的预染蛋白marker。
d.电泳：接通电源，并正确连接正负极，电压为120v，约50min，即待溴酚兰指示剂下行至凝胶底部停止电泳。
e.染色：小心将凝胶从玻璃板上取下，加入适量考马斯亮兰染色液，在振荡摇床上染色20～30min。
f.脱色：将染色液倒掉，用去离子水漂洗一两遍，然后加入脱色液,多次更换脱色液直至蛋白条带清晰可见。
(三)实验结果
1、阴离子交换层析
ph8.0的tris-hcl缓冲液平衡deaesepharosefastflow柱子后，基线走平，取适量经0.45μm过滤的粗酶液上样。ph8.0的tris-hcl缓冲液继续冲洗柱子，收集穿透峰；待基线再次走平，使用含nacl的ph8.0的tris-hcl缓冲液进行梯度洗脱，收集各个洗脱峰，并将收集到的所有峰液各自进行木聚糖酶活检测。离子交换图谱如图3。使用10kda超滤管将检测到有酶活的峰液进行浓缩和脱盐，得到浓缩酶液。取适量浓缩酶液进行sds-page蛋白电泳分析，结果如图4，在泳道2能清楚地看到一条约为36kda的条带。
2、凝胶过滤层析
使用预装柱superdex75将进行过阴离子交换层析的浓缩酶液再次进行分离。缓冲液体系为ph8.0的tris-hcl缓冲液，用3～5倍体积缓冲液将a280基线冲洗至稳定状态后，取适量浓缩酶液上样，再用1个体积将样品进行洗脱，并收集洗脱峰液，即纯酶液，进行酶活检测和蛋白电泳分析。凝胶过滤的蛋白电泳结果如图4的泳道3所示，可见一条明显的目的蛋白条带(分子量约为36kda)，基本达到分离纯化的目的。之后进行酶学性质的研究。
实施例3碱性木聚糖酶的酶学性质研究
(一)实验方法
1.最适反应温度与温度的稳定性
取适量稀释的纯酶液，分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下反应20min，dns法测定其酶活力，以此确定最适反应温度。研究温度的稳定性时，将适量稀释的纯酶液放置在不同的温度下保温1h，随后在45℃下反应20min测定其酶活力。
2.最适反应ph与ph的稳定性
取适量稀释的纯酶液，分别在ph2、ph3、ph4、ph5、ph6、ph7、ph8、ph8.5、ph9、ph9.5、ph10、ph11、ph12下反应20min，dns法测定其酶活力，以此确定最适反应ph。研究ph的稳定性时，将适量稀释的纯酶液放置在不同的ph下保温1h，随后在ph9.0下反应20min测定其酶活力。
3.金属阳离子和表面活性剂对酶活力的影响
在适量纯酶液中分别加入一定体积的金属阳离子溶液，使其终浓度为10mm；加入的edta的浓度为0.1％；加入的sds的浓度为0.05％和0.1％。均放置在37℃下保温30min后测定其酶活力。
4.洗衣粉对酶活力的影响
在适量纯酶液中加入一定量的立白洗衣粉使其终浓度为0.5％、1％、1.5％、2％、5％，37℃保温30min，然后测定其酶活力。
(二)实验结果
1.最适反应温度
取适量稀释的纯酶液，分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下反应20min，dns法测定其酶活力，以最适反应温度时的酶活力为100％，得到以下结果。由图5可看出该碱性木聚糖酶的最适反应温度为50℃，在40～60℃之间，相对酶活性均大于50％。
2.温度的稳定性
将适量稀释的纯酶液放置在不同的温度下保温1h，随后在45℃下反应20min测定其酶活力。结果如图6。从图中可得知，在40℃以下时，酶的稳定性较好，大于40℃时，酶活力逐渐下降。
3.最适反应ph
取适量稀释的纯酶液，分别在ph2、ph3、ph4、ph5、ph6、ph7、ph8、ph8.5、ph9、ph9.5、ph10、ph11、ph12下反应20min，dns法测定其酶活力，以最适反应ph的酶活力为100％，得到以下结果。由图7中可看出，该酶的最适反应ph为8.5～9左右，为一典型的碱性木聚糖酶。
4.ph稳定性
将适量稀释的纯酶液放置在不同的ph下保温1h，随后在ph9.0下反应20min测定其酶活力。结果如图8，从图中可知，在ph5～11之间，该酶的相对酶活力均在80％以上，说明该酶ph稳定性良好，具有既耐酸又耐碱的强抗逆特性，符合造纸和洗涤等工业用酶的基本要求，具有良好的工业应用前景。
5.金属阳离子和表面活性剂对酶活力的影响
在适量纯酶液中分别加入一定体积的金属阳离子溶液，使其终浓度为10mm；加入的edta的浓度为0.1％；加入的sds的浓度为0.05％和0.1％。均放置在37℃下保温30min后测定其酶活力。以不加金属离子时测得的酶活力为对照组，结果如图9，该结果表明mn2 和cu2 对酶活力有一定的抑制作用，其它金属离子和edta对酶活力影响甚微。sds对酶活有轻微的抑制作用。
6.洗衣粉对酶活力的影响
在适量纯酶液中加入一定量的洗衣粉使其终浓度为0.5％、1％、1.5％、2％、5％，37℃保温30min，然后按照常规方法测定其酶活力。以不添加洗衣粉时测得的酶活力为100％，得到下图10结果，在立白洗衣粉的浓度达1.5％时，该酶的相对酶活力仍大于50％，说明该酶性质优良，在洗涤等工业中具有良好的应用价值。
实施例4
(一)材料
1、菌种：实施例1获得的嗜碱芽孢杆菌bacillussp.wmn1(cctccno：m2020007)。宿主菌e.colidh5α购自invitrogen公司。
2、载体
大肠杆菌克隆载体pmd19-tvector，具有ampr抗性标志，购自takara(大连)宝生物公司。
3、培养基
lb培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，固体培养基中加入15-20g琼脂，定容至1l，121℃高压灭菌20min。
1％琼脂糖凝胶：1g琼脂糖溶解于100ml1×tae缓冲液中，再加入5μlgoldview。
amp：溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。过滤除菌后分装成小份于-20℃贮存。以50μg/ml的终浓度添加于培养基中。
kan：溶解0.5g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。过滤除菌后分装成小份于-20℃贮存。以50μg/ml的终浓度添加于培养基中。
4、主要试剂
细菌基因组提取试剂盒、pcr产物纯化试剂盒均购于generay公司；gelextractionkit为omega公司生产；m5plasmidminipreppluskit为聚合美公司生产；所用的简并引物、特异性引物和随机引物均为广州invitrogen公司合成。核酸染料goldenview为bioteke公司生产，lataq酶、extaq酶、限制性内切酶购于takara公司，dnamarker购于生工生物工程(上海)有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
5、主要仪器
thermo高速冷冻离心机、bio-rad电泳仪、gehealthcare快速蛋白层析系统、thermo超微量紫外分光光度计、thermo低温培养箱、eppendorf大容量高速冷冻离心机、bio-radpcr仪、振荡摇床、压力蒸汽灭菌锅、millipore超纯水机、凝胶成像系统、分光光度计、电子天平、水浴锅、电热恒温培养箱、搅拌器、微波炉、鼓风干燥箱、eppendorf移液器、biotek酶标仪。
(二)实验方法
1、bacillussp.wmn1基因组的提取
使用genray细菌基因组dna提取试剂盒进行bacillussp.wmn1基因组的提取，步骤如下：
柱子准备：在gdnarecoverycolumn中加入200μlbuffercbs，10000rpm离心1min，弃透过液，备用。
(1)取1ml过夜培养菌液，8000rpm，离心1min，彻底弃净培养基。
(2)加入150μlte(ph8.0)悬浮细菌，加入lysozyme溶液8μl，用吸头混匀，室温酶解5～10min。
(3)加入300μldigestionsolution，混匀；加入4μlrnasea混匀，55℃保温10min；再加入4μlproteinasek，55℃保温10～30min。将混合液全部转移到套放2ml收集管内的gdnarecoverycolumn柱中(如获得的裂解液粘稠度较低，则直接添加300μlpbsolution，充分摇动混匀，12000rpm室温离心5min，将上清全部转移到套放2ml收集管内的gdnarecoverycolumn柱中。如获得的裂解液过于粘稠，则依次添加300μlextsolution以及300μlpbsolution充分摇匀，12000rpm室温离心5min，上层溶液为蓝色，基因组dna存在于下层溶液中，用1mltip头伸到下层，将下层溶液全部转移到套放于2ml收集管内的gdnarecoverycolumn柱中。)
(4)8000rpm室温离心1min。取下gdnarecoverycolumn柱，弃去收集管中的废液。
(5)将gdnarecoverycolumn柱放回收集管中，加入500μlwashsolution，8000rpm，室温离心1min。取下gdnarecoverycolumn柱，弃去收集管中的废液。
(6)重复步骤5一次。
(7)将gdnarecoverycolumn柱放回收集管中，12000rpm，室温离心1min，以去除残留的washsolution。
(8)将gdnarecoverycolumn柱放入新的洁净的1.5ml离心管中，在gdnarecoverycolumn柱中央加入50～100μlelutionbuffer，室温或37℃放置2min。
(9)12000rpm，室温离心1min。离心管中的液体即为基因组dna，-20℃保存。
2、bacillussp.wmn1木聚糖酶基因的保守序列及其侧翼序列
2.1、touchdownpcr克隆木聚糖酶基因保守序列
(1)使用primerpremier5.0软件设计上下游引物。根据已知的10家族木聚糖酶保守序列设计上游简并引物(5′-ctctggaagccnayncmrtsna-3′)和下游简并引物(5′-gactgggaygtngtnaayga-3′)，送去合成。
(2)使用takara的pcramplificationkit试剂盒，以基因组dna为模板，按照如下反应体系配制pcr反应液：
然后按照以下条件进行touchdownpcr反应：
采用1％琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行检测。
2.2、touchdownpcr产物回收
pcr产物回收使用的是omega公司生产的gelextractionkit(100)d2500-01，主要步骤如下：
(1)在紫外灯下切出含有目的dna的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，此时应注意尽量切除不含目的dna部分的凝胶，减小凝胶体积，提高dna回收率，之后放入ep管中。(注意切胶时不要将dna长时间暴露于紫外灯下，以防止dna损伤)
(2)切碎胶块。胶块切碎后可以加快胶块融化时间，提高dna的回收率。称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg＝1μl进行计算，向胶块中加入等量的胶块融化液bindingbuffer。
(3)50℃溶解7～15分钟，保证溶胶要完全，否则会影响后续回收。
(4)将溶胶放入层析柱中(不超过700μl)，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。
(5)加入300μl的bindingbuffer，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。
(6)加入700μl的spw，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。
(7)重复步骤(6)。
(8)将空柱13000rpm离心2min，以去掉残存的乙醇，否则会严重影响后续dna的回收。
(9)弃掉收集管，换成干净的ep管，往吸附柱正中间的吸附膜小心加入15μlelutionbuffer，室温静置3min，13000rpm离心2min，保存于-20℃冰箱中。
2.3、e.colidh5α感受态细胞的制备
(1)蘸取菌种dh5α，在lb平板上划线，待长出单菌落将其接种于10mllb液体培养基中，37℃，200rpm摇床过夜培养；
(2)取过夜摇床的菌液0.5ml，加入50mllb液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养，待od600nm在0.3～0.6时，将菌液收集起来，放置在冰上；
(3)4℃，5600rpm离心10min，去掉上清液，加入冰预冷的0.1mol/lcacl210ml轻轻悬浮菌体，冰浴；
(4)重复步骤3；
(5)加入1.5ml0.1mol/lcacl2和0.5ml60％甘油轻轻悬浮菌体，分装在1.5ml离心管中，每管100μl，于-80℃保存备用。
2.4、touchdownpcr产物的连接、转化和测序
(1)将4μl回收的pcr产物、1μlpmd-19tsimplevector和5μlsolutioni(takara公司生产)混匀，16℃水浴连接3h。
(2)从-80℃冰箱中取100μl感受态细胞悬液，冰中使其解冻。
(3)将连接好的产物加入感受态细胞中轻轻摇匀，冰上放置30min。
(4)42℃水浴中放置90s，之后迅速置于冰上冷却15min。
(5)向管中加入1mllb液体培养基，混匀后37℃、250rpm振荡培养1h。
(6)培养后的菌液于6000rpm离心5min，去除部分上清，剩下的混匀。取100μl涂布于含氨苄青霉素的筛选平板上，37℃培养16～24h。
(7)用接种环挑选长出的单菌落放于1mllb培养基(含氨苄青霉素)中，37℃、250rpm过夜摇菌，每组选取1个送去测序。
2.5、tail-pcr克隆木聚糖酶基因保守序列的上下游基因
(1)tail-pcr是为了得到wmn1木聚糖酶基因保守序列上游和下游的基因，使用primerpremier5.0软件设计特异性引物和随机引物。根据touchdownpcr产物测序所得到的保守序列，分别设计2组20bp左右的上下游特异性引物，每组上游特异性引物(upstreamprimer，简称usp)和下游特异性引物(downstreamprimer，简称dsp)各有3个嵌套的引物用于tail-pcr的三轮反应。同时设计出7对随机引物(arbitrarydegenerateprimer，简称ad)。保守序列和引物序列见表3。引物送去合成后，即可进行下一步实验。
表3bacillussp.wmn1保守序列及用于tail-pcr的引物
(2)tail-pcr克隆上游基因
使用takara的pcramplificationkit试剂盒，以基因组dna为模板，按照如下反应体系配制pcr反应液：
然后按照以下条件进行第一轮tail-pcr反应：
第二轮tail-pcr反应体系同第一轮，但是将第一轮反应的pcr产物用ddh2o稀释100倍后作为模板dna，usp1换为usp2，反应条件如下：
第三轮tail-pcr反应体系同第一轮，但是将第二轮反应的pcr产物用ddh2o稀释100倍后作为模板dna，usp2换为usp3，反应条件同第二轮反应的一样。反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳对第三轮pcr产物进行检测。
(3)tail-pcr克隆下游基因
反应体系、反应条件同上游基因的克隆，相应的上游特异性引物换为下游特异性引物。反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳对第三轮pcr产物进行检测。
2.6、tail-pcr产物回收
方法同touchdownpcr产物回收。
2.7、tail-pcr产物的连接、转化和测序
方法同touchdownpcr产物的连接、转化和测序。
3、bacillussp.wmn1木聚糖酶基因全长序列
根据tail-pcr克隆得到的保守序列上下游基因的测序结果进行拼接，得到bacillussp.wmn1木聚糖酶基因全长序列。以bacillussp.wmn1的基因组为模板，使用上游引物f1：5′-atggggcacattcatcccct-3′和下游引物r1：5′-ttacgccaagtttgcacgc-3′进行常规pcr，回收pcr产物，与pmd19-t连接，得到pmd19-t-wmn1，并转化e.colidh5α感受态细胞中，得到含bacillussp.wmn1木聚糖酶基因全长的克隆菌株。
(三)实验结果
1、bacillussp.wmn1的基因组提取
使用genray公司的细菌基因组提取试剂盒提取bacillussp.wmn1的基因组，之后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。由图11a可看出基因组的大小在10kb以上，可进行下一步实验。
2、touchdownpcr克隆木聚糖酶基因保守序列结果
2.1、touchdownpcr克隆保守序列的产物
根据已知保守序列设计本次pcr上下游引物，使用touchdownpcr克隆wmn1木聚糖酶基因的保守序列，采用1％琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行检测，结果如图11b所示。在泳道1中，大小约为240bp的条带符合已知的10家族木聚糖酶基因保守序列大小，所以对该条带进行回收。
2.2、木聚糖酶基因保守序列测序结果
通过pcr产物回收、连接、转化、测序等步骤，得到wmn1木聚糖酶基因保守序列的测序结果，其序列如下：
(1)基因序列(243bp)，如seqidno：2所示。
(2)编码的氨基酸(81个)，如seqidno：3所示。
2.3、ncbi氨基酸序列比对结果
将该氨基酸序列在ncbi数据库上进行比对(blast)，发现该保守序列与同为10家族的木聚糖酶jonesiadenitrificans具有83％的相似性，可推断克隆的保守序列所在的基因属于10家族木聚糖酶基因。
3、tail-pcr克隆木聚糖酶基因保守序列上游基因结果
3.1、tail-pcr克隆保守序列上游基因的产物
通过3个嵌套的上游特异性引物和随机引物ad进行tail-pcr，克隆出wmn1木聚糖酶基因保守序列的上游基因，其pcr产物电泳图如图11c所示。从图中可以看出，经过3轮pcr，此时出现的明显条带只有一条，大小约为750bp，符合目标基因大小要求，初步确定为保守序列上游基因，将其回收用于测序。
3.2、保守序列上游基因测序结果
经过测序，wmn1木聚糖酶基因保守序列上游基因测序结果如seqidno：4所示(711bp)，其中，1～20bp为usp3。
4、tail-pcr克隆木聚糖酶基因保守序列下游基因结果
4.1、tail-pcr克隆保守序列下游基因的产物
通过3个嵌套的下游特异性引物和随机引物ad进行tail-pcr，克隆出wmn1木聚糖酶基因保守序列的下游基因，其pcr产物电泳图如图11d所示。从图中可以看出，经过3轮pcr，此时出现的明显条带只有一条，大小约为600bp，符合目标基因大小要求，初步确定为保守序列下游基因，将其回收用于测序。
4.2、保守序列下游基因测序结果
经过测序，wmn1木聚糖酶基因保守序列下游基因测序结果如seqidno：5所示(637bp)，其中，1～18bp为dsp3。
5、完整的酶基因序列及其编码的氨基酸序列
5.1、完整的酶基因序列
将上下游tail-pcr的产物测序结果参照保守序列进行拼接，得到wmn1木聚糖酶基因一个以atg开始、以taa结束的完整开放阅读框(orf)，长度为1308bp。其核苷酸序列如seqidno：6所示。
5.2、编码的氨基酸序列
该基因编码的氨基酸个数为435个，氨基酸序列如seqidno：7所示。
5.3、ncbi氨基酸序列比对结果
将该氨基酸序列在ncbi数据库进行比对(blast)，发现该氨基酸序列与同为10家族的木聚糖酶jonesiaquinghaiensis具有83％的相似性，可初步推断编码该氨基酸序列的基因为新的木聚糖酶基因。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>深圳大学
<120>一种嗜碱芽孢杆菌及其产生的碱性木聚糖酶和应用
<160>24
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1456
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>bacillussp.wmn1菌株的16srdna序列
<400>1
cggcagtggcggcgtgctatacatgcaagtcgagcggacagaagggagcttgctcccgga60
tgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactc120
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ctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgag300
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tgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagg420
gaagaacaagtgcgagagtaactgctcgcaccttgacggtacctaaccagaaagccacgg480
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ggagggtcattggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgt660
agcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctg720
taactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtcc780
acgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaa840
cgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacg900
ggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacc960
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gcgcaacccttgatcttagttgccagcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtg1140
acaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctac1200
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aaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgcta1320
gtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgt1380
cacaccacgagagtttgcaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgc1440
cgaagtgacagaggtg1456
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<212>dna
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<220>
<223>wmn1木聚糖酶基因保守序列的核苷酸序列
<400>2
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cag243
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<223>wmn1木聚糖酶基因保守序列编码的氨基酸序列
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servalpheglnargvalleuglyaspglytyrilegluglualaphe
202530
argalaalaargalaalaaspproseralaglnleucysileasnasp
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tyrserthrasptrpileasnalalysserthralailetyrasnleu
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vallysaspphelysgluargglyvalpromethiscysileglyphe
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gln
<210>4
<211>711
<212>dna
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<220>
<223>wmn1木聚糖酶基因保守序列上游基因的核苷酸序列
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<212>dna
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ttgccctggaacgatgactattccacaaaagcggctctcactgaacttgcgacagtgatg1140
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agcggcacgggcaaatcgtcgaacggcaggcgtgcaaacttggcgtaa1308
<210>7
<211>435
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ttacgccaagtttgcacgc19
1.一种嗜碱芽孢杆菌，其特征在于：名称为bacillussp.wmn1，于2020年1月3日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2020007。
2.一种碱性木聚糖酶的制备方法，其特征在于：所述的碱性木聚糖酶按照下述方法制得：
(1)粗酶液的制备
将权利要求1所述的嗜碱芽孢杆菌bacillussp.wmn1在发酵培养基中进行液体发酵，高速冷冻离心，取上清液，过滤，即得粗酶液，用于离子交换层析；
(2)碱性木聚糖酶的分离纯化
(a)碱性木聚糖酶的阴离子交换层析
离子交换层析介质为deaesepharosefastflow；缓冲液体系为ph8.0的tris-hcl缓冲液，平衡液为ph8.0的tris-hcl缓冲液，洗脱液为含naclph8.0的tris-hcl缓冲液；取60ml介质小心灌入规格为φ1.6cm×40cm的层析柱中，使得凝胶均匀且无气泡；用3～5倍柱体积的平衡液进行平衡，待a280稳定后取粗酶液上样，穿透峰出现之后进行盐浓度梯度洗脱，分别收集不同盐浓度梯度洗脱出来的峰，检测各个峰的木聚糖酶酶活；使用10kda的超滤管将具有酶活性峰的洗脱液进行浓缩脱盐，得到碱性木聚糖酶的酶液，即浓缩酶液；
(b)碱性木聚糖酶的凝胶过滤
使用预装柱superdex75将进行过阴离子交换层析的酶液再次进行分离；缓冲液体系为ph8.0的tris-hcl缓冲液，用3～5倍体积缓冲液将a280基线冲洗至稳定状态后，取适量步骤(a)获得的浓缩酶液上样，再用1个体积将样品进行洗脱，并收集洗脱峰液，即纯酶液。
3.根据权利要求2所述的碱性木聚糖酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的液体发酵的条件为在37℃，200rpm的培养条件下发酵5d。
4.根据权利要求2所述的碱性木聚糖酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的高速冷冻离心的条件为于4℃，12000rpm高速冷冻离心25min。
5.根据权利要求2所述的碱性木聚糖酶的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的过滤为经0.45μm滤膜过滤。
6.权利要求1所述的嗜碱芽孢杆菌在造纸、洗涤工业中的应用。
技术总结