本发明涉及生物医学领域，特别涉及丝蛋白水凝胶及其制备方法、应用。
背景技术：
胚胎干细胞(embryonicstemcell，escs，简称es或ek细胞)是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，胚胎干细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。
胚胎干细胞具有多能性(pluripotency)，特点是可以通过细胞分化(cellulardifferentiation)成多种组织(所有组织，包括生殖系细胞)的能力，但无法独自发育成一个个体(利用四倍体融合技术可以得到完全由所用es细胞发育而来的个体)。它可以发育成为外胚层、中胚层及内胚层三种胚层的细胞组织。
具有多向分化潜能的胚胎干细胞在组织修复和再生医学方面具有巨大的应用前景，成为近年来医学前沿重点发展领域。干细胞治疗中的一项关键技术是体外的高效扩增，在扩增过程中保持干细胞的干性，防止其分化则是体外扩增的关键。传统培养方法是在培养基中加入白血病抑制因子来维持细胞干性，但是白血病抑制因子作为外源性因子，其高昂的价格、固有的致瘤性和易于失活等问题严重阻碍了其应用，导致胚胎干细胞安全的临床转化难以实现。
近年来多种促胚胎干细胞增殖的培养基材被开发，但是在使用过程中仍然需要加入生长因子来辅助干性维持，并且维持时间较短，所以胚胎干细胞的培养方法仍然需要进一步优化。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供一种丝蛋白水凝胶及其制备方法、应用。该丝蛋白水凝胶能够在无白血病抑制因子的培养条件下进行小鼠胚胎干细胞体外高效扩增，且细胞干性表达水平高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种丝蛋白水凝胶，丝蛋白取向凝胶经浓度为0.001％～10％(w/v)的包被材料包被制得；
所述包被材料包括明胶、透明质酸、壳聚糖中的一种或两者以上的混合物；
所述丝蛋白取向凝胶的制备方法为：取蚕丝与盐溶液混合煮沸后清洗、干燥，与libr溶液混合，透析，离心后收集上清，获得丝蛋白溶液；
取所述丝蛋白溶液浓缩后稀释至浓度为0.5～4wt％，静置，获得纳米纤维水凝胶；
取所述纳米纤维水凝胶搅拌，施加电压，于正极收集所述丝蛋白取向凝胶。
丝蛋白由于具有优异的生物相容性，出色的机械性能和可控的纳米结构、构象和表面特性，是研究干细胞分化、增殖和干性维持等细胞行为的理想备选材料。
对体内微环境的仿生设计是调控细胞行为的可靠手段，在制备出具有取向间隔结构的丝蛋白水凝胶的基础上，可在一定程度模拟囊胚层的结构，然而由于丝蛋白具有高的负电荷密度，同细胞具有强的排斥力，导致细胞难以在凝胶粘附扩增。考虑到材料同细胞过强的粘附作用会诱导干细胞分化，因此，本发明利用不同生物材料对取向凝胶进行包被，调控材料同干细胞的相互作用强度，获得理想的细胞粘附效果，结合结构仿生设计，实现胚胎干细胞命运的体外控制，在无滋养层细胞和基本避免外源性生长因子使用的前提下，采用常规细胞培养手段实现胚胎干细胞的干性长期维持和体外扩增。本技术解决了现有胚胎干细胞技术要求苛刻，费用昂贵等问题，为胚胎干细胞的体外扩增提供了简单、经济且更为稳定的培养基质和技术方法。
在本发明的一些具体实施方案中，所述丝蛋白取向凝胶的取向间隔为50～500μm。
在本发明的一些具体实施方案中，所述纳米纤维水凝胶中纳米纤维的直径为10～20nm，纳米纤维的长度为1～2μm。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的丝蛋白水凝胶在制备干细胞培养基材中的应用。
此外，本发明还提供了一种干细胞培养基材，其特征在于，包括所述的丝蛋白水凝胶。
本发明还提供了干细胞的培养方法，取干细胞接种于所述的丝蛋白水凝胶或所述的干细胞培养基材，培养。
在本发明的一些具体实施方案中，所述接种为采用干细胞完全培养基(0.5～2ml)将胚胎干细胞(2×104/cm2～10×104/cm2)接种于丝蛋白水凝胶，黏附0.5～8h；
所述干细胞完全培养基包含以下组分：终浓度为1000u/ml的白血病抑制因子，高糖dmem基础培养基，终浓度为10％的胎牛血清，终浓度分别为100u/ml和0.1mg/ml的青链霉素，终浓度为0.1mm的β-巯基乙醇，终浓度为1×的mem非必需氨基酸溶液。
在本发明的一些具体实施方案中，所述培养采用的培养基不包括白血病抑制因子。
在本发明的一些具体实施方案中，所述培养为采用无白血病抑制因子培养基(0.5～2ml)培养干细胞；
所述无白血病抑制因子培养基包含以下组分：高糖dmem基础培养基，终浓度为10％的胎牛血清，终浓度分别为100u/ml和0.1mg/ml的青链霉素，终浓度为0.1mm的β-巯基乙醇，终浓度为1×的mem非必需氨基酸溶液。
在本发明的一些具体实施方案中，所述接种的细胞密度为2×104/cm2～10×104/cm2，所述接种采用的所述干细胞完全培养基或所述培养采用的无白血病抑制因子培养基的用量为0.5ml～2ml。
在本发明的一些具体实施方案中所述干细胞为胚胎干细胞。
本发明提供了一种具有可调控材料同干细胞相互粘附强度的丝蛋白水凝胶，以及以此丝蛋白水凝胶为基质实现无滋养细胞和外源性生长因子的干细胞体外扩增的方法，其包括以下步骤：s1：制备丝蛋白取向凝胶，取向间隔在50-500μm；s2：对s1中得到的丝蛋白取向凝胶使用明胶、透明质酸、壳聚糖等包被，包被材料浓度在0.001％-10％；s3：将利用不同材料包被后的丝蛋白取向凝胶作为培养基材；s4：采用胚胎干细胞完全培养基将小鼠胚胎干细胞接种在上述培养基材上，置于细胞培养箱中，待细胞黏附0.5-8小时后将培养基换成无白血病抑制因子培养基继续培养小鼠胚胎干细胞；s5：继续使用无白血病抑制因子培养基持续培养干细胞，24-48小时换液，直至达到所需细胞密度。本发明利用不同生物材料对丝蛋白取向凝胶进行包被，调控材料同干细胞的相互作用强度，获得理想的细胞粘附效果，结合结构仿生设计，实现胚胎干细胞命运的体外控制，在无滋养层细胞和基本避免外源性生长因子使用的前提下，采用常规细胞培养手段实现胚胎干细胞的干性长期维持和体外扩增。本技术解决了现有胚胎干细胞技术要求苛刻，费用昂贵等问题，为胚胎干细胞的体外扩增提供了简单、经济且更为稳定的培养基质和技术方法。
本发明的有益效果包括但不限于：
(1)实现在无白血病抑制因子的培养条件下进行小鼠胚胎干细胞体外高效扩增，且细胞干性表达水平高；
(2)规避正常培养中因使用生长因子导致的致瘤性等风险，为实现干细胞治疗提供更为安全可靠的技术方案；
(3)该方法减少白血病抑制因子的使用量，极大地降低了细胞培养成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示未包被的丝蛋白取向凝胶的电镜图，其中，图1(a)示本发明中丝蛋白取向凝胶的宏观图；图1(b)示本发明中丝蛋白取向凝胶的取向结构的扫描电镜图；图1(c)为本发明中丝蛋白取向凝胶的纳米纤维的扫描电镜图；
图2示使用明胶包被丝蛋白取向凝胶4h后小鼠胚胎干细胞在材料表面黏附图；其中，第1行示明胶浓度为0.001％的结果；第2行示明胶浓度为0.01％的结果；第3行示明胶浓度为0.1％的结果；第4行示明胶浓度为1％的结果；
图3为本发明中丝蛋白水凝胶(按照实施例2的制备方法使用明胶包被丝蛋白取向凝胶制得)在无白血病抑制因子条件下(sa)培养小鼠胚胎干细胞7天后结果；其中，图3(a)细胞形态、图3(b)细胞增殖情况和图3(c)细胞干性表达结果，其中以小鼠胚胎成纤维细胞细胞为饲养层加入白血病抑制因子的经典培养方法(mef)为阳性对照，以无取向凝胶无白血病抑制因子的培养法(gelatin)为阴性对照；
图4示对比例中，以不包被明胶的丝蛋白水凝胶培养胚胎干细胞的细胞黏附量；
图5为本发明中丝蛋白水凝胶(按照实施例2的制备方法使用明胶包被丝蛋白取向凝胶制得)在无白血病抑制因子条件下(sa)培养小鼠胚胎干细胞在体外三向分化的结果；其中，以小鼠胚胎成纤维细胞细胞为饲养层加入白血病抑制因子的经典培养方法(mef)培养后的小鼠胚胎干细胞在体外三向分化的结果为对照；
图6为本发明中丝蛋白水凝胶(按照实施例2的制备方法使用明胶包被丝蛋白取向凝胶制得)在无白血病抑制因子条件下(sa)培养小鼠胚胎干细胞在体内形成嵌合鼠的结果，其中，以小鼠胚胎成纤维细胞细胞为饲养层加入白血病抑制因子的经典培养方法(mef)培养后的小鼠胚胎干细胞在在体内形成嵌合鼠结果为对照；其中，图6(a)示嵌合鼠照片；图6(b)示嵌合鼠存活数量及嵌合鼠数量对比；图6(c)示所得嵌合鼠嵌合率与性别统计对比。
具体实施方式
本发明公开了一种丝蛋白水凝胶及其制备方法、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种能够维持胚胎干细胞干性的丝蛋白水凝胶，包括以下步骤：
(1)获得丝蛋白取向凝胶；
(2)所述丝蛋白取向凝胶使用明胶、透明质酸、壳聚糖等包被，包被材料浓度在0.001％-10％。
优选的，所述步骤1)形成的取向凝胶取向间隔为50～500μm。
优选的，所述步骤2)使用0.001～10％明胶包被0.5～8h。
优选的，所述步骤2)使用0.001～10％透明质酸包被0.5～8h。
优选的，所述步骤2)使用0.001～10％壳聚糖包被0.5～8h。
本发明还提供了一种利用上述丝蛋白水凝胶实现干细胞体外扩增的方法，包括以下步骤：
(1)将丝蛋白水凝胶(利用不同材料包被后的丝蛋白取向凝胶)作为培养基材；
(2)采用胚胎干细胞完全培养基将小鼠胚胎干细胞接种在上述培养基材上，置于细胞培养箱中，待细胞黏附0.5h～8h后将培养基换成无白血病抑制因子培养基继续培养小鼠胚胎干细胞；
(3)继续使用无白血病抑制因子培养基持续培养干细胞，24h～48h换液，直至达到所需细胞密度。
优选的，所述步骤2)细胞接种密度为2×104/cm2～10×104/cm2。
优选的，所述步骤2)无白血病抑制因子培养基包含以下组分：高糖dmem基础培养基，终浓度为10％的胎牛血清，终浓度分别为100u/ml和0.1mg/ml的青链霉素，终浓度为0.1mm的β-巯基乙醇，终浓度为1x的mem非必需氨基酸溶液；胚胎干细胞完全培养基包含以下组分：终浓度为1000u/ml的白血病抑制因子，无白血病抑制因子培养基。
优选的，所述步骤3)细胞培养条件为正常培养条件37℃，5％co2。
优选的，所述步骤3)正常传代培养，正常换液，培养时间为1-21d。
本发明的优点是：
(1)实现在无白血病抑制因子的培养条件下进行小鼠胚胎干细胞体外高效扩增，且细胞干性表达水平高；
(2)规避正常培养中因使用生长因子导致的致瘤性等风险，为实现干细胞治疗提供更为安全可靠的技术方案；
(3)该方法减少白血病抑制因子的使用量，极大地降低了细胞培养成本。
本发明提供的丝蛋白水凝胶及其制备方法、应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
(1)制备取向间隔为50-100μm的高晶结构的丝蛋白纳米纤维水凝胶
(2)将取向水凝胶切片、灭菌后，用10％的明胶包被0.5h后得到培养基材；
(3)采用胚胎干细胞完全培养基(0.5ml)将小鼠胚胎干细胞以2×104/cm2的密度接种在上述培养基材上，置于37℃，5％co2细胞培养箱中，细胞黏附后将培养基换成无白血病抑制因子培养基(0.5ml)继续培养小鼠胚胎干细胞1、3、7天；以小鼠胚胎成纤维细胞细胞为饲养层加入白血病抑制因子的经典培养方法(mef)以及无取向凝胶无白血病抑制因子的培养法(gelatin)分别培养小鼠胚胎干细1、3、7天后的细胞为对照组；
(4)弃去原培养液，依次使用4％多聚甲醛溶液以及0.1％tritonx-100/pbs溶液对细胞进行固定、破膜处理，随后利用fitc-鬼笔环肽对细胞骨架蛋白进行荧光染色处理，dapi对细胞核染色后在共聚焦荧光显微镜下观察细胞1、3、7天后形态变化情况；
(5)分别收集培养1、3、7天后的细胞，通过检测各组细胞dna含量分析细胞增殖情况；
(6)利用rna全提取试剂盒分别提取培养7天后的细胞中全部rna，并逆转录为cdna，利用实时pcr系统对细胞中所表达的干性相关基因进行定量分析。
(7)分别收集培养7天后的细胞(mef组和sa组)，并分别接种到明胶包被的培养皿中，以无白血病抑制因子培养基培养3周，对培养后的细胞分别进行tuj-1(外胚层)，gata(内胚层)，sma(中胚层)免疫染色，并用dapi对细胞核染色后在在共聚焦荧光显微镜下观察细胞的三向分化行为。
(8)分别收集培养7天后的细胞(mef组和sa组)，通过显微注射将收集的细胞分别注射入来源于c57bl/6j-tyr母鼠的囊胚中，将注射细胞后的囊胚移植至假孕母鼠icr体内，通过检测mescs能否与囊胚腔中内细胞团嵌合得到嵌合小鼠，证明esc是否具有干性和功能性。
实施例2
(1)制备取向间隔为100-200μm的高晶结构的丝蛋白纳米纤维水凝胶
(2)将取向水凝胶切片、灭菌后，用0.1％的明胶包被4h后得到培养基材；
(3)采用胚胎干细胞完全培养基(0.5ml)将小鼠胚胎干细胞以2×104/cm2的密度接种在上述培养基材上，置于37℃，5％co2细胞培养箱中，细胞黏附后将培养基换成无白血病抑制因子培养基(0.5ml)继续培养小鼠胚胎干细胞1、3、7天；以小鼠胚胎成纤维细胞细胞为饲养层加入白血病抑制因子的经典培养方法(mef)以及无取向凝胶无白血病抑制因子的培养法(gelatin)分别培养小鼠胚胎干细1、3、7天后的细胞为对照组；
(4)弃去原培养液，依次使用4％多聚甲醛溶液以及0.1％tritonx-100/pbs溶液对细胞进行固定、破膜处理，随后利用fitc-鬼笔环肽对细胞骨架蛋白进行荧光染色处理，dapi对细胞核染色后在共聚焦荧光显微镜下观察细胞1、3、7天后形态变化情况；
(5)分别收集培养1、3、7天后的细胞，通过检测各组细胞dna含量分析细胞增殖情况；
(6)利用rna全提取试剂盒分别提取培养7天后的细胞中全部rna，并逆转录为cdna，利用实时pcr系统对细胞中所表达的干性相关基因进行定量分析。
(7)分别收集培养7天后的细胞(mef组和sa组)，并分别接种到明胶包被的培养皿中，以无白血病抑制因子培养基培养3周，对培养后的细胞分别进行tuj-1(外胚层)，gata(内胚层)，sma(中胚层)免疫染色，并用dapi对细胞核染色后在在共聚焦荧光显微镜下观察细胞的三向分化行为。
(8)分别收集培养7天后的细胞(mef组和sa组)，通过显微注射将收集的细胞分别注射入来源于c57bl/6j-tyr母鼠的囊胚中，将注射细胞后的囊胚移植至假孕母鼠icr体内，通过检测mescs能否与囊胚腔中内细胞团嵌合得到嵌合小鼠，证明esc是否具有干性和功能性。
实施例3
(1)制备取向间隔为200-400μm的高晶结构的丝蛋白纳米纤维水凝胶
(2)将取向水凝胶切片、灭菌后，使用0.001％的透明质酸8h包被后得到培养基材
(3)采用胚胎干细胞完全培养基(2ml)将小鼠胚胎干细胞以10×104/cm2的密度接种在上述培养基材上，置于37℃，5％co2细胞培养箱中，细胞黏附后将培养基换成无白血病抑制因子培养基(2ml)继续培养小鼠胚胎干细胞1、3、7天；以小鼠胚胎成纤维细胞细胞为饲养层加入白血病抑制因子的经典培养方法(mef)以及无取向凝胶无白血病抑制因子的培养法(gelatin)分别培养小鼠胚胎干细1、3、7天后的细胞为对照组；
(4)弃去原培养液，依次使用4％多聚甲醛溶液以及0.1％tritonx-100/pbs溶液对细胞进行固定、破膜处理，随后利用fitc-鬼笔环肽对细胞骨架蛋白进行荧光染色处理，dapi对细胞核染色后在共聚焦荧光显微镜下观察细胞1、3、7天后形态变化情况；
(5)分别收集培养1、3、7天后的细胞，通过检测各组细胞dna含量分析细胞增殖情况；
(6)利用rna全提取试剂盒分别提取培养7天后的细胞中全部rna，并逆转录为cdna，利用实时pcr系统对细胞中所表达的干性相关基因进行定量分析。
(7)分别收集培养7天后的细胞(mef组和sa组)，并分别接种到明胶包被的培养皿中，以无白血病抑制因子培养基培养3周，对培养后的细胞分别进行tuj-1(外胚层)，gata(内胚层)，sma(中胚层)免疫染色，并用dapi对细胞核染色后在在共聚焦荧光显微镜下观察细胞的三向分化行为。
(8)分别收集培养7天后的细胞(mef组和sa组)，通过显微注射将收集的细胞分别注射入来源于c57bl/6j-tyr母鼠的囊胚中，将注射细胞后的囊胚移植至假孕母鼠icr体内，通过检测mescs能否与囊胚腔中内细胞团嵌合得到嵌合小鼠，证明esc是否具有干性和功能性。
实施例4
(1)制备取向间隔为50-80μm的高晶结构的丝蛋白纳米纤维水凝胶；
(2)将取向水凝胶切片、灭菌后，使用1％的壳聚糖包被2h后得到培养基材；
(3)采用胚胎干细胞完全培养基(1.5ml)将小鼠胚胎干细胞以6×104/cm2的密度接种在上述培养基材上，置于37℃，5％co2细胞培养箱中，细胞黏附后将培养基(1ml)换成无白血病抑制因子培养基继续培养小鼠胚胎干细胞1、3、7天；以小鼠胚胎成纤维细胞细胞为饲养层加入白血病抑制因子的经典培养方法(mef)以及无取向凝胶无白血病抑制因子的培养法(gelatin)分别培养小鼠胚胎干细1、3、7天后的细胞为对照组；
(4)弃去原培养液，依次使用4％多聚甲醛溶液以及0.1％tritonx-100/pbs溶液对细胞进行固定、破膜处理，随后利用fitc-鬼笔环肽对细胞骨架蛋白进行荧光染色处理，dapi对细胞核染色后在共聚焦荧光显微镜下观察细胞1、3、7天后形态变化情况；
(5)分别收集培养1、3、7天后的细胞，通过检测各组细胞dna含量分析细胞增殖情况；
(6)利用rna全提取试剂盒分别提取培养7天后的细胞中全部rna，并逆转录为cdna，利用实时pcr系统对细胞中所表达的干性相关基因进行定量分析。
(7)分别收集培养7天后的细胞(mef组和sa组)，并分别接种到明胶包被的培养皿中，以无白血病抑制因子培养基培养3周，对培养后的细胞分别进行tuj-1(外胚层)，gata(内胚层)，sma(中胚层)免疫染色，并用dapi对细胞核染色后在在共聚焦荧光显微镜下观察细胞的三向分化行为。
(8)分别收集培养7天后的细胞(mef组和sa组)，通过显微注射将收集的细胞分别注射入来源于c57bl/6j-tyr母鼠的囊胚中，将注射细胞后的囊胚移植至假孕母鼠icr体内，通过检测mescs能否与囊胚腔中内细胞团嵌合得到嵌合小鼠，证明esc是否具有干性和功能性。
效果例1
对未包被的取向水凝胶和包被不同浓度的明胶后的取向水凝胶的检测结果如下：
未包被的取向水凝胶的电镜图参见图1，图1(a)为本发明中取向水凝胶的宏观图、图1(b)为本发明中水凝胶取向结构的扫描电镜图、图1(c)为本发明中丝蛋白纳米纤维的扫描电镜图，取向结构为细胞生长提供丰富的水环境，具有高负电荷的纳米纤维抑制细胞在材料表面的铺展，这种材料结构可在一定程度模拟囊胚层的结构。
包被后的取向水凝胶的镜检结果参见图2，第1行示明胶0.001％，第2行示明胶0.01％，第3行示明胶0.1％，第4行示明胶1％包被水凝胶材料2h，发现可以利用包被物浓度调控材料同干细胞的相互作用强度，从而调控细胞在材料上的黏附行为。
效果例2
图3、表1示实施例2的结果，图3(a)示丝蛋白水凝胶在无白血病抑制因子条件下(sa)培养小鼠胚胎干细胞7天后细胞形态；图3(b)示细胞增殖情况；图3(c)示细胞干性基因表达结果，其中以小鼠胚胎成纤维细胞细胞为饲养层加入白血病抑制因子的经典培养方法(mef)为阳性对照，以无取向凝胶无白血病抑制因子的培养法(gelatin)为阴性对照。
可看出，相比于gelatin组细胞发生分散，sa组能够在无白血病抑制因子条件下维持小鼠胚胎干细胞特有的克隆团状的细胞形态，并且能够达到与mef法相当的增殖速率，扩增培养后的细胞干性相关基因oct4，nanog和sox2表达量最高，因此可以证明本发明提供的扩增方法可以有效实现小鼠胚胎干细胞在在无白血病抑制因子条件下的高效扩增和干性维持。
表1
利用rt-qpcr技术分析mescs细胞在mef、gelatin和sa上培养7天后其oct4，nanog，sox2基因的表达情况。以mef上培养的mescs为对照并将其值设为1，实验发现，sa上细胞的oct4，nanog，sox2基因表达量均显著高于mef组(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)，其值分别提高了100％，100％和50％以上，而gelatin上三种干性相关基因表达量分别下降了50％，40％和40％左右。上述结果证明了sa可以在无lif条件下实现mescs干性的高表达，并且oct4，nanog，sox2三种基因表达量高于加入lif培养的经典mef法。
效果例3
如图5、图6所示。
通过体外三胚层分化实验继续验证不同细胞体外培养后的干性能力，见图5。mescs分别在sa和mef上培养21day后，将细胞在普通明胶板上用白血病抑制因子的mescs培养基继续培养14天，进行免疫荧光染色实验观察mescs早期三胚层(外胚层，内胚层和中胚层)的信号表达情况，以tuj-1(外胚层)，gata4(内胚层)，sma(中胚层)为各胚层代表蛋白，通过检测其表达情况分析细胞向三胚层的分化能力。实验发现，sa和mef上培养的mescs在普通明胶板上用白血病抑制因子的mescs培养基继续培养14天后，tuj-1与sma染色均呈现绿色，gata4染色后细胞则呈现红色，证明细胞tuj-1，gata4和sma均为阳性表达，细胞能够表达出三胚层信号，具有向三胚层分化的能力。
esc能否与囊胚腔中内细胞团嵌合得到嵌合小鼠，是证明esc是否具有干性和功能性的有效方法。如图6所示。所用的mescs细胞来源的小鼠毛色为黑色，用于注射的供体胚胎来源于c57bl/6j-tyr白化小鼠，若细胞成功嵌合则出生的嵌合小鼠毛色为黑色或黑白色，因此可以通过检测出生小鼠的毛色判断嵌合是否成功，从而验证细胞是否具有干性。将在sa和mef上培养后的mescs显微注射入88个供体胚胎中并移植至icr母鼠子宫内，结果表明sa培养后的mescs注入胚胎后的得到的小鼠存活率较高，并且细胞能够与供体胚胎嵌合，并在胚胎中分化表达得到毛色为黑白色的嵌合小鼠，雄性小鼠的平均嵌合率高达80％，证明sa能够在白血病抑制因子条件下不仅维持mescs干性，同时具有功能性。
综上，本发明利用不同生物材料对丝蛋白取向凝胶进行包被，期望通过调控材料同干细胞的相互作用强度，获得理想的细胞粘附效果。本发明结合结构仿生设计，实现胚胎干细胞命运的体外控制，在无滋养层细胞和基本避免外源性生长因子使用的前提下，采用常规细胞培养手段实现胚胎干细胞的干性长期维持和体外扩增。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.丝蛋白水凝胶，其特征在于，丝蛋白取向凝胶经浓度为0.001％～10％(w/v)的包被材料包被制得；
所述包被材料包括明胶、透明质酸、壳聚糖中的一种或两者以上的混合物；
所述丝蛋白取向凝胶的制备方法为：取蚕丝与盐溶液混合煮沸后清洗、干燥，与libr溶液混合，透析，离心后收集上清，获得丝蛋白溶液；
取所述丝蛋白溶液浓缩后稀释至浓度为0.5～4wt％，静置，获得纳米纤维水凝胶；
取所述纳米纤维水凝胶搅拌，施加电压，于正极收集所述丝蛋白取向凝胶。
2.如权利要求1所述的丝蛋白水凝胶，其特征在于，所述丝蛋白取向凝胶的取向间隔为50～500μm。
3.如权利要求1或2所述的丝蛋白水凝胶，其特征在于，所述纳米纤维水凝胶中纳米纤维的直径为10～20nm，纳米纤维的长度为1～2μm。
4.如权利要求1至3任一项所述的丝蛋白水凝胶在制备干细胞培养基材中的应用。
5.干细胞培养基材，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项所述的丝蛋白水凝胶。
6.干细胞的培养方法，其特征在于，取干细胞接种于如权利要求1至3任一项所述的丝蛋白水凝胶或如权利要求5所述的干细胞培养基材，培养。
7.如权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述接种为采用干细胞完全培养基将胚胎干细胞接种于如权利要求1至3任一项所述的丝蛋白水凝胶，黏附0.5～8h；
所述干细胞完全培养基包含以下组分：终浓度为1000u/ml的白血病抑制因子，高糖dmem基础培养基，终浓度为10％的胎牛血清，终浓度分别为100u/ml和0.1mg/ml的青链霉素，终浓度为0.1mm的β-巯基乙醇，终浓度为1×的mem非必需氨基酸溶液。
8.如权利要求6或7所述的培养方法，其特征在于，所述培养采用的培养基不包括白血病抑制因子。
9.如权利要求6至8任一项所述的培养方法，其特征在于，所述培养为采用无白血病抑制因子培养基培养干细胞；
所述无白血病抑制因子培养基包含以下组分：高糖dmem基础培养基，终浓度为10％的胎牛血清，终浓度分别为100u/ml和0.1mg/ml的青链霉素，终浓度为0.1mm的β-巯基乙醇，终浓度为1×的mem非必需氨基酸溶液。
10.如权利要求9所述的培养方法，其特征在于，所述接种的细胞密度为2×104/cm2～10×104/cm2，所述接种采用的所述干细胞完全培养基或所述培养采用的无白血病抑制因子培养基的用量为0.5ml～2ml。
技术总结