本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及柠檬明串珠菌及其在沉淀淀粉浆液中的应用。
背景技术：
：目前甘薯淀粉生产的方法有酸浆法和旋流法，由酸浆法得到的甘薯淀粉为原料制取的粉丝具有较好的品质。酸浆法生产甘薯淀粉是我国劳动人民在长期生产实践中发明的一种生产方法。酸浆是由淀粉乳液自然发酵形成的一种微酸、乳白色液体。酸浆主要被用于甘薯淀粉加工过程中的沉淀环节，通过加入酸浆可加速淀粉沉淀，从而使淀粉与蛋白质分离，提高淀粉纯度。然而，传统的酸浆法生产淀粉多数靠经验，并经常会受到一些条件影响，诸如空气中菌群的种类和数量、加工地的温度、生产用水中的金属成分、甘薯表皮的菌群含量及酸浆的酸度和其他人为因素。因此，酸浆质量极不稳定，在一定程度上影响到淀粉的生产效率和产品质量。因此，目前适用于淀粉沉淀的微生物仍有待研究。技术实现要素：本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种高效絮凝沉淀淀粉的柠檬明串珠菌，其可以快速且充分地沉淀淀粉，提高淀粉生产效率，应用前景广泛。为此，在本发明的一个方面。本发明提出了一种微生物。根据本发明的实施例，所述微生物为柠檬明串珠菌（leuconostoccitreumwsj-57），于2019年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.19201，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。发明人发现，该柠檬明串珠菌对淀粉浆液具有较好的絮凝率和淀粉得率，可以快速且充分地沉淀淀粉，从而提高淀粉生产效率，应用前景广泛。在本发明的另一方面，本发明提出了一种发酵液。根据本发明的实施例，所述发酵液含有前面所述微生物。如前所述，根据本发明实施例的微生物对淀粉浆液具有较好的絮凝率和淀粉得率，由此，将其制成纯菌发酵液，可以快速且充分地沉淀淀粉，从而提高淀粉生产效率，应用前景广泛。在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述微生物或发酵液在沉淀淀粉浆液中的应用。如前所述，根据本发明实施例的微生物或发酵液对淀粉浆液具有较好的絮凝率和淀粉得率，可以快速且充分地沉淀淀粉，从而提高淀粉生产效率，应用前景广泛。在本发明的又一方面，本发明提出了一种沉淀淀粉浆液的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述微生物或前面所述发酵液与淀粉浆液混合及静置处理。如前所述，该柠檬明串珠菌具有较好的絮凝率和淀粉得率，因此，将其与淀粉浆液进行混合及静置，可以快速且充分地沉淀淀粉，从而使淀粉得到纯化。由此，根据本发明实施例的沉淀淀粉浆液的方法操作简便、效率高、成本低，适于规模化生产。根据本发明的实施例，所述发酵液中微生物浓度为1×109~5×109cfu/ml，所述淀粉浆液中淀粉浓度为10~40g/l，所述发酵液与所述淀粉浆液的体积比为1：（10~15）。发明人经过大量实验得到上述条件，由此，足量的柠檬明串珠菌与淀粉接触，从而充分地将淀粉沉淀下来，进一步提高淀粉得率。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了根据本发明一个实施例的柠檬明串珠菌沉淀淀粉浆液1min时处理组与对照组效果示意图；图2显示了根据本发明一个实施例的柠檬明串珠菌沉淀淀粉浆液3min时处理组与对照组效果示意图；图3显示了根据本发明一个实施例的柠檬明串珠菌沉淀淀粉浆液15min时处理组与对照组效果示意图；图4显示了根据本发明一个实施例的sj-57菌株基因序列系统发育树；图5显示了根据本发明一个实施例的biolog自动微生物分析系统鉴定结果分析示意图；图6显示了根据本发明一个实施例的sj-57菌株在mrs琼脂培养基的菌落形态。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1一、分离纯化乳酸菌1.取10ml自然发酵的甘薯酸浆于90ml无菌生理盐水中混匀，制成梯度稀释样品悬液，梯度依次为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。2.以mrs培养基为选择性培养基，分别取各梯度稀释液200ul均匀涂布于mrs琼脂培养基上，于37℃培养48h，获得单菌落。3.以10-4、10-5、10-6的平板为筛选对象，挑取形态不同的有代表性的单个纯菌落，利用之字划线、三区划线继续纯化所获得单菌落2次，共计纯化出74株单菌落，挑取单菌落于mrs肉汤，在37℃下培养48h。4.对纯化的菌液进行编号sj-1~74，在无菌条件下将菌液与已灭菌的50%浓度甘油1:1等体积混合于冻存管中，甘油终浓度为25%，置于-80℃冰箱保存。5.mrs琼脂培养基组成成分：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉8.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04g，琼脂14.0g，吐温801.0g，ph值6.5±0.2，用水定容至1l。6.mrs肉汤培养基组成成分：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉8.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04g，吐温801.0g，ph值6.5±0.2，用水定容至1l。二、筛选高效絮凝沉淀淀粉菌种1.对编号sj-1~74各菌株进行活化，复壮，接种扩大培养，具体操作为：用无菌接种环沾取甘油管中菌液，采用之字、三区划线法于mrs琼脂培养基，37℃培养48h，挑取单菌落于mrs肉汤37℃纯培养48h，此菌液为种子液。吸取种子培养液，按照1%体积比接种于10mlmrs肉汤扩大培养，获得纯菌发酵液，各菌种培养至稳定期，控制菌液浓度在1.2×109cfu/ml。2.以絮凝率、淀粉得率为筛选指标，向25ml25g/l甘薯淀粉乳液中加入2ml纯菌液，摇匀后静置沉淀20min，计算各菌株对淀粉浆液的絮凝率和淀粉得率，筛选出絮凝沉淀淀粉活性最高的菌株。3.淀粉浆液的絮凝率测定方法如下：用蒸馏水和甘薯淀粉配置25ml25g/l淀粉浆液两份，一份用作对照，另一份用作处理。将菌液摇匀分成两份，一份向处理淀粉浆液中加入2ml该菌液，上下摇匀1min，静置20min，在距离液面下1cm处取上清液，在可见分光光度仪上测其吸光度，波长选择550nm，此为处理样品，记作a2；另一份菌液先进行灭活，离心得到菌体弃去上清液，再向其中添加相同体积的新鲜mrs肉汤，形成对照菌液，取2ml加入到对照淀粉浆液中，其余步骤同处理样品，测得的吸光度记作a1。絮凝率的计算公式如下：fr=(a1-a2)/a1×100%其中，a1代表对照上清液的od550，a2代表处理上清液od550。4.淀粉得率的测定方法如下：用蒸馏水和甘薯淀粉配置25ml25g/l淀粉浆液，向淀粉浆液中添加2ml发酵液，上下摇匀1min，静置沉淀20min，弃去此时淀粉浆液的上清液，将沉淀的淀粉于烘箱中恒重3h，取出在干燥器中冷却至室温，称量，再放回烘箱中恒重0.5h，冷却称量，直至前后质量差小于0.002g。计算公式如下：淀粉得率=沉淀淀粉质量（干基）/淀粉乳中淀粉质量（干基）×100%5.筛选过程中发现共有7株菌株对淀粉浆液具有絮凝沉淀效果，根据表1结果可以看出，sj-57菌液的絮凝率和淀粉得率均为最高。图1-3分别记录了添加了sj-57菌液的淀粉浆液和添加了对照菌液的淀粉浆液在沉淀1min、3min、15min时的情况，从图中也可以看出，添加了sj-57菌液的淀粉浆液底部沉降的淀粉明显多于对照样品。表1由甘薯酸浆分离出的7株具有高絮凝活性菌株的絮凝率和淀粉得率菌株编号sj-5sj-14sj-36sj-45sj-46sj-48sj-57絮凝率.18±3.4528.74±5.6927.36±2.7831.52±9.9847.78±2.4833.23±0.0655.56±2.96淀粉得率q.45±0.0275.01±1.1374.42±0.1575.08±0.7780.07±0.0277.66±0.6684.57±0.07三、鉴定sj-57菌株1.对分离的sj-57进行分子鉴定，以sj-57基因组dna为模板，采用细菌16srrna基因通用引物进行pcr扩增。具体测序步骤如下：(1)菌株基因组dna的提取，采用细菌基因组dna提取试剂盒。(2)pcr扩增：采用细菌16srrna基因通用引物：27f：agagtttgatcctggctcag；1492r：ggctaccttgttacgactt。反应程序为：95℃预变性10min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环后，72℃延伸10min，4℃保存。(3)凝胶电泳：使用1%琼脂糖电泳，在150v、100ma处理20min之后进行电泳观察。(4)纯化回收：对目的条带进行切割，对回收产物进行测序。2.将测得的16srrna基因序列在ncbi核酸数据库进行blast搜索，与数据库中已有序列进行同源性比对，样本测序拼接结果为：atctgacttagacggctcctcccgaaggttaggccaccggctttgggcattacaaactcc60catggtgtgacgggcggtgtgtacaagacccgggaacgtattcaccgcggcgtgctgatc120cgcgattactagcgattccgacttcgtgcagtcgagttgcagactgcagtccgaactgag180acgtactttaagagattagctcaccttcgcaggttggcaactcgttgtatacgccattgt240agcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatctgacgtcgtccccgccttcct300ccggtttgtcaccggcagtctcgctagagtgcccaactgaatgctggcaactaacaataa360gggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacgaccat420gcaccacctgtcactttgtctccgaagagaacacttctatctctaaaagcttcaaaggat480gtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttg540tgcgggtccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggaat600acttaatgcgttagcttcggcactaagaggcggaaacctcctaacacctagtattcatcg660tttacggtgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctacccacactttcgagcctca720acgtcagttgttgtccagtaagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgca780ttccaccgctacacatggagttccacttacctctacaacactcaagttaaccagtttcca840atgccattccggagttgagctccgggctttcacatcagacttaatcaaccgtctgcgctc900gctttacgcccaataaatccggataacgctcgggacatacgtattaccgcggctgctggc960acgtatttagccgtccctttctggtatggtaccgtcaaactaaaatcattccctatttta1020gcatttcttcccatacaacagtgctttacgacccgaaagccttcatcacacacgcggcgt1080tgctccatcaggcttgcgcccattgtggaagattccctactgcagcctcccgtaggagtt1140tgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgatcagtctctcaactcggctatgcatcatcg1200tcttggtaagcctttaccccaccaactaactaatgcaccgcggatccatctctaggtgac1260gccgtagcgccttttaacttgatatcatgcgatactaagttttattcggtattagcatct1320gtttccaaatgttatccccagccttgaggcaggttatccacgtgttactcacccgttcgc1380cactcgcttgaaaggtgcaagcacctctcgctgcgcgtcgactgcatgtatagccccccc1440cc1442同源性分析结果表明，该序列与柠檬明串珠菌leuconostoccitreum内各种之间有极高的同源性，同源性大于99％。同时，发明人对表1中的其他菌株的16srrna基因序列进行比对分析，鉴定出sj-5为融合魏斯氏菌weissellaconfusa，sj-14为肠膜明串珠菌leuconostocmesenteroides，sj-36为肠膜明串珠菌leuconostocmesenteroides，sj-45为肠膜明串珠菌leuconostocmesenteroides，sj-46为贺氏明串珠球菌leuconostocholzapfelii，sj-48为肠膜明串珠菌leuconostocmesenteroides。3.从genbank中选择近缘菌株的16srrna基因序列，应用软件mega7进行clustalw多重比对，采用neighbour-joining方法构建系统发育树，并进行bootstrap分析，重复次数为1000次。结果如图4，从系统发育树中可以看出，sj-57与两株柠檬明串珠菌leuconostoccitreum的属于同一族群，同源性达97%。4.利用biolog自动微生物分析系统对sj-57菌株进行鉴定。结果如图5，经过该系统鉴定，sj-57与柠檬明串珠菌leuconostoccitreum相似度达87.3%。综合以上鉴定结果，最终sj-57菌株鉴定为一株柠檬明串珠菌，命名为leuconostoccitreumwsj-57。图6为该菌株在mrs琼脂培养基的菌落形态。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。sequencelisting<110>中国农业大学，泗水利丰食品有限公司<120>柠檬明串珠菌及其在沉淀淀粉浆液中的应用<130>pidc3200483<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>1<400>1agagtttgatcctggctcag20<210>2<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>2<400>2ggctaccttgttacgactt19<210>3<211>1442<212>dna<213>artificialsequence<220><223>3<400>3atctgacttagacggctcctcccgaaggttaggccaccggctttgggcattacaaactcc60catggtgtgacgggcggtgtgtacaagacccgggaacgtattcaccgcggcgtgctgatc120cgcgattactagcgattccgacttcgtgcagtcgagttgcagactgcagtccgaactgag180acgtactttaagagattagctcaccttcgcaggttggcaactcgttgtatacgccattgt240agcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatctgacgtcgtccccgccttcct300ccggtttgtcaccggcagtctcgctagagtgcccaactgaatgctggcaactaacaataa360gggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacgaccat420gcaccacctgtcactttgtctccgaagagaacacttctatctctaaaagcttcaaaggat480gtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttg540tgcgggtccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggaat600acttaatgcgttagcttcggcactaagaggcggaaacctcctaacacctagtattcatcg660tttacggtgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctacccacactttcgagcctca720acgtcagttgttgtccagtaagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgca780ttccaccgctacacatggagttccacttacctctacaacactcaagttaaccagtttcca840atgccattccggagttgagctccgggctttcacatcagacttaatcaaccgtctgcgctc900gctttacgcccaataaatccggataacgctcgggacatacgtattaccgcggctgctggc960acgtatttagccgtccctttctggtatggtaccgtcaaactaaaatcattccctatttta1020gcatttcttcccatacaacagtgctttacgacccgaaagccttcatcacacacgcggcgt1080tgctccatcaggcttgcgcccattgtggaagattccctactgcagcctcccgtaggagtt1140tgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgatcagtctctcaactcggctatgcatcatcg1200tcttggtaagcctttaccccaccaactaactaatgcaccgcggatccatctctaggtgac1260gccgtagcgccttttaacttgatatcatgcgatactaagttttattcggtattagcatct1320gtttccaaatgttatccccagccttgaggcaggttatccacgtgttactcacccgttcgc1380cactcgcttgaaaggtgcaagcacctctcgctgcgcgtcgactgcatgtatagccccccc1440cc1442当前第1页1 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技术特征：1.一种微生物，其特征在于，为柠檬明串珠菌（leuconostoccitreumwsj-57），于2019年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.19201。
2.一种发酵液，其特征在于，含有权利要求1所述的微生物。
3.权利要求1所述微生物或权利要求2所述发酵液在沉淀淀粉浆液中的应用。
4.一种沉淀淀粉浆液的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述微生物或权利要求2所述发酵液与淀粉浆液混合及静置处理。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵液中微生物浓度为1×109~5×109cfu/ml，所述淀粉浆液中淀粉浓度为10~40g/l，所述发酵液与所述淀粉浆液的体积比为1：（10~15）。
技术总结本发明提出了一种微生物，其为柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum WSJ‑57），于2019年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19201。本发明的柠檬明串珠菌可以快速且充分地沉淀淀粉，提高淀粉生产效率，应用前景广泛。
技术研发人员：廖小军;赵靓;王永涛;王轩;孔宪奎;陈红岩;王学强;李广华
受保护的技术使用者：中国农业大学;泗水利丰食品有限公司
技术研发日：2020.04.29
技术公布日：2020.06.09
