本发明涉及一种基因工程大肠杆菌及制备方法和吲哚-3-乙酸的生产方法。
背景技术：
吲哚-3-乙酸(indole-3-aceticacid,iaa),化学式c10h9no2，又称为植物生长素，是植物生长和发育过程中必不可少的一种植物激素。iaa可以激发和调控植物体内众多生化过程，比如通过刺激细胞分裂调节植物分生组织以形成横向不定根等新器官；促进细胞伸长来促进器官的分化和形成；维持植物的向光性、向地性和极性运输；控制植物代谢和衰老；对病原菌、干旱、重金属及其螯合物的胁迫缓解和作出应答等。此外，生长素还可以通过与其他激素的相互作用调节植物修复等其他生理活动。
植物除了通过自身合成获得iaa外，还可以通过如植物中的内生菌等多种微生物来产生iaa，如假单胞菌(pseudomonassp.)、固氮菌(azotobactersp.)和固氮螺菌(azospirillumsp.)等。
目前，国内外对iaa生产提取的研究主要集中在植物中提取和微生物合成方面。cn101914053b公开了一种从海藻中制备吲哚乙酸的方法，其通过将海藻浸泡、大孔树脂吸附、解吸、浓缩、高速逆流色谱纯化、结晶等步骤获得iaa。cn102888375b公开了一株能促进兰花组培苗生长及种子萌发的具有分泌吲哚乙酸iaa功能的分枝杆菌(mycobacteriumavium)mya-zh01。该菌株来源于蝴蝶兰花梗，经分离、纯化获得。cn106754516a公开了一株具有分泌iaa能力的内生细菌(lysinibacillusendophyticus)c9t，为酪氨酸芽孢杆菌属新种，其通过可培养方法，经分离、筛选、基因测序、培养等步骤获得，该菌株分泌生长素能力为10.2mg/l。
转基因技术也逐渐应用在iaa合成中，例如将特定的基因转入到受体细胞中，使得受体细胞具备iaa合成路径。cn104388369b公开了一种高产吲哚-3-乙酸的重组细胞解淀粉芽孢杆菌菌株sqr9-e和重组枯草芽孢杆菌菌株168-e。通过将吲哚-3-乙酸合成的三种相关蛋白合成基因重组至受体细胞基因，使得受体iaa合成能力得到提高。还有一种方法是将具备iaa合成路径的载体导入特定植物中，使得植物的具备iaa生成能力，或植物iaa分泌能力获得提高，如ep03254645.9公开了一种基因导入植物的载体，该载体包括所需基因和可选标记基因，所述标记基因包括该基因包括编码生长素前体合成生长素的酶的基因吲哚乙酸水解酶iaah基因和异戊烯基转移酶ipt基因，并且不含色氨酸单加氧酶iaam基因。
植物和特定细菌的iaa生物合成受到复杂的环境胁迫调节，包括ph、渗透胁迫和碳限制等，另外iaa各个合成途径基因的表达方式以及转录调节因子也会限制iaa的合成，所以植物或内生菌株中自发合成iaa的量很少。
近年来，生物催化方法取得快速进展，其具有工艺简单、生产周期短、易于放大等优势，有望成为大规模生产iaa的理想途径。但是，现有技术中缺少相关途径的探索和研究，本领域内仍然需要生物合成iaa的新方法。
技术实现要素：
本发明的一个目的在于提供一种基因工程大肠杆菌，其具有产生色氨酸-2-单加氧酶iaam和酰胺酶ami1的能力。
本发明的另一个目的在于提供上述基因工程大肠杆菌的制备方法。
本发明再一个目的在于提供一种吲哚-3-乙酸(iaa)的生产方法，其利用上述基因工程大肠杆菌进行iaa的生物合成。
一方面，本发明提供一种基因工程大肠杆菌，其包含色氨酸-2-单加氧酶iaam基因和酰胺酶ami1基因，且所述色氨酸-2-单加氧酶iaam基因和酰胺酶ami1基因能够在所述基因工程大肠杆菌的胞内表达，形成具有活性的色氨酸-2-单加氧酶iaam和具有活性的酰胺酶ami1。
根据本发明的基因工程大肠杆菌，优选地，所述iaam基因为来自丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)的iaam基因；所述ami1基因为来自拟南芥(arabidopsisthaliana)的ami1基因；所述基因工程大肠杆菌源自大肠杆菌(escherichiacoli)mg1655。
根据本发明的基因工程大肠杆菌，优选地，所述iaam基因的碱基序列如seqidno:16所示；所述ami1基因的碱基序列如seqidno:17所示。
另一方面，本发明提供上述基因工程大肠杆菌的制备方法，包括：
使用第一引物从丁香假单胞菌的基因组中扩增得到iaam基因，使用第二引物以ptrc99a质粒载体为模板扩增得到v-iaam载体骨架片段，使用第三引物从拟南芥的基因组中扩增得到ami1基因，然后以无缝连接的方式将iaam基因片段和载体骨架片段v-iaam进行连接，得到重组质粒ptrc-iam；使用第四引物以所述重组质粒ptrc-iam为模板扩增得到v-ami1载体骨架片段，以无缝连接的方式，将所述ami1基因片段和所述v-ami1载体骨架片段进行连接，得到重组质粒ptrc-iaa；以所述ami1基因为模板，使用第五引物扩增出携带有tac启动子的序列ami1-tac片段；以所述重组质粒ptrc-iaa为模板，使用第六引物扩增出ptrc-iaa载体骨架片段；以无缝连接的方式，将所述ami1-tac片段和所述ptrc-iaa载体骨架片段进行连接，得到重组质粒ptrc2-iaa；
采用氯化钙法制备化学感受态的大肠杆菌；
使用热激转化的方式将重组质粒ptrc2-iaa转化至化学感受态的大肠杆菌。
根据本发明的制备方法，优选地，所述第一引物对中各引物的序列分别如seqidno:1和seqidno:2所示；所述第二引物对中各引物的序列分别如seqidno:3和seqidno:4所示；所述第三引物对中各引物的序列分别如seqidno:5和seqidno:6所示；所述第四引物对中各引物的序列分别如seqidno:7和seqidno:8所示；所述第五引物对中各引物的序列分别如seqidno:9和seqidno:10所示；所述第六引物对中各引物的序列分别如seqidno:11和seqidno:12所示。
根据本发明的制备方法，优选地，还包括质粒验证步骤，质粒验证使用的引物对中各引物的序列分别如seqidno:13和seqidno:14所示。
再一方面，本发明提供一种吲哚-3-乙酸的生产方法，包括使用如上所述的基因工程大肠杆菌的步骤。
根据本发明的生产方法，优选地，包括以下步骤：
将上述基因工程大肠杆菌在筛选培养基中进行筛选培养，选取长势良好的菌落得到筛选菌株；将获得的筛选菌株在种子培养基中进行种子培养，得到种子液；将种子液按一定的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，获得发酵菌液；向发酵菌液中加入诱导剂进行诱导培养，获得诱导菌体；将诱导菌体与l-色氨酸充分接触，进行全细胞转化，获得吲哚-3-乙酸。
根据本发明的生产方法，优选地，所述诱导剂选自乳糖、阿拉伯糖和异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)其中的一种或多种；所述诱导剂的浓度为0.5～1.5mol/l；诱导培养的温度为20～32℃；所述l-色氨酸以1～5g/l的l-色氨酸溶液的形式使用。
根据本发明的生产方法，优选地，所述诱导剂在发酵菌液的od600＝0.4～1.4时加入到发酵菌液中；所述诱导菌体是以od600＝5～60的浓度与l-色氨酸接触；其中，od600表示含基因工程大肠杆菌的培养基在600nm波长处的吸光值。
本发明通过基因工程的方式将色氨酸-2-单加氧酶iaam基因和酰胺酶ami1基因转化至常规的大肠杆菌中形成基因工程大肠杆菌，其具备产生色氨酸-2-单加氧酶iaam和酰胺酶ami1的能力。进一步地，本发明利用该基因工程大肠杆菌，通过全细胞催化的手段将特定底物转化为iaa。该方法的反应条件温和。此外，产物易于分离、反应规模可放大。
附图说明
图1为本发明的ptrc2-iaa质粒载体的构建示意图。
图2为本发明的l-色氨酸转化为iaa的过程图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
本发明中所述的具体方法、步骤以及其中所使用的试剂、材料等，除非另作说明，否则均为本领域内通常已知的，并且也容易地通过公开出版物获知或通过购买获得。具体出版物可参见，例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物等。
＜基因工程大肠杆菌＞
本发明发现将来自于丁香假单胞菌基因组的色氨酸-2-单加氧酶iaam和来自于拟南芥基因组的酰胺酶ami1基因转化到大肠杆菌进行表达，产生具有活性的iaam和ami1，从而可以将底物l-色氨酸转化为吲哚-3-乙酸(iaa)。至少基于上述部分发现完成了本发明。大肠杆菌属于埃希氏菌属，革兰氏阴性菌，是人肠道的普遍寄生菌。它可以在很多类型的培养基上生长，繁殖速度快，一般对人无毒无害。大肠杆菌的基因组约为4.6mb，属于人类最早测序的生物之一。
本发明的基因工程大肠杆菌包含色氨酸-2-单加氧酶iaam基因和酰胺酶ami1基因，且所述iaam基因和ami1基因能够在所述基因工程大肠杆菌的胞内表达，形成具有活性的色氨酸-2-单加氧酶iaam和酰胺酶ami1。
本发明的基因工程大肠杆菌表示对常规的大肠杆菌通过基因重组技术改造得到的菌株。根据本发明的一个实施方式，通过基因重组技术，在那些不具有或缺少iaam和ami1活性的野生型，或其它人工改造大肠杆菌中引入外来物种的基因来使这些基因表达，从而产生或带来增量的iaam和ami1活性，从而获得基因工程大肠杆菌。优选地，常规的大肠杆菌可以为大肠杆菌(escherichiacoli)mg1655，其可购自atcc(保藏编号atcc700926)。这些大肠杆菌属于市售产品，因而不需要额外的保藏证据及遗传资源登记资料。
本发明的iaam基因可以为来源于除了大肠杆菌之外的其他微生物、动物或植物的iaam基因，例如，丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)的iaam基因。iaam基因在基因工程大肠杆菌胞内表达形成具有活性的iaam。根据本发明的一个实施方式，所述iaam基因如seqidno:16所示。
本发明的酰胺酶ami1基因可以为来源于除了大肠杆菌之外的其他微生物、动物或植物的ami1基因，例如，来自于拟南芥(arabidopsisthaliana)的ami1基因。ami1基因在基因工程大肠杆菌的胞内表达形成具有活性的ami1。根据本发明的一个实施方式，所述ami1基因的基因序列如seqidno:17所示。
＜基因工程大肠杆菌的制备方法＞
本发明的基因工程大肠杆菌的制备方法包括构建重组质粒的步骤和转化所述重组质粒至大肠杆菌的步骤。
本发明的质粒是指在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的质粒。所述质粒带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列。所述质粒经扩增后可以与来源于除了大肠杆菌之外的其他微生物、动物或植物的色氨酸-2-单加氧酶iaam基因和酰胺酶ami1基因进行连接，形成重组质粒；所述重组质粒可以被转化至大肠杆菌细胞中进行表达。优选地，本发明中所述质粒为ptrc99a质粒，序列如seqidno:15所示。
在本发明中，构建重组质粒的步骤包括：获取iaam基因、ami1基因的基因片段，获取载体骨架片段v-iaam；将iaam基因片段和载体骨架片段v-iaam进行连接，得到重组质粒ptrc-iam；以ptrc-iam载体质粒为模板扩增得到v-ami1载体骨架片段，将ami1基因片段和v-ami1载体骨架片段进行连接以得到重组质粒ptrc-iaa；以ptrc-iaa载体质粒为模板扩增得到ptrc-iaa载体骨架片段，以ami1基因为模板，扩增得到携带有tac启动子的ami1-tac基因片段；将ptrc-iaa载体骨架片段和ami1-tac基因片段进行连接以得到重组质粒ptrc2-iaa。
在重组质粒ptrc2-iaa中，iaam基因和ami1基因共同构建在载体质粒上，其中基因iaam的启动子为ptrc99a载体上的trac启动子，基因ami1的启动子为tac启动子，两个基因共用同一个trrnb终止子，从而实现所述两个基因共表达的全新载体ptrc2-iaa。
具体地，设计相应的引物从除了大肠杆菌之外的其他微生物、动物或植物的组织中获得iaam基因和ami1基因，设计相应的引物以质粒载体为模板扩增得到v-iaam载体骨架片段，然后以无缝连接的方式将iaam基因片段和v-iaam载体骨架片段进行连接，得到重组质粒ptrc-iam；以重组质粒ptrc-iam为模板，设计相应的引物扩增得到片段v-ami1，以无缝连接的方式，将amil基因片段和载体骨架片段v-ami1进行连接，得到重组质粒ptrc-iaa；以重组质粒ptrc-iaa为模板，设计相应的引物扩增出含有同源片段的ptrc-iaa载体骨架片段；以基因ami1为模板，设计相应的引物扩增出含有同源片段的携带有tac启动子的序列ami1-tac片段，以无缝连接的方式，将amil-tac片段和ptrc-iaa载体骨架片段进行连接以得到重组质粒ptrc2-iaa。
所述无缝连接的方式可以使用nebuilderassemblemix或gibsonassembly无缝连接技术完成。具体连接步骤使用现有技术中已知的那些，这里不再赘述。
根据本发明的一个实施方式，使用第一引物从丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)的基因组中扩增得到iaam基因，使用第二引物以ptrc99a质粒载体为模板扩增得到v-iaam载体骨架，使用第三引物从拟南芥(arabidopsisthaliana)的基因组中扩增得到ami1基因，然后以无缝连接的方式将iaam基因片段和载体骨架片段v-iaam进行连接，得到重组质粒ptrc-iam；使用第四引物以ptrc-iam载体质粒为模板扩增得到片段v-ami1，以无缝连接的方式，将ami1基因片段和载体骨架片段v-ami1进行连接以得到重组质粒ptrc-iaa；以基因ami1为模板，使用第五引物扩增出含有同源片段的携带有tac启动子的序列ami1-tac片段；以载体ptrc-iaa为模板，使用第六引物扩增出含有同源片段的ptrc-iaa载体骨架片段；以无缝连接的方式，将ami1-tac片段和载体片段ptrc-iaa进行连接以得到重组质粒ptrc2-iaa。
根据本发明的另一个实施方式，所述第一引物对中各引物的序列分别如seqidno:1和seqidno:2所示；所述第二引物对中各引物的序列分别如seqidno:3和seqidno:4所示；所述第三引物对中各引物的序列分别如seqidno:5和seqidno:6所示；所述第四引物对中各引物的序列分别如seqidno:7和seqidno:8所示；所述第五引物对中各引物的序列分别如seqidno:9和seqidno:10所示；所述第六引物对中各引物的序列分别如seqidno:11和seqidno:12所示。
在本发明中，优选地，每形成一个新的重组质粒，都有一个转化至大肠杆菌并验证的步骤，以确定目的基因已经被构建至目标质粒载体上。例如，根据本发明的一个实施方式，iaam基因和载体骨架片段v-iaam混合连接以获得ptrc-iam载体的步骤，先加入无缝连接组装技术的酶试剂，在50℃水浴条件下反应30分钟，然后热激转化至化学感受态的e.colimg1655并验证，获得构建成功的ptrc-iam载体。热激转化的步骤可包括大肠杆菌化学感受态的制备和质粒转化的步骤。
根据本发明提供的制备方法，所述大肠杆菌化学感受态的制备方法可选自tss法和/或氯化钙法。优选的，使用氯化钙法。所述质粒转化的方法可选自电转化法和/或热激转化法；优选地，使用热激转化法。质粒验证方法可采用本领域内通常使用的任何方法，包括但不限于，pcr扩增验证法、酶切验证法、免疫验证法以及酶活性验证法等。从操作方法及成本节约角度，本发明优选pcr扩增验证法。具体地，提取培养后的大肠杆菌的基因组，并设计相应的引物通过pcr扩增来确认大肠杆菌中是否存在iaam基因和ami1基因。优选地，ptrc2-iaa的形成步骤中，pcr扩增验证法所用的各引物的序列分别如seqidno:13和seqidno:14所示。
＜吲哚-3-乙酸的生产方法＞
本发明的吲哚-3-乙酸(iaa)的生产方法包括使用上述基因工程大肠杆菌的步骤。在某些实施方案中，进一步包括所述iaa的检测步骤。
当iaam基因和ami1基因在基因工程大肠杆菌的胞内表达形成具有活性的色氨酸-2-单加氧酶iaam和酰胺酶ami1时，酶的活性并未对大肠杆菌内的其他代谢途径产生较大影响，大肠杆菌活性保持正常，并且将l-色氨酸转化为iaa。具体过程参见图2。
本发明的生产方法包括以下步骤：
(1)筛选培养；
(2)种子培养；
(3)发酵培养；
(4)诱导培养；和
(5)全细胞转化步骤。
优选地，包括以下步骤：将上述基因工程大肠杆菌在筛选培养基中进行筛选培养，选取长势良好的菌落得到筛选菌株；将获得的筛选菌株在种子培养基中进行种子培养，得到种子液；将种子液中按一定的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，以获得发酵菌液；向发酵菌液中加入诱导剂进行诱导培养，获得诱导菌体；将诱导菌体接入含有底物l-色氨酸的转化液中进行全细胞转化，获得所述产物iaa。
(1)筛选培养：将上述基因工程大肠杆菌在筛选培养基中进行筛选培养，选取长势良好的菌落得到筛选菌株。
在筛选培养阶段，所述筛选培养基可以为含有抗生素的固体培养基；优选为含氨苄青霉素的lb固体培养基。其包括以下组分：酵母粉4～6重量份，胰蛋白胨9～12重量份，nacl9～12重量份、琼脂15～22重量份、氨苄青霉素0.025～0.1重量份，余量为水；ph为7.0～7.5。优选地，所述含氨苄青霉素的lb固体培养基中包括酵母粉4.5～6重量份、胰蛋白胨10～11重量份、nacl10～11重量份、琼脂16～20重量份、氨苄青霉素0.025～0.8重量份，余量为水；ph为7.1～7.4。更优选地，所述含氨苄青霉素的lb固体培养基中包括酵母粉5～5.5重量份、胰蛋白胨10～10.5重量份、nacl10～10.5重量份、琼脂18～20重量份、氨苄青霉素0.025～0.6重量份，余量为水；ph为7.2～7.3。
上述培养基中酵母提取物为菌株提供碳源，胰蛋白胨提供氮源，nacl提供无机盐。采用上述培养基有利于菌株成倍扩增，并且能够抑制杂菌的生长。
筛选培养需在25～37℃恒温条件下培养20～28小时。优选地，温度为25～35℃，培养时间为20～26小时。更优选地，温度为28～33℃，培养时间为20～24小时。
(2)种子培养：将获得的筛选菌株在种子培养基中进行种子培养，得到种子液。
在种子培养阶段，种子培养基可以为含有抗生素的液体培养基；优选为含氨苄青霉素的lb液体培养基，其包括以下组分：酵母粉4～6重量份，胰蛋白胨9～12重量份，nacl9～12重量份，氨苄青霉素0.025～0.1重量份；余量为水；ph为7.0～7.5。优选地，所述含氨苄青霉素的lb液体培养基中包括酵母粉4.5～6重量份、胰蛋白胨10～11重量份、nacl10～11重量份、氨苄青霉素0.025～0.8重量份，余量为水；ph为7.1～7.4。更优选地，酵母粉5～5.5重量份、胰蛋白胨10～10.5重量份、nacl10～10.5重量份、氨苄青霉素0.025～0.6重量份，余量为水；ph为7.2～7.3。采用上述培养基有利于菌株的成倍扩增，并且能够抑制杂菌的生长。
种子培养需要在恒温搅拌的培养条件下进行，从而有利于均匀培养，避免微生物在局部浓度过高，影响生长。种子培养的温度一般控制在25～37℃之间；优选为28～35℃之间；更优选为30～33℃之间。搅拌转速一般为100～300rpm；优选为150～250rpm；优选为180～240rpm。如果转速过低，则培养基的流动性不足，培养基成分以及氧气分布不均；转速过高，则会产生过高的剪切力，进而影响细菌生长，甚至对细菌菌体造成损害。种子培养的时间一般为10～20小时；优选为12～18小时；更优选为12～16小时。
(3)发酵培养：将种子液中按一定的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，以获得发酵菌液。种子液的接种量可以为1～10vol％。
在发酵培养阶段，发酵培养基可以为不含抗生素的lb液体培养基，一般包括以下组分：酵母粉4～6重量份，胰蛋白胨9～12重量份，nacl9～12重量份，余量为水；ph为7.0～7.5。优选地，所述不含抗生素的lb液体培养基中包括酵母粉4.5～6重量份、胰蛋白胨10～11重量份、nacl10～11重量份，余量为水；ph为7.1～7.4。更优选地，所述不含抗生素的lb液体培养基中包括酵母粉5～5.5重量份、胰蛋白胨10～10.5重量份、nacl10～10.5重量份，余量为水；ph为7.2～7.3。采用上述培养基有利于菌株的生长。
发酵培养同样也可以在恒温搅拌的培养条件下进行，从而有利于均匀培养，避免微生物在局部浓度过高，影响生长。发酵培养的温度一般控制在25～37℃之间；优选为28～35℃之间；更优选为30～33℃之间。搅拌转速一般为100～300rpm；优选为150～250rpm；优选为180～240rpm。
(4)诱导培养：向发酵菌液中加入诱导剂进行诱导培养，获得诱导菌体。
加入诱导剂进行诱导培养的时机选择在当菌体生长至对数生长期后期时为宜。在本发明中当od600＝0.4～1.4；优选od600＝0.6～1.3；更优选od600＝0.6～1.2时，向发酵菌液中添加一定浓度的诱导剂诱导目的基因进行表达。所述诱导剂可以选自乳糖、阿拉伯糖和异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)；优选为iptg，因其不被细胞消耗，可以实现持续的表达。iptg对细胞生长存在抑制作用，因此过高的浓度会抑制细菌的生长，过低的浓度则诱导效果不佳。选择适宜的浓度对提高酶蛋白的表达至关重要。在本发明中，iptg的浓度可以为0.5～1.5mol/l；优选为0.7～1.3mol/l；更优选为0.8～1.2mol/l。
酶蛋白诱导表达的效果除了与菌体的浓度有关外，还与培养温度和时间有关。较低的温度有利于酶蛋白的正确折叠。本发明中，诱导培养的温度以20～32℃之间；优选为20～30℃；更优选为20～28℃。培养时间为12～18小时；优选为13～16小时；更优选为14～16小时。将诱导培养的温度和时间控制在上述范围内，可以使菌体充分生长，并且诱导培养的效率最高。
除了温度及加入诱导剂外，诱导培养的条件可以与发酵培养的条件相同。例如，诱导培养也可以在搅拌的条件下进行，从而有利于均匀培养，提高表达效率。诱导培养的搅拌转速一般为100～300rpm；优选为150～250rpm；优选为180～240rpm。
对诱导培养后的菌体进行分离收集，例如，在4℃、4000rpm的条件下对诱导培养后的菌液进行离心，弃上清液，获得所述诱导菌体备用。还可以用缓冲液对获得的诱导菌体进行细胞重悬，以去除培养基的影响。优选地，用tris缓冲液将诱导菌体进行重悬。所述tris缓冲液的浓度可以为30～60mm。优选地，所述tris缓冲液的浓度为40～55mm。更优选地，所述tris缓冲液的浓度为45～50mm。
(5)全细胞转化：将诱导菌体与l-色氨酸接触，充分反应获得产物iaa。具体为：将l-色氨酸和收集的诱导菌体充分接触，进行全细胞转化，使得l-色氨酸在iaam和ami1的作用下被转化为iaa。l-色氨酸可以以1～5g/l的浓度与菌体反应。优选地，l-色氨酸可以以1～4g/l的浓度与菌体反应。更优选地，l-色氨酸可以以2～3g/l的浓度与菌体反应。
全细胞转化同样可以在恒温搅拌的培养条件下进行，从而有利于提高转化效率。全细胞转化的温度一般控制在25～37℃之间；优选为28～35℃之间；更优选为30～33℃之间。搅拌转速一般为100～300rpm；优选为150～250rpm；优选为180～240rpm。转化时间为22～72小时；优选为30-56小时；更优选为40～50小时。这样可以保证转化的效率，提高产物的产量。
在某些实施方案中，本发明的生产方法进一步包括iaa的检测步骤。具体地，使用高效液相色谱法对iaa含量进行测定，定量分析使用c18柱和uv检测器。示例如下：取1.5ml的菌液，8000rpm的条件下离心4分钟，取上清液，将其用0.22μm的滤头过滤到液相瓶中。接着，使用高效液相色谱仪(hplc)对液相瓶中的iaa进行测定。测定条件设定如下：色谱系统为waterse2695高效液相色谱系统，配备waters2998uv检测器。色谱柱为中谱rd-c18，规格4.6×250mm，粒径5μm。流动相采用水(含有0.1vol％的甲酸)和甲醇采用等度洗脱，程序运行时间20分钟。流速1ml/min，进样量10μl。
实施例1
通过在大肠杆菌内构建外源合成iaa生物合成途径，以l-色氨酸作为底物，可以经全细胞催化将l-色氨酸转化为iaa，从而实现利用基因工程大肠杆菌来生产iaa。具体步骤如下：
1.构建ptrc2-iaa重组质粒
使用gibsonassemble(neb公司，美国)无缝连接的方法构建ptrc2-iaa重组质粒。
以丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)的iaam基因序列(seqidno:16)为模板，用第一引物iaam-f(seqidno:1)和iaam-r(seqidno:2)pcr扩增得到来自于丁香假单胞菌的iaam基因；再以ptrc99a质粒(seqidno:15)为模板，使用第二引物v-f-iaam(seqidno:3)和v-r-iaam(seqidno:4)扩增得到带有同源片段的v-iaam载体骨架片段；将扩增出的iaam基因和v-iaam载体骨架片段混合，再加入无缝连接组装技术的酶试剂，在50℃水浴条件下反应30分钟后，热激转化至至化学感受态的e.colimg1655并验证，获得重组质粒ptrc-iam。
以拟南芥(arabidopsisthaliana)的ami1基因序列(seqidno:17)为模板，用第三引物ami1-f(seqidno:5)和ami1-r(seqidno:6)pcr扩增得到来自于拟南芥的ami1基因；再以重组质粒ptrc-iam为模板，使用第四引物v-f-ami1(seqidno:7)和v-r-ami1(seqidno:8)扩增得到v-ami1载体骨架片段；将扩增出的ami1基因和v-ami1载体骨架片段混合，再加入无缝连接酶，50℃水浴条件下反应30分钟后，热激转化至化学感受态的e.colimg1655并验证，构建成重组质粒ptrc-iaa。
以基因amil为模板，使用第五引物tac-f(seqidno:9)和tac-r(seqidno:10)扩增得到携带有tac启动子的ami1-tac基因片段；以重组质粒ptrc-iaa为模板，用第六引物v-f-tac(seqidno:11)和v-r-tac(seqidno:12)pcr扩增得到含有同源片段的ptrc-iaa载体骨架片段；将扩增出的ami1-tac基因和载体骨架片段ptrc-iaa混合，再加入无缝连接酶试剂，50℃水浴条件下反应30分钟后，热激法转化至化学感受态的e.colimg1655并验证，构建成ptrc2-iaa载体。
热激转化并验证的步骤为：
将大肠杆菌(escherichiacoli)mg1655(购自atcc，保藏编号atcc700926)接种至不含抗生素的lb平板培养基上，37℃温度下过夜培养，获得单菌落。挑取长势良好的单菌落接种至3ml的lb液体培养基，在37℃，220rpm的条件下培养12小时。接着，将得到的菌液按1％的接种量接种至50ml的lb液体培养基，在37℃，220rpm的条件下培养。当od600为0.6时，停止培养，迅速将培养物置于冰中冷却。然后，将冷却后的菌液转移至预冷的50ml离心管中，以3500rpm离心10分钟，弃上清液，收集菌体至ep管中。接着，用25ml预冷无菌的0.1mol/l的cacl2冲洗菌体两次，以3500rpm的转速离心10分钟，再次弃上清液，收集菌体。最后，用2ml预冷的0.1mol/l的cacl2(含10wt％甘油)重悬菌体，按每管100μl分装至预冷的1.5ml离心管，得到化学感受态的大肠杆菌，置于-80℃保存待用。
将一管容纳有化学感受态的大肠杆菌的离心管置于冰上，然后加入0.5μl的所述重组质粒，冰浴处理30分钟，用42℃热水浴处理90s，然后立即冰浴处理2分钟。随后，将650μl的lb液体培养基加入容纳有化学感受态的大肠杆菌的离心管内，将离心管置于37℃摇床，150rpm的条件下培养1小时；摇床培养后，500rpm离心2分钟，留少许上清液重悬细胞，并涂布至含有氨苄青霉素的lb平板培养基上，37℃过夜培养。挑取转化子菌落进行pcr验证。将验证通过的菌株置于甘油管中，得到含有所述带转化重组质粒的大肠杆菌，置于-80℃保存待用。
在对重组质粒ptrc2-iaa进行验证时，验证引物的序列为y-f(seqidno:13)和y-r(seqidno:14)，根据电泳结果和测序结果验证载体是否连接成功。将验证通过的菌株置于甘油管中，得到含有ptrc2-iaa质粒的大肠杆菌，置于-80℃保存待用。
2.重组菌体培养及全细胞催化
将含有ptrc2-iaa质粒的大肠杆菌接种至含有氨苄青霉素的lb平板培养基，37℃过夜培养，挑取长势良好的单菌落获得筛选菌株，接种至3ml含有氨苄青霉素的lb液体培养基中进行试管种子培养，在37℃，220rpm下培养12小时，得到种子液。将种子液按1vol％的接种量接种至125ml的lb液体培养基中进行发酵培养。在37℃，220rpm的条件下培养至od600为0.6时，向发酵培养后的菌液中添加1mol/l的iptg进行诱导培养；诱导培养在30℃，220rpm的条件下进行，当od600＝30时，在4℃，4000rpm的条件下进行离心，弃上清液，获得诱导培养后的诱导菌体。将该菌体用50ml的tris缓冲液进行重悬，缓冲液的浓度为50mm，ph为7.5；将缓冲后的菌体倒入250ml的三角瓶中，向三角瓶中加入2g/l的色氨酸进行全细胞催化，催化条件为30℃，220rpm，催化时间为48小时。
3.iaa产量的检测
取1.5ml的菌液，8000rpm的条件下离心4分钟，取上清液，将其用0.22μm的滤头过滤到液相瓶中。接着，使用高效液相色谱仪(hplc)对液相瓶中的iaa进行测定。测定条件设定如下：色谱系统为waterse2695高效液相色谱系统，配备waters2998uv检测器。色谱柱为中谱rd-c18，规格4.6×250mm，粒径5μm。流动相采用水(含有0.1vol％的甲酸)和甲醇采用等度洗脱，程序运行时间20分钟。流速1ml/min，进样量10μl。
经过检测，基因重组的大肠杆菌的iaa最高产量为22mg/l。未经过转化的大肠杆菌则不能合成iaa。
本发明通过简单的基因工程改造方法可以使用大肠杆菌合成iaa。
序列表
<110>福建师范大学
<120>基因工程大肠杆菌及制备方法和吲哚-3-乙酸的生产方法
<160>17
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<213>大肠杆菌（escherichiacoli）
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aaaccggaatttggcccgggtattagcgaacgcattgaagaagccattcgtaccagcgat960
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ctgggcgaaaaaggcgttctggttattccgaccgttccgggcccgccgccgcatctgcaa1080
gcaaatgttgccgcactggaaagttttcgtagtcgcgcctttagtctgctgagtattgca1140
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1.一种基因工程大肠杆菌，其特征在于，该基因工程大肠杆菌包含色氨酸-2-单加氧酶iaam基因和酰胺酶ami1基因，且所述色氨酸-2-单加氧酶iaam基因和酰胺酶ami1基因能够在所述基因工程大肠杆菌的胞内表达，形成具有活性的色氨酸-2-单加氧酶iaam和具有活性的酰胺酶ami1。
2.根据权利要求1所述的基因工程大肠杆菌，其特征在于，所述iaam基因为来自丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)的iaam基因；所述ami1基因为来自拟南芥(arabidopsisthaliana)的ami1基因；所述基因工程大肠杆菌源自大肠杆菌(escherichiacoli)mg1655。
3.根据权利要求1所述的基因工程大肠杆菌，其特征在于，所述iaam基因的碱基序列如seqidno:16所示；所述ami1基因的碱基序列如seqidno:17所示。
4.根据权利要求1～3任一项所述的基因工程大肠杆菌的制备方法，其包括：
使用第一引物从丁香假单胞菌的基因组中扩增得到iaam基因，使用第二引物以ptrc99a质粒载体为模板扩增得到v-iaam载体骨架片段，使用第三引物从拟南芥的基因组中扩增得到ami1基因，然后以无缝连接的方式将iaam基因片段和载体骨架片段v-iaam进行连接，得到重组质粒ptrc-iam；使用第四引物以所述重组质粒ptrc-iam为模板扩增得到v-ami1载体骨架片段，以无缝连接的方式，将所述ami1基因片段和所述v-ami1载体骨架片段进行连接，得到重组质粒ptrc-iaa；以所述ami1基因为模板，使用第五引物扩增出携带有tac启动子的序列ami1-tac片段；以所述重组质粒ptrc-iaa为模板，使用第六引物扩增出ptrc-iaa载体骨架片段；以无缝连接的方式，将所述ami1-tac片段和所述ptrc-iaa载体骨架片段进行连接，得到重组质粒ptrc2-iaa；
采用氯化钙法制备化学感受态的大肠杆菌；
使用热激转化的方式将重组质粒ptrc2-iaa转化至化学感受态的大肠杆菌。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一引物对中各引物的序列分别如seqidno:1和seqidno:2所示；所述第二引物对中各引物的序列分别如seqidno:3和seqidno:4所示；所述第三引物对中各引物的序列分别如seqidno:5和seqidno:6所示；所述第四引物对中各引物的序列分别如seqidno:7和seqidno:8所示；所述第五引物对中各引物的序列分别如seqidno:9和seqidno:10所示；所述第六引物对中各引物的序列分别如seqidno:11和seqidno:12所示。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括质粒验证步骤，质粒验证使用的引物对中各引物的序列分别如seqidno:13和seqidno:14所示。
7.一种吲哚-3-乙酸的生产方法，包括使用如权利要求1～3任一项所述的基因工程大肠杆菌的步骤。
8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述的基因工程大肠杆菌在筛选培养基中进行筛选培养，选取长势良好的菌落得到筛选菌株；将获得的筛选菌株在种子培养基中进行种子培养，得到种子液；将种子液按一定的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，获得发酵菌液；向发酵菌液中加入诱导剂进行诱导培养，获得诱导菌体；将诱导菌体与l-色氨酸充分接触，进行全细胞转化，获得吲哚-3-乙酸。
9.根据权利要求8所述的生产方法，其特征在于：
所述诱导剂选自乳糖、阿拉伯糖和异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)其中的一种或多种；所述诱导剂的浓度为0.5～1.5mol/l；诱导培养的温度为20～32℃；
所述l-色氨酸以1～5g/l的l-色氨酸溶液的形式使用。
10.根据权利要求8所述的生产方法，其特征在于，所述诱导剂在发酵菌液的od600＝0.4～1.4时加入到发酵菌液中；所述诱导菌体是以od600＝5～60的浓度与l-色氨酸接触；其中，od600表示含基因工程大肠杆菌的培养基在600nm波长处的吸光值。
技术总结