本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种食品级嗜热链球菌表达系统及其在酸奶制备中的应用。
背景技术：
随着基因工程技术的不断提高，近年来乳酸菌分子生物学及作用机制的研究取得了重大发展，加之不同乳酸菌菌株基因组测序的完成，为乳酸菌基因工程的发展和遗传操作体系的构建奠定了基础。乳酸菌食品级表达系统的构建及应用已成为该领域研究的前沿和热点。“食品级”系统的定义为：能最大限度应用于食品工业，或产生用在食品中的产物的系统。食品级基因表达系统的基本要求如下：(1)载体必须是食品级的；(2)宿主菌为食品级且可鉴定及稳定的微生物；(3)采用食品级选择标记；(4)采用食品级诱导物。利用食品级基因表达系统有目的、有选择地研制新一代的微生态制剂，直接应用于食品工业和医药保健等领域，因此乳酸菌食品级基因表达系统的研究和开发具有相当大的潜力和意义。
嗜热链球菌作为重要的乳酸菌菌株，被认为是“公认的安全级菌株”。目前广泛用于生产一些重要的发酵乳制品，包括酸奶和奶酪。在发酵的过程中，嗜热链球菌能够产生许多活性物质，包括胞外多糖、细菌素和维生素等。此外，多项研究已经表明，嗜热链球菌也可以作为潜在的益生菌，进入人体之后发挥健康效果、转运活性和一定的胃肠道粘附性。因此，酸奶作为一种传递嗜热链球菌的载体，受到人们的重视。牛奶作为发酵乳制品的原料，其中含有大量的乳糖，嗜热链球菌编码的乳糖透过酶stlacs具有双重作用，一方面将乳糖转进胞内，乳糖经胞内的β-半乳糖苷酶水解成葡萄糖和半乳糖，生成的半乳糖同时由乳糖透过酶stlacs转出到胞外，造成酸奶中半乳糖的积累。
上述乳糖的不彻底分解会造成大量的半乳糖积累，这些半乳糖的存在往往会影响发酵乳制品的品质，如造成马苏里拉奶酪、瑞士硬干酪和切达奶酪的褐变，还限制了半乳糖血症人群对发酵乳制品的食用。
现有技术中降低嗜热链球菌发酵过程中半乳糖的积累的主要方法就是与其它菌株共培养。中国文献《基于乳糖水解酶的乳酸乳球菌乳糖代谢多样性研究》[邓笑颖,杨宇,姜杨等,《食品与发酵工业》,2019年第45卷第21期(总第393期)]公开了利用乳酸乳球菌与嗜热链球菌复配时半乳糖积累现象得到明显减弱，但是该方法必须乳酸乳球菌与嗜热链球菌必须复合使用，限制嗜热链球菌的应用。
目前已报道的嗜热链球菌食品级载体选择标记是胸苷酸合成酶基因thya。胸苷酸合成酶在dna的合成中起关键作用，缺失胸苷酸合成酶基因的菌株在基本培养基中不能生长。sasaki等构建了以thya基因为选择标记的食品级表达载体，用外源的α-淀粉酶(amya)基因在营养缺陷型的嗜热链球菌自发突变体tm1-1中测试了其表达能力，开发了一种用于嗜热链球菌的安全食品级表达系统。但是这种系统的应用需要配制包含胸苷酸的特定培养基，增加了使用成本。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种食品级嗜热链球菌表达系统及其在酸奶制备中的应用，该套嗜热链球菌食品级表达系统表达效果好，系统中所有的dna原件来自于公认的安全的微生物，不含有抗生素筛选标记。
本发明的技术方案如下：
一株食品级宿主嗜热链球菌ch3070的构建，包括如下步骤：
(1)提取嗜热链球菌jim8232(streptococcusthermophilusjim8232)的基因组dna；
(2)以步骤(1)的基因组dna为模板，利用核苷酸序列为seqidno.1和seqidno.2的引物对扩增乳糖透过酶基因stlacs的上游同源臂，利用核苷酸序列为seqidno.3和seqidno.4的引物对扩增乳糖透过酶基因stlacs的下游同源臂；然后利用重叠拼接pcr的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得乳糖透过酶stlacs基因敲除连接臂；
st-lacs-up-f:ggtaccgggccccccctcgagttccaacggaaactggtgctseqidno.1
st-lacs-up-r:ttcggaaacctcctattatttgseqidno.2
st-lacs-down-f:caaataataggaggtttccgaatctatgaacatgactgaaaaaatseqidno.3
st-lacs-down-r:agtggatcccccgggctgcagaagacaattctcttaccattcseqidno.4
(3)使用psti和xhoi对质粒pghost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤(2)中制得的stlacs基因敲除连接臂连接到pghost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌xl-blue1，挑取验证正确的转化子，提取重组质粒；
(4)将步骤(3)得到的重组质粒转化入嗜热链球菌jim8232中，通过转化子培养发生第一次同源交换，利用红霉素进行筛选，然后进行连续传代发生第二次同源交换，筛选红霉素标记丢失的菌株，利用核苷酸序列为seqidno.5和seqidno.6的引物对对红霉素标记丢失的菌株进行检测，扩增出3085bp目的产物的菌体即为乳糖透过酶stlacs基因敲除菌株，命名为嗜热链球菌ch3070；
所得菌株在lm17培养基中失去生长能力；
st-lacs-test-f:tcgtgactatgtgcatccseqidno.5
st-lacs-test-r:gatatcagctggtttcgcseqidno.6
所用的红霉素标记会在后续连续传代中丢失，最终获得的宿主菌不具有红霉素抗性。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，乳糖透过酶stlacs上游同源臂pcr扩增体系如下：
extaqbuffer25μl，dntp4μl，引物st-lacs-up-f2μl，引物st-lacs-up-r2μl，基因组dna1μl，extaq1μl,双蒸水13μl；
pcr扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，乳糖透过酶stlacs下游同源臂pcr扩增体系如下：
extaqbuffer25μl，dntp4μl，引物st-lacs-down-f2μl，引物st-lacs-down-r2μl，基因组dna1μl，extaq1μl,双蒸水13μl；
pcr扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，乳糖透过酶stlacs上游同源臂和下游同源臂连接pcr扩增体系如下：
extaqbuffer25μl，dntp4μl，引物st-lacs-up-f2μl，引物st-lacs-down-r2μl，上游同源臂1μl，下游同源臂1μl，extaq1μl,双蒸水12μl；
pcr扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(3)验证转化子的方法：将连接产物转化入感受态大肠杆菌xl-blue1，涂布于含有250μg/ml红霉素的lb平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/ml红霉素的lb液体培养基中，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用psti和xhoi进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中转化子的培养条件，转化子在含有2.5μg/ml红霉素的sm17平板上进行培养，温度为30℃。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中利用红霉素的筛选条件：重组质粒转化入嗜热链球菌jim8232中，涂布于含有2.5μg/ml红霉素的sm17平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有2.5μg/ml红霉素的sm17液体培养基中，30℃静置培养至od600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换，42℃培养2小时后，涂布于含有2.5μg/ml红霉素的sm17平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中连续传代的培养条件为将第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素的sm17液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的sm17液体培养基中，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中红霉素标记丢失的菌株筛选为将连续传代后的菌液涂布于不含有抗生素的sm17平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于添加和不添加2.5μg/ml红霉素的sm17平板，继续30℃培养，选择在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株即为红霉素标记丢失的菌株。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中sm17培养基每升组分如下：动物蛋白胨2.5g，胰蛋白胨2.5g，大豆蛋白胨5g，牛肉提取物5g，酵母提取物2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，beta-甘油磷酸钠五水合物19g，蔗糖20g，余量水。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，pcr检测体系为：
extaqbuffer25μl，dntp4μl，引物st-lacs-test-f2μl，引物st-lacs-test-r2μl，基因组dna1μl，extaq1μl,双蒸水13μl；
pcr检测反应条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
食品级表达载体pst5240，核苷酸序列如seqidno.7所示。
所述食品级表达载体pst5240包含以下元件：来自于质粒pmg36e的复制元件，来源于嗜热链球菌jim8232菌株的pldh启动子和tldh终止子，以及来源于植物乳杆菌wcfs1的乳糖透过酶lplacs基因；将合成的表达载体pst5240转化入嗜热链球菌ch3070后，其在lm17培养基中的生长情况可以得到恢复。
根据本发明优选的，食品级表达载体pst5240的序列由上海生工生物工程有限公司进行合成。
一种食品级嗜热链球菌表达系统，包含上述食品级宿主嗜热链球菌ch3070和上述食品级表达载体pst5240。
上述食品级嗜热链球菌表达系统中，植物乳杆菌wcfs1的乳糖透过酶lplacs基因是食品级宿主嗜热链球菌ch3070和食品级表达载体pst5240完成互补筛选的食品级标记；食品级宿主嗜热链球菌ch3070是采用同源重组技术敲除嗜热链球菌jim8232基因组上的乳糖透过酶stlacs基因而获得，丧失乳糖利用的能力。
上述食品级嗜热链球菌表达系统在生产异源物中的应用。
上述食品级嗜热链球菌表达系统生产的异源物在酸奶制备中的应用。
根据本发明优选的，所述食品级嗜热链球菌表达系统在制备酸奶过程中表达γ-氨基丁酸的应用，包括以下步骤：
a利用核苷酸序列为seqidno.8和seqidno.9的引物对gad-f和gad-r进行pcr扩增短小乳杆菌cgmcc1366谷氨酸脱羧酶基因gad；
gad-f:gcgcatatggctatgttatatggt；seqidno.8
gad-r:cgcggatccttagtgagtgaatccgtat；seqidno.9
b将步骤a制备的谷氨酸脱羧酶基因gad插入食品级表达载体pst5240多克隆位点，采用电转化法将构建好的载体转入嗜热链球菌ch3070中，筛选，制得转化子；
c将步骤b制得的转化子接种于牛奶中，通过检测发酵酸奶中γ-氨基丁酸的含量控制发酵过程。
本发明的有益效果：
1、本发明涉及一种食品级嗜热链球菌表达系统，该系统具备食品级宿主嗜热链球菌ch3070和食品级表达载体pst5240，且植物乳杆菌乳糖透过酶lplacm基因是宿主和载体可以完成互补筛选的食品级标记。筛选压力只需将培养基中的碳源蔗糖替换为乳糖，在质粒的复制和外源基因的表达过程中无需添加抗生素。
2、本发明涉及的一种食品级嗜热链球菌表达系统，将合成的表达载体pst5240转化入嗜热链球菌ch3070后，lm17培养基中的生长情况不仅得到了恢复，还超过野生型jim8232的菌体量水平，与野生型菌种相比，培养基中半乳糖含量显著降低。
3、本发明涉及的食品级嗜热链球菌表达系统，对异源物的表达产生协同作用，促进γ-氨基丁酸的合成，此外该系统在酸奶发酵中具有良好应用。
附图说明
图1：乳糖透过酶stlacs基因敲除菌株琼脂糖凝胶电泳照片
m为marker，大小从上到下依次为5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp；1为野生型对照；2为基因敲除突变株；
图2：载体pst5240结构示意图
repa和repc为复制元件，pldh为启动子和terminator为终止子，mcs为多克隆位点，以及来自植物乳杆菌的乳糖透过酶lplacs；
图3：不同菌株在lm17培养基中培养24小时生长od值的柱状图
jim8232代表野生型菌株，ch3070代表乳糖透过酶stlacs基因敲除菌株，ch3070 pst5240代表菌株ch3070转化质粒pst5240；
图4食品级载体在酸奶中生产γ-氨基丁酸柱状图
pst5240-gad和pst5250-gad分别表示转化入谷氨酸脱羧酶基因的菌株，pst5240表示转化入空载体的菌株；
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细介绍，但保护范围不限于此。
实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。
本发明实验中使用和涉及到的细菌菌株、质粒、主要材料及试剂：
大肠杆菌xl-blue1感受态细胞:购自北京全式金生物技术有限公司，普通市售已知菌株；
嗜热链球菌jim8232：购自广东环凯微生物科技有限公司，普通市售已知菌株；
短小乳杆菌cgmcc1366：购自广东环凯微生物科技有限公司，普通市售已知菌株；
质粒pghost9：购自biovectorntcc质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心，普通市售产品；
质粒ptvp1gfp：包含绿色荧光蛋白基因，购自biovectorntcc质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心，普通市售产品；
细菌基因组提取试剂盒：购自北京天根生物科技有限公司；
柱式质粒dna小量抽提试剂盒：购自南京诺韦赞生物科技有限公司；
红霉素、琼脂糖、核酸染料等购自上海生工生物工程有限公司；
extaq及rtaq等聚合酶、限制性内切酶(psti、xhoi，ndei、bamhi)、t4dna连接酶，dnamarker，dna凝胶回收试剂盒均购自北京宝日医生物技术有限公司提供；
实施例中所述的sm17培养基，每升组分如下：
动物蛋白胨2.5g，胰蛋白胨2.5g，大豆蛋白胨5g，牛肉提取物5g，酵母提取物2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，beta-甘油磷酸钠五水合物19g，蔗糖20g，余量水。
实施例中所述的sm17平板，每升组分如下：
动物蛋白胨2.5g，胰蛋白胨2.5g，大豆蛋白胨5g，牛肉提取物5g，酵母提取物2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，beta-甘油磷酸钠五水合物19g，蔗糖20g，琼脂粉20g，余量水。
lm17液体培养基，每升组分如下：
动物蛋白胨2.5g，胰蛋白胨2.5g，大豆蛋白胨5g，牛肉提取物5g，酵母提取物2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，beta-甘油磷酸钠五水合物19g，乳糖20g，余量水。
实施例1
食品级宿主嗜热链球菌ch3070的构建，包括如下步骤：
(1)将嗜热链球菌jim8232接种于lm17液体培养基中，42℃静止培养过夜后收集菌体，使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组dna；lm17培养基成分每升含有：动物蛋白胨2.5g，胰蛋白胨2.5g，大豆蛋白胨5g，牛肉提取物5g，酵母提取物2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，beta-甘油磷酸钠五水合物19g，乳糖20g，余量水。
(2)以步骤(1)的基因组dna为模板，利用核苷酸序列为seqidno.1和seqidno.2的引物对st-lacs-up-f和st-lacs-up-r进行pcr扩增乳糖透过酶基因stlacs的上游同源臂，
st-lacs-up-f:ggtaccgggccccccctcgagttccaacggaaactggtgctseqidno.1
st-lacs-up-r:ttcggaaacctcctattatttgseqidno.2
pcr扩增体系为：extaqbuffer25μl，dntp4μl，引物st-lacs-up-f2μl，引物st-lacs-up-r2μl，基因组dna1μl，extaq1μl,双蒸水13μl；
pcr扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
利用核苷酸序列为seqidno.3和seqidno.4的引物对st-lacs-down-f和st-lacs-down-r进行pcr扩增乳糖透过酶基因stlacs的下游同源臂，
st-lacs-down-f:caaataataggaggtttccgaatctatgaacatgactgaaaaaatseqidno.3
st-lacs-down-r:agtggatcccccgggctgcagaagacaattctcttaccattcseqidno.4
pcr扩增体系为：extaqbuffer25μl，dntp4μl，引物st-lacs-down-f2μl，引物st-lacs-down-r2μl，基因组dna1μl，extaq1μl,双蒸水13μl。
pcr扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
然后，利用重叠拼接pcr的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得乳糖透过酶stlacs基因敲除连接臂；
pcr扩增体系为：extaqbuffer25μl，dntp4μl，引物st-lacs-up-f2μl，引物st-lacs-down-r2μl，上游同源臂1μl，下游同源臂1μl，extaq1μl,双蒸水12μl。
pcr扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
(3)使用psti和xhoi对质粒pghost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤(2)中，制得的乳糖透过酶stlacs基因敲除连接臂连接到pghost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌xl-blue1，涂布于含有250μg/ml红霉素的lb平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/ml红霉素的lb液体管，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用psti和xhoi进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子，提取验证正确的转化子的质粒；
(4)将步骤(3)得到的重组质粒转化入嗜热链球菌jim8232中，涂布于含有2.5μg/ml红霉素的sm17平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有2.5μg/ml红霉素的sm17液体培养基中，30℃静置培养至od600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换，42℃培养2小时后，涂布于含有2.5μg/ml红霉素的sm17平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。
(5)将步骤(4)中第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素的sm17液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的sm17液体培养基中，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。将菌液涂布于不含有抗生素的sm17平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于添加和不添加2.5μg/ml红霉素的sm17平板，继续30℃培养。将在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株挑取至新鲜的培养基。30℃培养12小时后提取基因组dna。利用核苷酸序列为seqidno.5和seqidno.6的引物对对第二次同源交换成功的菌株进行pcr检测，扩增出3085bp的目的产物，电泳图谱见图1，即为乳糖透过酶stlacs基因敲除菌株，命名为嗜热链球菌ch3070。敲除乳糖透过酶stlacs基因后，菌株在lm17培养基中失去生长能力。
st-lacs-test-f:tcgtgactatgtgcatccseqidno.5
st-lacs-test-r:gatatcagctggtttcgcseqidno.6
pcr检测体系为：extaqbuffer25μl，dntp4μl，引物st-lacs-test-f2μl，引物st-lacs-test-r2μl，基因组dna1μl，extaq1μl,双蒸水13μl。
pcr检测反应条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
实施例2
食品级表达载体pst5240
食品级表达载体pst5240包含以下元件：来自于质粒pmg36e的复制元件，来源于嗜热链球菌jim8232菌株的pldh启动子和tldh终止子，以及来源于植物乳杆菌wcfs1的乳糖透过酶lplacs基因。其图谱如图2所示，序列由上海生工生物工程有限公司进行合成，核苷酸序列如seqidno.7所示。将合成的表达载体pst5240转化入嗜热链球菌ch3070后，其在lm17培养基中的生长情况不仅得到了恢复，还超过野生型jim8232的菌体量水平，如图3，进一步分析培养基中的乳糖代谢情况，与野生型菌种相比，培养基中半乳糖含量由9.7g/l降低至5.2g/l。
实施例3
利用上述食品级嗜热链球菌表达系统在制备酸奶过程中生产γ-氨基丁酸的应用
利用核苷酸序列为seqidno.8和seqidno.9的引物对gad-f和gad-r扩增短小乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因gad，扩增产物使用ndei和bamhi双酶切，并将载体pst5240使用ndei和bamhi双酶切，酶切的产物使用t4dna聚合酶就进行连接，连接产物转化嗜热链球菌ch3070，转化子在lm17培养基上筛选，筛选的转化子提取质粒进行验证，验证正确的转化子以2％转接于添加有2mg/ml谷氨酸钠的牛奶中，42℃培养12小时后，测定发酵酸奶中γ-氨基丁酸的含量，结果如图4所示。
gad-f:gcgcatatggctatgttatatggt；seqidno.8
gad-r:cgcggatccttagtgagtgaatccgtat；seqidno.9
pcr扩增体系为：extaqbuffer25μl，dntp4μl，引物gad-f2μl，引物gad-r2μl，短小乳杆菌dna1μl，extaq1μl,双蒸水13μl。
pcr扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
对比例1
构建以stlacs作为筛选标记的表达载体
食品级表达载体pst5250包含以下元件：来自于质粒pmg36e的复制元件，来源于嗜热链球菌jim8232菌株的pldh启动子和tldh终止子，以及来源于嗜热链球菌jim8232的乳糖透过酶stlacs基因，pst5250序列由上海生工生物工程有限公司进行合成，pst5250的序列为seqidno.10。将合成的表达载体pst5250转化入嗜热链球菌ch3070后，其在lm17培养基中的生长情况与野生型jim8232的菌体量水平相当，这表明来源于植物乳杆菌的乳糖透过酶lplacs基因更适合作为筛选标记。
对比例2
利用对比例1构建的以stlacs作为筛选标记的表达载体pst5250，连接实施例3中的γ-氨基丁酸基因，转化入嗜热链球菌ch3070后，转化子在lm17培养基上筛选，筛选的转化子提取质粒进行验证，验证正确的转化子以2％转接于添加有2mg/ml谷氨酸钠的牛奶中，42℃培养至与实施例3相同的菌体浓度后，测定发酵酸奶中γ-氨基丁酸的含量，结果如图4所示。
对比例3
利用本发明涉及食品级表达系统表达绿色荧光蛋白
利用核苷酸序列为seqidno.11和seqidno.12的引物对gfp-f和gfp-r进行pcr扩增，扩增产物使用ndei和bamhi双酶切，并将载体pst5240使用ndei和bamhi双酶切，酶切的产物使用t4dna聚合酶就进行连接，连接产物转化嗜热链球菌ch3070，转化子在lm17培养基上筛选，筛选的转化子提取质粒进行验证，验证正确的转化子转接于新鲜的液体lm17培养基，42℃培养12小时后，利用荧光酶标仪检测绿色荧光蛋白在嗜热链球菌中的表达。
利用核苷酸序列为seqidno.11和seqidno.12的引物对gfp-f和gfp-r进行pcr扩增，扩增产物使用ndei和bamhi双酶切，并将对比例1构建载体pst5250使用ndei和bamhi双酶切，酶切的产物使用t4dna聚合酶就进行连接，连接产物转化嗜热链球菌ch3070，转化子在lm17培养基上筛选，筛选的转化子提取质粒进行验证，验证正确的转化子转接于新鲜的液体lm17培养基，42℃培养至与上述表达绿色荧光蛋白的菌体相同的菌体浓度后，利用荧光酶标仪检测绿色荧光蛋白在嗜热链球菌中的表达。
结果显示在载体pst5250连接绿色荧光蛋白基因转化嗜热链球菌ch3070相对荧光值rfu为8855，而载体pst5240连接绿色荧光蛋白基因转化嗜热链球菌中的相对荧光值rfu为13740。
gfp-f:atacatatgagcaaaggagaagaacseqidno.11
gfp-r:ataggatccttagtatagctcatccatgseqidno.12
pcr扩增体系为：extaqbuffer25μl，dntp4μl，引物gfp-f2μl，引物gfp-r2μl，质粒ptvp1gfp1μl，extaq1μl,双蒸水13μl；
pcr扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
对比例4
比较载体pst5240和对比例1构建的载体pst5250在植物乳杆菌中的表达效果
i构建敲除lplacs的植物乳杆菌，包括如下步骤：
(1)将植物乳杆菌wcfs1接种于mrs培养基中，37℃静止培养过夜后收集菌体，使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组dna；mrs培养基成分每升含有：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉5.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，醋酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温801.0ml，余量水。
(2)以步骤(1)的基因组dna为模板，利用引物对lp-lacs-up-f和lp-lacs-up-r扩增基因lplacs的上游同源臂，pcr扩增体系为：extaqbuffer25μl，dntp4μl，引物lp-lacs-μp-f2μl，引物lp-lacs-up-r2μl，基因组dna1μl，extaq1μl,双蒸水13μl。pcr扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。利用引物对lp-lacs-down-f和lp-lacs-down-r扩增基因lplacs的下游同源臂，pcr扩增体系为：extaqbuffer25μl，dntp4μl，引物lp-lacs-down-f2μl，引物lp-lacs-down-r2μl，基因组dna1μl，extaq1μl,双蒸水13μl。pcr扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。之后利用重叠拼接pcr的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，pcr扩增体系为：extaqbuffer25μl，dntp4μl，引物lp-lacs-up-f2μl，引物lp-lacs-down-r2μl，上游同源臂1μl，下游同源臂1μl，extaq1μl,双蒸水12μl。pcr扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
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(3)使用psti和xhoi对质粒pghost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤(2)中连接的上下游同源臂连接到pghost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌xl-blue1，涂布于含有250μg/ml红霉素的lb平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/ml红霉素的lb液体培养基中，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用psti和xhoi进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子。提取验证正确的转化子的质粒；
(4)将步骤(3)得到的重组质粒转化入植物乳杆菌wcfs1中，涂布于含有5μg/ml红霉素的mrs平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有5μg/ml红霉素的mrs液体培养基。30℃静置培养至od600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换。42℃培养2小时后，涂布于含有5μg/ml红霉素的mrs平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。
(5)将步骤(4)中第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素的mrs液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的mrs液体管，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。将菌液涂布于不含有抗生素的mrs平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于添加和不添加5μg/ml红霉素的mrs平板，继续30℃培养。将在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株挑取至新鲜的培养基。30℃培养12小时后提取基因组dna。利用引物对lp-lacs-test-f和lp-lacs-test-r对第二次同源交换成功的菌株进行检测，pcr扩增体系为：extaqbuffer25μl，dntp4μl，引物lp-lacs-test-f2μl，引物lp-lacs-test-r2μl，基因组dna1μl，extaq1μl,双蒸水13μl。pcr扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。扩增出2311bp大小的目的产物即为lplacs基因敲除菌株。
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(6)获得敲除lplacs基因的植物乳杆菌，菌株在mrs-乳糖培养基中不再生长。
ii将载体pst5240转化入敲除lplacs基因的植物乳杆菌后，其在mrs-乳糖培养基中的生长情恢复至野生型。
所述mrs-乳糖培养基为将上述mrs培养基成分中的葡萄糖替换为乳糖。
iii将载体pst5250转化入敲除lplacs基因的植物乳杆菌后，其在mrs-乳糖培养基中的生长情恢复至野生型。
iv利用上述食品级表达系统表达γ-氨基丁酸
利用核苷酸序列为seqidno.8和seqidno.9的引物对gad-f和gad-r扩增短小乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因gad，扩增产物使用ndei和bamhi双酶切，并将载体pst5250使用ndei和bamhi双酶切，酶切的产物使用t4dna聚合酶就进行连接，连接产物转化敲除lplacs基因的植物乳杆菌，转化子在mrs-乳糖培养基上筛选，筛选的转化子提取质粒进行验证，验证正确的转化子以2％转接于添加有2mg/ml谷氨酸钠的牛奶中，37℃培养24小时后，测定发酵酸奶中γ-氨基丁酸的含量为0.69mg/ml。
利用核苷酸序列为seqidno.8和seqidno.9的引物对gad-f和gad-r扩增短小乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因gad，扩增产物使用ndei和bamhi双酶切，并将载体pst5240使用ndei和bamhi双酶切，酶切的产物使用t4dna聚合酶就进行连接，连接产物转化敲除lplacs基因的植物乳杆菌，转化子在mrs-乳糖培养基上筛选，筛选的转化子提取质粒进行验证，验证正确的转化子以2％转接于添加有2mg/ml谷氨酸钠的牛奶中，37℃培养至与上述表达γ-氨基丁酸的植物乳杆菌体浓度相同，测定发酵酸奶中γ-氨基丁酸的含量为0.71mg/ml。
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pcr扩增体系为：extaqbuffer25μl，dntp4μl，引物gad-f2μl，引物gad-r2μl，短小乳杆菌dna1μl，extaq1μl,双蒸水13μl。
pcr扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
综上，本发明涉及的食品级嗜热链球菌表达系统，以植物乳杆菌wcfs1的乳糖透过酶lplacm基因作为筛选标记，优于以嗜热链球菌jim8232的乳糖透过酶stlacs基因作为筛选标记，本发明涉及的食品级嗜热链球菌表达系统，即将合成的表达载体pst5240转化入嗜热链球菌ch3070后，lm17培养基中的生长情况不仅得到了恢复，还超过野生型jim8232的菌体量水平，如图3；与野生型菌种jim8232相比，培养基中半乳糖含量显著降低，半乳糖含量由9.7g/l降低至5.2g/l，避免由于半乳糖的积累造成乳制品品质的影响。
本发明涉及的食品级嗜热链球菌表达系统，对异源物的表达产生一定的协同作用：
在敲除乳糖透过酶stlacs基因的嗜热链球菌ch3070中，以植物乳杆菌wcfs1的乳糖透过酶lplacm基因作为筛选标记时，相同菌体浓度，表达绿色荧光蛋白的荧光值rfu为13740显著高于以嗜热链球菌jim8232的乳糖透过酶stlacs基因作为筛选标记时，表达绿色荧光蛋白的荧光值rfu为8855；
在敲除乳糖透过酶stlacs基因的嗜热链球菌ch3070中，以植物乳杆菌wcfs1的乳糖透过酶lplacm基因作为筛选标记时，相同菌体浓度下，表达γ-氨基丁酸的量显著高于以嗜热链球菌jim8232的乳糖透过酶stlacs基因作为筛选标记时，表达γ-氨基丁酸的量，见图4；但是，在敲除乳糖透过酶lplacm基因的植物乳杆菌中，以植物乳杆菌wcfs1的乳糖透过酶lplacm基因作为筛选标记时，相同菌体浓度下，表达γ-氨基丁酸的含量为0.69mg/ml，与以嗜热链球菌jim8232的乳糖透过酶stlacs基因作为筛选标记时，表达γ-氨基丁酸的含量0.71mg/ml，相比两者差异极小，说明在植物乳杆菌中没有产生协同作用，进一步证明了本发明涉及的食品级嗜热链球菌表达系统具有特异性。
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<110>齐鲁工业大学
<120>一种食品级嗜热链球菌表达系统及其在酸奶制备中的应用
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ggtctagcaccgtttttcc19
1.一种食品级嗜热链球菌表达系统的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)一株食品级宿主嗜热链球菌ch3070的构建，包括如下步骤：
①提取嗜热链球菌jim8232(streptococcusthermophilusjim8232)的基因组dna；
②以步骤①的基因组dna为模板，利用核苷酸序列为seqidno.1和seqidno.2的引物对扩增乳糖透过酶基因stlacs的上游同源臂，利用核苷酸序列为seqidno.3和seqidno.4的引物对扩增乳糖透过酶基因stlacs的下游同源臂；然后利用重叠拼接pcr的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得乳糖透过酶stlacs基因敲除连接臂；
③使用psti和xhoi对质粒pghost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤(2)中制得的stlacs基因敲除连接臂连接到pghost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌xl-blue1，挑取验证正确的转化子，提取重组质粒；
④将步骤③得到的重组质粒转化入嗜热链球菌jim8232中，通过转化子培养发生第一次同源交换，利用红霉素进行筛选，然后进行连续传代发生第二次同源交换，筛选红霉素标记丢失的菌株，利用核苷酸序列为seqidno.5和seqidno.6的引物对对红霉素标记丢失的菌株进行检测，扩增出3085bp目的产物的菌体即为乳糖透过酶stlacs基因敲除菌株，命名为嗜热链球菌ch3070；
(2)合成食品级表达载体pst5240，核苷酸序列如seqidno.7所示。
2.如权利要求1所述食品级嗜热链球菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤②中，乳糖透过酶stlacs上游同源臂pcr扩增体系如下：
extaqbuffer25μl，dntp4μl，引物st-lacs-up-f2μl，引物st-lacs-up-r2μl，基因组dna1μl，extaq1μl,双蒸水13μl；
pcr扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；
所述步骤②中，乳糖透过酶stlacs下游同源臂pcr扩增体系如下：
extaqbuffer25μl，dntp4μl，引物st-lacs-down-f2μl，引物st-lacs-down-r2μl，基因组dna1μl，extaq1μl,双蒸水13μl；
pcr扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；
所述步骤②中，乳糖透过酶stlacs上游同源臂和下游同源臂连接pcr扩增体系如下：
extaqbuffer25μl，dntp4μl，引物st-lacs-up-f2μl，引物st-lacs-down-r2μl，上游同源臂1μl，下游同源臂1μl，extaq1μl,双蒸水12μl；
pcr扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
3.如权利要求1所述食品级嗜热链球菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤③验证转化子的方法：将连接产物转化入感受态大肠杆菌xl-blue1，涂布于含有250μg/ml红霉素的lb平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/ml红霉素的lb液体培养基中，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用psti和xhoi进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子。
4.如权利要求1所述食品级嗜热链球菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤④中转化子的培养条件，转化子在含有2.5μg/ml红霉素的sm17平板上进行培养，温度为30℃。
5.如权利要求1所述食品级嗜热链球菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤④中利用红霉素的筛选条件：重组质粒转化入嗜热链球菌jim8232中，涂布于含有2.5μg/ml红霉素的sm17平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有2.5μg/ml红霉素的sm17液体培养基中，30℃静置培养至od600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换，42℃培养2小时后，涂布于含有2.5μg/ml红霉素的sm17平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株；
优选的，所述步骤④中连续传代的培养条件为将第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素的sm17液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的sm17液体培养基中，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换；
优选的，所述步骤④中红霉素标记丢失的菌株筛选为将连续传代后的菌液涂布于不含有抗生素的sm17平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于添加和不添加2.5μg/ml红霉素的sm17平板，继续30℃培养，选择在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株即为红霉素标记丢失的菌株；
优选的，所述步骤④中sm17培养基每升组分如下：动物蛋白胨2.5g，胰蛋白胨2.5g，大豆蛋白胨5g，牛肉提取物5g，酵母提取物2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，beta-甘油磷酸钠五水合物19g，蔗糖20g，余量水。
6.如权利要求1所述食品级嗜热链球菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤④中，pcr检测体系为：
extaqbuffer25μl，dntp4μl，引物lacs-test-f2μl，引物lacs-test-r2μl，基因组dna1μl，extaq1μl,双蒸水13μl；
pcr检测反应条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
7.利要求1构建的一种食品级嗜热链球菌表达系统，其特征在于，包含食品级宿主嗜热链球菌ch3070和食品级表达载体pst5240，食品级表达载体pst5240转化入嗜热链球菌ch3070。
8.权利要求7所述食品级嗜热链球菌表达系统在生产异源物中的应用。
9.权利要求8所述食品级嗜热链球菌表达系统生产的异源物在酸奶制备中的应用。
10.权利要求9所述食品级嗜热链球菌表达系统在制备酸奶过程中表达γ-氨基丁酸的应用，包括以下步骤：
a利用核苷酸序列为seqidno.8和seqidno.9的引物对gad-f和gad-r进行pcr扩增短小乳杆菌cgmcc1366谷氨酸脱羧酶基因gad；
b将步骤a制备的谷氨酸脱羧酶基因gad插入食品级表达载体pst5240多克隆位点，采用电转化法将构建好的载体转入嗜热链球菌ch3070中，筛选，制得转化子；
c将步骤b制得的转化子接种于牛奶中，通过检测发酵酸奶中γ-氨基丁酸的含量控制发酵过程。
技术总结