本发明涉及微生物培养技术领域，具体的，本发明涉及。
背景技术：
放线菌(actinomyces)是具有分枝状菌丝体的革兰阳性菌，放线菌可作为抗生素、维生素、酶和酶抑制剂的产生菌，是一类具有重要经济价值和多种用途的微生物。但目前人们分离到的放线菌仅占土壤中所有放线菌的10％左右。而自然界中，绝大多数都是通过传统培养方法无法分离得到的未培养微生物。寻找适用于放线菌的分离方法是挖掘未培养微生物资源，发现放线菌新种属和新活性物质产生菌的重要途径之一,开发新的微生物培养技术在增加微生物的可培养率、理解微生物在环境中功能以及实现资源利用方面具有重要意义。
目前，关于未培养微生物的研究方法虽较多，但由于对未培养微生物“不可培养性”的认识不足，也存在一些缺点：①培养基富营养化，一般认为，大多数微生物生活在寡营养环境中，突然的高浓度营养物质会阻碍微生物的生长；②生长因子缺乏；③在微生物传统分离过程中常采用热处理、化学处理、添加抗生素等方法，以去除环境中占优势但非目标菌株，这样的分离容易破坏微生物生态环境；④忽视微生物间的互作关系，当培养环境从天然生境突变到实验室时，种间的信息交流会发生变化，传统的单细胞培养方法使得微生物群体浓度降低甚至没有，细胞保持“沉睡”状态，无法释放调节信号来抵御环境压力。
近年来，在微生物培养技术以增加微生物的可培养率、理解微生物在环境中功能以及实现资源利用方面的重视，原位培养技术应用而生。原位培养就是在人工培养条件下，将环境微生物放置于扩散室中并使其温育在这些微生物的栖息环境中实现控制。装置中的微生物细胞无法向外扩散，但细胞能够和自然环境建立化学交流，满足细胞之间的相互联系，将难培养的微生物转变成可培养的微生物，从而实现对微生物生长的控制。目前研发出来的原位培养技术有：①扩散室(diffusionchamber)，无须对培养基成分探究，却能提供环境微生物生长所需营养，非常方便。但仍存在一定的局限性，比如扩散室内进行原位培养时，细胞一般会形成肉眼不可见的小菌落，这些菌落就算延长培养时间也难以长大，因此在观察计数方面要求较高，使得检测和分离到纯培养的工作变得费力繁琐，很难做到高通量培养分离，特别是对于放线菌培养分离是很难做到的。另外，扩散室培养微生物的效果也取决于样品的稀释水平，对平板制作和膜材料选择要求也较高，不能破坏微生物生长。②分离芯片(isolationchip)是基于以上问题设计的类似于扩散室的高通量分离装置，这种设计使得大规模分离成为可能，但是也存在分离困难，操作复杂的缺陷，特别对于放线菌的培养分离是客观上存在困难。③trap技术，适合培养丝状放线菌，可在实验室中进行，操作简单，缺点是不能对放线菌选择性分离。
针对于现有国内外放线菌原位培养技术中存在着较多缺点，如：分离过程中采用热处理、化学处理、添加抗生素等方法来去除环境中占优势但非目标菌株；培养出的菌落较小，观察计数要求较高；工作费力繁琐等问题。因此急需一种针对放线菌操作简单便捷、易于计数、保证绝大部分放线菌资源的原位培养方法。
技术实现要素：
针对于现有国内外放线菌原位培养技术中存在着较多缺点，如：分离过程中采用热处理、化学处理、添加抗生素等方法来去除环境中占优势但非目标菌株，培养出的菌落较小，观察计数要求较高，工作费力繁琐等现实客观存在的技术问题，本发明旨在提供一种土壤中放线菌原位培养的方法，通过土壤样品与培养基混合灭菌，制备培养基质，对土样进行稀释后，倒板培养，可以得到由单个放线菌个体生长而成菌落，建立了一种放线菌有效分离方法。该方法可在保证获得绝大部分放线菌资源信息的情况下、有效减少工作量；且该方法中对土样没有进行热处理、化学处理、添加抗生素等方法，去除环境中占优势但非目标菌株，因此避免了常规方法中易破坏微生物生态环境，实现了放线菌的原位培养，增加了可培养放线菌数量。在放线菌分离技术上取得重要进展，在放线菌资源的保护和发展方面具有广泛的适用性。
为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现。
本发明具体提供一种土壤中放线菌原位培养的方法，包括以下步骤：
(1)土样处理：在无菌环境下，取干燥的土样过筛，除去杂物并提高土样密度，收集过筛的土样，密封好备用；
(2)称取步骤(1)制备的未灭菌土样2000-2050份和培养基200-250份，置于离心管中，进行高压高温灭菌，121℃，30min，注意密封，防止水蒸气进入，以免弄湿土样，制备获得培养基质；
(3)稀释：向步骤(2)制备的培养基质中，加入200-300份步骤(1)制备的未灭菌土样，充分混匀；
(4)培养：将步骤(3)稀释过的土样全部倾倒于无菌培养皿中，用无菌涂布器将土样整理平整，按重量百分数计，向培养皿加入30％-50％的无菌水或培养基，用涂布器进行第二次平整，用封口膜密封，防止水分蒸发，25-35℃，培养3-30天。
本发明中，上述步骤(1)中所述的土样过筛，过100目筛，筛网为0.15mm孔径。
本发明中，上述步骤(1)中所述的土样为颗粒较细的土壤，取干燥的土样过筛。
本发明中，上述步骤(1)中所述的土样为土质较硬的土块，先进行研碎成粉末状，再取干燥的土样过筛。
本发明中，上述步骤(1)中所述的土样为泥土水分多的土样，在室温下风干20天后，再取干燥的土样过筛。
本发明中，上述步骤(1)和步骤(4)中所述培养基为琼脂培养基或者r2a培养基或者寡营养固体培养基中的任意一种。
优选的，本发明上述步骤(1)中，所述称取未灭菌的土样2025份和培养基225份，置于离心管中，充分混匀。
本发明中，上述步骤(3)中所述的稀释步骤中，因为土样来源不同，所含微生物丰度、数量不同，所以可以选择适当稀释浓度。
优选的，本发明，所述稀释，向制备的培养基质中，加入250份未灭菌的土样，充分混匀。
本发明中，上述步骤(4)中所述的培养步骤中，培养时间超过10天的培养皿中，加入一个小无菌培养皿，向小无菌培养皿中加入甘油和水，按体积分数比，甘油:水＝1:1，进行保湿。
本发明中，上述步骤(1)制备的未灭菌土样中，如果选取的未灭菌土样肥力较高，可以不加培养基，直接称取未灭菌土样2200-2300份，然后进行高压高温灭菌，121℃，30min，注意密封，防止水蒸气进入，以免弄湿土样，制备获得培养基质。
优选的，本发明采用上述土样肥力较高的未灭菌土样，可以不加培养基，直接称取2250份土样。
通过采用上述提供的技术方案，本发明获得以下有益效果：
本发明提供的一种土壤中放线菌原位培养的方法，通过土壤样品与培养基混合灭菌，提供具有一定营养和粘度的培养基质，对土样进行稀释后，倒板培养，可以得到由单个放线菌个体生长而成菌落，建立了一种放线菌有效分离方法。该方法可在保证获得绝大部分放线菌资源信息的情况下、有效减少工作量；且该方法中对土样没有进行热处理、化学处理、添加抗生素等方法，去除环境中占优势但非目标菌株，因此避免了常规方法中易破坏微生物生态环境，实现了放线菌的原位培养，增加了可培养放线菌数量。在放线菌分离技术上取得重要进展，在放线菌资源的保护和发展方面具有广泛的适用性。
附图说明
图1所示为高钙生土样品中放线菌的原位培养图，其中，a为培养皿整体图，b和c为培养皿局部放大图。
图2所示为盐碱土样中放线菌的原位培养图，其中，a为培养皿整体图，b和c为培养皿局部放大图。
图3所示为沙子土样中放线菌的原位培养图，其中，a为培养皿整体图，b和c为培养皿局部放大图。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下面结合实施例详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。
主要培养基：r2a琼脂成分：琼脂12.0g/l，胰蛋白胨0.25g/l，酸水解酪蛋白0.5g/l，酵母浸粉0.5g/l，可溶性淀粉0.5g/l，磷酸氢二钾0.3g/l，硫酸镁0.1g/l，丙酮酸钠0.3g/l，蛋白胨0.25g/l，葡萄糖0.5g/l；琼脂培养基成分：琼脂12.0g/l；琼脂培养基为：琼脂12.0g/l。
实施例一：
一种土壤中放线菌原位培养的方法，包括以下步骤：
(1)土样处理：在无菌环境下，取干燥的土样过筛，除去杂物并提高土样密度，收集过筛的土样，密封好备用；
(2)称取步骤(1)制备的未灭菌土样2000-2050份和培养基200-250份，置于离心管中，进行高压高温灭菌，121℃，30min，注意密封，防止水蒸气进入，以免弄湿土样，制备获得培养基质；
(3)稀释：向步骤(2)制备的培养基质中，加入200-300份步骤(1)制备的未灭菌土样，充分混匀；
(4)培养：将步骤(3)稀释过的土样全部倾倒于无菌培养皿中，用无菌涂布器将土样整理平整，按重量百分数计，向培养皿加入30％-50％的无菌水或培养基，用涂布器进行第二次平整，用封口膜密封，防止水分蒸发，25-35℃，培养3-30天。
本发明中，上述步骤(1)中所述的土样过筛，过100目筛，筛网为0.15mm孔径。
本发明中，上述步骤(1)中所述的土样为颗粒较细的土壤，取干燥的土样过筛。
本发明中，上述步骤(1)中所述的土样为土质较硬的土块，先进行研碎成粉末状，再取干燥的土样过筛。
本发明中，上述步骤(1)中所述的土样为泥土水分多的土样，在室温下风干20天后，再取干燥的土样过筛。
本发明中，上述步骤(1)和步骤(4)中所述培养基为琼脂培养基或者r2a培养基或者寡营养固体培养基中的任意一种。
本发明中，上述步骤(3)中所述的稀释步骤中，因为土样来源不同，所含微生物丰度、数量不同，所以可以选择适当稀释浓度。
本发明中，上述步骤(4)中所述的培养步骤中，培养时间超过10天的培养皿中，加入一个小无菌培养皿，向小无菌培养皿中加入甘油和水，按体积分数比，甘油:水＝1:1，进行保湿。
本发明中，上述步骤(1)制备的未灭菌土样中，如果选取的未灭菌土样肥力较高，可以不加培养基，直接称取未灭菌土样2200-2300份，然后进行高压高温灭菌，121℃，30min，注意密封，防止水蒸气进入，以免弄湿土样，制备获得培养基质。
实施例二：
在无菌环境下，取干燥的土样过筛，备用；称取土样2000份和培养基250份，置于离心管中，充分混匀；如果土样肥力较高，可以不加培养基，直接称取2250份土样，然后进行高压高温灭菌，121℃，30min，制备获得培养基质；向培养基质中，加入200份未灭菌土样，充分混匀；将混合后的土样全部倾倒于无菌培养皿中，用无菌涂布器将土样整理平整，向培养皿加入30％-50％的无菌水或培养基，用涂布器进行第二次平整，用封口膜密封，防止水分蒸发，25-35℃，培养3-30天。
实施例三：
在无菌环境下，取干燥的土样过筛，备用；称取土样2000份和培养基200份，置于离心管中，充分混匀；如果土样肥力较高，可以不加培养基，直接称取2200份土样，然后进行高压高温灭菌，121℃，30min，制备获得培养基质；向培养基质中，加入200份未灭菌土样，充分混匀；将混合后的土样全部倾倒于无菌培养皿中，用无菌涂布器将土样整理平整，向培养皿加入30％-50％的无菌水或培养基，用涂布器进行第二次平整，用封口膜密封，防止水分蒸发，25-35℃，培养3-30天。
实施例四：
在无菌环境下，取干燥的土样过筛，备用；称取土样2025份和培养基225份，置于离心管中，充分混匀；如果土样肥力较高，可以不加培养基，直接称取2250份土样，然后进行高压高温灭菌，121℃，30min，制备获得培养基质；向培养基质中，加入250份未灭菌土样，充分混匀；将混合后的土样全部倾倒于无菌培养皿中，用无菌涂布器将土样整理平整，向培养皿加入30％-50％的无菌水或培养基，用涂布器进行第二次平整，用封口膜密封，防止水分蒸发，25-35℃，培养3-30天。
实施例五：
在无菌环境下，取干燥的土样过筛，备用；称取土样2050份和培养基250份，置于离心管中，充分混匀；如果土样肥力较高，可以不加培养基，直接称取2300份土样，然后进行高压高温灭菌，121℃，30min，制备获得培养基质；向培养基质中，加入300份未灭菌土样，充分混匀；将混合后的土样全部倾倒于无菌培养皿中，用无菌涂布器将土样整理平整，向培养皿加入30％-50％的无菌水或培养基，用涂布器进行第二次平整，用封口膜密封，防止水分蒸发，25-35℃，培养3-30天。
实施例六：
在无菌环境下，取干燥的土样过筛，备用；称取土样2050份和培养基200份，置于离心管中，充分混匀；如果土样肥力较高，可以不加培养基，直接称取2250份土样，然后进行高压高温灭菌，121℃，30min，制备获得培养基质；向培养基质中，加入300份未灭菌土样，充分混匀；将混合后的土样全部倾倒于无菌培养皿中，用无菌涂布器将土样整理平整，向培养皿加入30％-50％的无菌水或培养基，用涂布器进行第二次平整，用封口膜密封，防止水分蒸发，25-35℃，培养3-30天。
实施例七：
在无菌环境下，取干燥的肥力较高土样过筛，直接称取2250份土样，然后进行高压高温灭菌，121℃，30min，制备获得培养基质；向培养基质中，加入250份未灭菌土样，充分混匀；将混合后的土样全部倾倒于无菌培养皿中，用无菌涂布器将土样整理平整，向培养皿加入30％-50％的无菌水或培养基，用涂布器进行第二次平整，用封口膜密封，防止水分蒸发，25-35℃，培养3-30天。
实施例八：
探究影响土壤中放线菌原位培养菌落个数(y)的三个因素：未灭菌土样添加量(a)、培养基添加量(b)和稀释时未灭菌土样添加量(c)，每组进行5组平行，进行三因素三水平正交实验，正交试验因素与水平表见表1。
试验方案按照实施例四中的方法进行试验，采自新疆五家渠市北部一块无名盐碱地盐碱土样，观察期间生长状态，并统计菌落个数(个)。
表1：正交试验因素与水平表
正交优化土壤中放线菌原位培养菌落个数试验结果及分析见表2所示。
表2：正交试验结果及分析
从表2可以看出，在试验设计的范围内，基质的添加量对土壤中放线菌原位培养的影响最大。结合表1和表2得到最佳优化条件为a2b2c2，即未灭菌土样添加量20.25g、培养基添加量2.25g和稀释时未灭菌土样添加量2.5g。
通过以上实验优化获得土壤中放线菌原位培养的方法：无菌环境下，取干燥的土样过筛，备用；称取未灭菌土样2025份和培养基225份，置于离心管中，充分混匀；如果土样肥力较高，可以不加培养基，直接称取2250份土样，然后进行高压高温灭菌，121℃，30min，制备获得培养基质；向培养基质中，加入250份未灭菌土样，充分混匀；将混合后的土样全部倾倒于无菌培养皿中，用无菌涂布器将土样整理平整，向培养皿加入30％-50％的无菌水或培养基，用涂布器进行第二次平整，用封口膜密封，防止水分蒸发，25-35℃，培养3-30天。
实施例九：
本方案设计8组实验，a组、c组、e组、g组试验方案按照实施例四中的方法进行试验；b组、d组、f组、h组试验方案按照常规放线菌培养方法进行试验；其中a、b组土壤样品：采自新疆吐鲁番交河故城的高钙生土样品，c、d组土壤样品：采自新疆五家渠市北部一块无名盐碱地盐碱土样，e、f组土壤样品：采自一块无名沙地沙子土样，g、h组土壤样品：采自新疆南山土样肥力较高的黑土。培养15天，观察期间生长状态，并统计菌落个数。
表3：不同土壤中放线菌原位培养菌落个数统计及生长状态
参见表3所示，通过放线菌原位培养技术对不同土壤的菌落总数情况调查结果显示：采自新疆吐鲁番交河故城的高钙生土样品，a组通过放线菌原位培养技术，培养出的菌落个数为57个，培养基状态如附图1所示，菌落绝大多数具有典型放线菌菌落形态，个别菌落形态介于放线菌和真菌之间，b组通过常规放线菌培养方法培养获得菌落个数为40个，通过观察培养皿，其真菌，放线菌，细菌菌落混杂生长，较大的真菌菌落和优势生长的细菌菌落覆盖了其他菌落，对于放线菌的辨识和分离造成困难；c组通过放线菌原位培养技术，培养出的菌落个数为147个，培养基状态如附图2所示，d组通过常规放线菌培养方法培养获得菌落个数为20个；e组通过放线菌原位培养技术，培养出的菌落个数75个，培养基状态如附图3所示，f组通过常规放线菌培养方法培养获得菌落个数为35个；g、h两组的土壤采自土壤肥力较高的黑土，试验过程中直接称取2250份土样进行灭菌，未添加培养基，后续操作相同，试验结果g组通过放线菌原位培养技术，培养出的菌落个数172个，h组通过常规放线菌培养方法培养获得菌落个数为43个。通过以上八组的试验，可以明显看出通过放线菌原位培养技术培养的a组、c组、e组、g组，获得菌落个数明显多于常规放线菌培养方法获得菌落个数，且通过线菌原位培养技术培养的菌落绝大多数具有典型放线菌菌落形态，菌落生长状态良好，菌落形态多样，放线菌菌落丰度明显高于常规培养方法的丰度。试验结果表明利用本申请提供的放线菌原位培养方法可以有效提高放线菌的菌落个数，并在保证获得绝大部分放线菌资源信息的情况下、有效减少工作量；且该方法中对土样没有进行热处理、化学处理、添加抗生素等方法，去除环境中占优势但非目标菌株，因此避免了常规方法中易破坏微生物生态环境，实现了放线菌的原位培养,增加了可培养放线菌数量。在放线菌分离技术上取得重要进展，在放线菌资源的保护和发展方面具有广泛的适用性。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
1.一种土壤中放线菌原位培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）土样处理：在无菌环境下，取干燥的土样过筛，除去杂物并提高土样密度，收集过筛的土样，密封好备用；
（2）称取步骤（1）制备的未灭菌土样2000-2050份和培养基200-250份，置于离心管中，进行高压高温灭菌，121℃，30min，注意密封，防止水蒸气进入，以免弄湿土样，制备获得培养基质；
（3）稀释：向步骤（2）制备的培养基质中，加入200-300份步骤（1）制备的未灭菌土样，充分混匀；
（4）培养：将步骤（3）稀释过的土样全部倾倒于无菌培养皿中，用无菌涂布器将土样整理平整，按重量百分数计，向培养皿加入30%-50%的无菌水或培养基，用涂布器进行第二次平整，用封口膜密封，防止水分蒸发，25-35℃，培养3-30天。
2.根据权利要求1所述的一种土壤中放线菌原位培养的方法，其特征在于，上述步骤（1）中所述的土样过筛，过100目筛，筛网为0.15mm孔径。
3.根据权利要求1所述的一种土壤中放线菌原位培养的方法，其特征在于，上述步骤（1）中所述的土样为颗粒较细的土壤，取干燥的土样过筛。
4.根据权利要求1所述的一种土壤中放线菌原位培养的方法，其特征在于，上述步骤（1）中所述的土样为土质较硬的土块，先进行研碎成粉末状，再取干燥的土样过筛。
5.根据权利要求1所述的一种土壤中放线菌原位培养的方法，其特征在于，上述步骤（1）中所述的土样为泥土水分多的土样，在室温下风干20天后，再取干燥的土样过筛。
6.根据权利要求1所述的一种土壤中放线菌原位培养的方法，其特征在于，上述步骤（1）中，所述称取未灭菌的土样2025份和培养基225份，置于离心管中，充分混匀。
7.根据权利要求1所述的一种土壤中放线菌原位培养的方法，其特征在于，上述步骤（3）中所述的稀释步骤中，因为土样来源不同，所含微生物丰度、数量不同，所以可以选择适当稀释浓度。
8.根据权利要求7所述的一种土壤中放线菌原位培养的方法，其特征在于，所述稀释，向制备的培养基质中，加入250份未灭菌的土样，充分混匀。
9.根据权利要求1所述的一种土壤中放线菌原位培养的方法，其特征在于，上述步骤（1）和步骤（4）中所述培养基为琼脂培养基或者r2a培养基或者寡营养固体培养基中的任意一种。
10.根据权利要求1所述的一种土壤中放线菌原位培养的方法，其特征在于，上述步骤（4）中所述的培养步骤中，培养时间超过10天的培养皿中，加入一个小无菌培养皿，向小无菌培养皿中加入甘油和水，按体积分数比，甘油:水=1:1，进行保湿。
技术总结