本发明涉及细胞技术领域，更具体地，涉及小鼠骨髓巨噬细胞的制备和鉴定实验技术。
背景技术：
小鼠骨髓来源的巨噬细胞是在巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)或l929细胞培养上清(含巨噬细胞集落刺激因子)等存在下，对未分化的骨髓细胞进行体外分化获得的原代巨噬细胞。原代巨噬细胞可相对高产的获得，可以冷冻储存，特别可以从转基因小鼠品系中获得相应的转基因小鼠原代巨噬细胞，因此，是一种被广泛用于免疫学和细胞生物学中体外研究的原代巨噬细胞。
巨噬细胞于1884年由俄罗斯动物学家
从小鼠组织中分离常驻巨噬细胞产率低且程序复杂，这制约了许多功能性巨噬细胞的研究。用适当的生长因子在体外培养骨髓细胞，以此从前体细胞分化成巨噬细胞是目前一项被业界普遍认可的作法。但是制备小鼠骨髓来源的巨噬细胞存在操作复杂、成功率低、涉及试剂较多和周期长等制备问题。目前有关小鼠骨髓巨噬细胞的制备和鉴定的“一站式”的试剂盒还未报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种小鼠骨髓巨噬细胞制备及检测试剂盒，该试剂盒可用于小鼠骨髓巨噬细胞分离培养，具有集实验操作中所需试剂于一体，使用方便，使用后可以提高小鼠骨髓巨噬细胞得率，细胞贴壁速度稳定，检测方法价格低，成本低等特点；
本发明提供了一种用于制备小鼠骨髓巨噬细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：试剂盒本体，在所述试剂盒本体内盛装有磷酸盐缓冲溶液(10×pbs)试剂瓶、青链霉素抗生素试剂瓶、红细胞裂解液试剂瓶、细胞培养基试剂瓶、胎牛血清试剂瓶、小鼠成纤维细胞l929培养上清试剂瓶、cd11b抗体试剂瓶、吞噬能力鉴定用菌株瓷珠和说明书。
在上述试剂盒中，其中，所述磷酸盐缓冲溶液试剂瓶装有磷酸盐缓冲溶液试剂，磷酸盐缓冲溶液试剂由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠和氯化钾组成，氯化钠1.37mol/l，氯化钾27mmol/l，磷酸氢二钠100mmol/l，磷酸二氢钾18mmol/l，ph7.4；使用时稀释10倍。
在上述试剂盒中，其中，所述青链霉素抗生素试剂瓶装有浓度为10000u/ml青霉素g钠和10mg/ml硫酸链霉素的混合抗生素。
在上述试剂盒中，其中，所述红细胞裂解液试剂瓶装有红细胞裂解液试剂。红细胞裂解液试剂由氯化铵和三羟甲基氨基甲烷组成，氯化铵139.6mmol/l,三羟甲基氨基甲烷16.96mmol/l，ph7.2。
在上述试剂盒中，其中，所述细胞培养基试剂瓶装有细胞培养基试剂，细胞培养基试剂含有dmem培养基。
在上述试剂盒中，其中，所述胎牛血清试剂瓶装有胎牛血清试剂。
在上述试剂盒中，其中，所述小鼠成纤维细胞l929培养上清试剂瓶装有小鼠成纤维细胞l929培养上清试剂。
在上述试剂盒中，其中，所述cd11c抗体试剂瓶装有浓度为0.5mg/ml的异硫氰酸荧光素标记cd11b抗体。
在上述试剂盒中，其中，所述吞噬能力鉴定用菌株试剂瓶装有吞噬能力鉴定用菌株，吞噬能力鉴定用菌株是带有绿色荧光的大肠杆菌。
本发明还提供了上述试剂盒在小鼠骨髓巨噬细胞的制备中的应用。
本发明克服了当前制备和鉴定小鼠骨髓巨噬细胞过程费时，易污染，试剂种类繁多，程序复杂的问题，本发明的小鼠骨髓巨噬细胞制备和鉴定试剂盒具有集实验操作中所需试剂于一体，使用方便，且对小鼠骨髓细胞的诱导条件进行了优化。使用后可以提高小鼠骨髓巨噬细胞得率，细胞贴壁速度稳定，检测方法价格低，成本低等特点；极大的提高了原代细胞培养的制备效率和存活率，建立原代细胞培养体系的成功率高，同时将制备和鉴定集合一起，进行一站式服务。
附图说明
图1是本发明的试剂盒的结构组成示意图。
图2是使用本发明制备的小鼠骨髓巨噬细胞体外培养7天的细胞状态图。
图3是使用本发明制备的小鼠骨髓巨噬细胞流式细胞仪鉴定图
图4是使用本发明制备的小鼠骨髓巨噬细胞吞噬“吞噬能力鉴定用菌株”免疫荧光鉴定图。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买所得。
实施例1：本发明的细胞制备和鉴定试剂盒
本发明的一种组织细胞分离培养试剂盒的实施例，包括试剂盒本体1，在所述的试剂盒本体1内盛装磷酸盐缓冲溶液(10×pbs)试剂瓶2、青链霉素抗生素试剂瓶3、红细胞裂解液试剂瓶4、细胞培养基试剂瓶5、胎牛血清试剂瓶6、小鼠成纤维细胞l929培养上清试剂瓶7、异硫氰酸荧光素标记cd11b抗体试剂瓶8、吞噬能力鉴定用菌株瓶9、试剂盒中还含有说明书10。
具体结构可见图1，图1是本发明试剂盒的结构组成示意图。
所述的磷酸盐缓冲溶液(10×pbs)试剂瓶装有磷酸盐缓冲溶液(10×pbs)试剂，磷酸盐缓冲溶液试剂由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠和氯化钾组成，氯化钠1.37mol/l，氯化钾27mmol/l，磷酸氢二钠100mmol/l，磷酸二氢钾18mmol/l，ph7.4。使用时将其稀释10倍；
所述的青链霉素抗生素试剂瓶装有浓度为10000u/ml青霉素g钠和10mg/ml硫酸链霉素的混合抗生素，使用时将其稀释100倍；
在上述试剂盒中，其中，所述红细胞裂解液试剂瓶装有红细胞裂解液试剂。红细胞裂解液试剂由氯化铵和三羟甲基氨基甲烷组成，氯化铵139.6mmol/l,三羟甲基氨基甲烷16.96mmol/l，ph7.2。
所述细胞培养基试剂瓶装有dmem培养基试剂。
所述胎牛血清试剂瓶装了胎牛血清试剂，使用时dmem培养基和胎牛血清的体积之比为9:1。
所述小鼠成纤维细胞l929培养上清试剂瓶装有小鼠成纤维细胞l929培养上清试剂，小鼠成纤维细胞l929培养上清试剂在诱导小鼠骨髓细胞分化为巨噬细胞时发挥作用，使用时加入细胞培养基中，使用时细胞完全培养基和l929培养上清的体积之比为4:1；
所述的异硫氰酸荧光素标记cd11b抗体试剂瓶为装有浓度为0.5mg/ml的cd11b抗体，cd11b也称为整合素，在单核细胞和巨噬细胞表面大量表达，为鉴定小鼠骨髓巨噬细胞分化成功时免疫荧光检测或流式细胞术染色检测时使用，使用时用磷酸盐缓冲溶液稀释至0.25μg/ml。
所述的吞噬能力鉴定用菌株试剂瓶装有吞噬能力鉴定用菌株，吞噬能力鉴定用菌株是带有绿色荧光的大肠杆菌。其宿主细胞为bl21(de3)，表达载体为pet30a，目的基因为gfp(genbank:aab08060.1)，实验菌株命名为bl21(de3)(pet30a-gfp)，使用时用固体和液体lb培养基培养和异丙基硫代半乳糖苷(iptg)诱导；
所述磷酸盐缓冲溶液(10×pbs)试剂体积为50ml，贴上标签，4℃保存。
所述青链霉素抗生素试剂体积为1ml，贴上标签，-20℃保存。
所述红细胞裂解液试剂体积为20ml，贴上标签，室温保存。
所述dmem培养基体积为270ml，贴上标签，4℃保存。
所述胎牛血清体积为30ml，贴上标签，-20℃保存。
所述诱导小鼠骨髓巨噬细胞所用的小鼠成纤维细胞l929培养上清60ml，贴上标签，-20℃保存。
所述异硫氰酸荧光素标记cd11b抗体试剂体积为20μl，避光密封，贴上标签，-20℃保存。
所述的吞噬能力鉴定用菌株为瓷珠保存，贴上标签，-20℃保存。
操作流程：将制备的小鼠股骨及胫骨，用注射器吸取磷酸盐缓溶液，吹出小鼠骨髓，离心，弃上清，加红细胞裂解液处理，用完全培养基中和之后离心，弃上清，用完全培养基将细胞沉淀吹散后，铺于一次性无菌细菌培养皿中，置于37℃5％co2培养箱中培养4小时后，将悬浮细胞吸出，离心，用加入小鼠成纤维细胞l929培养上清的完全培养基重悬细胞，并置于细胞培养皿中，置于37℃5％co2培养箱中培养7天。培养7天后的骨髓巨噬细胞中可以加入已经诱导好的吞噬能力鉴定用菌株孵育，之后在荧光显微镜下观察吞噬能力；也可以用异硫氰酸荧光素标记cd11b抗体孵育后用流式细胞仪进行鉴定细胞表面标志性抗原。
实施例2：利用本发明的试剂盒制备小鼠骨髓巨噬细胞并对其进行鉴定
本实施以制备和鉴定小鼠骨髓巨噬细胞为例，说明本试剂盒在制备和鉴定小鼠骨髓巨噬细胞中的应用。所用试剂盒为实施例1中所述的试剂盒。
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
制备和鉴定步骤如下：
1、通过窒息安乐死7周龄小鼠，用75％乙醇对小鼠表面进行消毒，之后在紫外照射30分钟的无菌操作台上进行操作，用无菌的手术剪刀在后退上剪一个切口，然后撕扯皮肤，露出肌肉，用无菌剪刀尽可能地剔除肌肉组织，之后取股骨以及胫骨；
2、用无菌剪刀剪除股骨及胫骨两端，暴露出骨髓腔，之后用含1％青链霉素抗生素的2ml磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔，冲出骨髓，重复数次，直至骨骼呈现白色，用移液器吹散骨髓细胞，收集冲洗液放入15ml离心管中；在800rpm，离心5分钟；
3、弃去上清，细胞沉淀用2～3ml红细胞裂解液重悬，20s后加入10ml完全培养基中和，800rpm离心5min，弃去上清；；
4、重悬细胞，接种至细菌培养皿中，加入完全培养基，置于37℃5％co2培养箱中培养4小时；
5、吸出未贴壁的悬浮细胞，离心收获后，加入含20％l929细胞培养上清和1％青链霉素抗生素的完全培养基，以1×106个/ml的密度将细胞接种在细胞六孔板(孔径为34.8mm)中，将培养皿置于37℃5％co2培养箱中培养；
6、每两天，每孔使用2ml含20％l929细胞培养上清的完全培养基对细胞进行换液；
7、在第7天的时候，可对诱导分化的小鼠巨噬细胞进行显微观察并拍照，参见图2。
8、在第7天的时候，可对诱导分化的小鼠巨噬细胞进行巨噬细胞表面标志抗原鉴定，使用细胞刮刀将六孔板中的细胞刮下，吸取细胞悬液于15ml离心管中，800rpm离心5分钟；计数将细胞浓度调整为1×107/ml，加入200μl细胞悬液于1.5ml离心管中，在向其加入2μl异硫氰酸荧光素标记cd11b抗体，4℃避光孵育30min，pbs洗涤2次，细胞过300目滤网，使用流式细胞仪进行鉴定，参见图3。
9、在第7天的时候，在对细胞进行巨噬细胞吞噬能力鉴定。准备事项：将吞噬能力鉴定用菌株画线于含30μg/ml卡那霉素的lb固体平板培养基上，在37℃恒温培养箱培养12小时；次日，挑单菌落于含30μg/ml卡那霉素的10mllb液体培养基中，在37℃，180rmp条件下培养，3h后加入终浓度为1mmiptg进行诱导，诱导3小时后，吸取1ml细菌液，在4000rmp，5min的条件下进行离心，去上清，pbs清洗两遍，通过比浊法将其浓度定为1×108/ml。以感染复数为10:1的比例加入至小鼠巨噬细胞六孔板中。30min后，在荧光显微镜下观察小鼠巨噬细胞的吞噬能力。在荧光显微镜下观察并采集图像参见图4；
用本发明制备小鼠骨髓巨噬细胞，培养6天后，用显微镜观察(200×)参见图2，明显可见细胞贴壁，且细胞形态一致。表明细胞在细胞形态上和巨噬细胞一致，且细胞存活率高。
使用本发明制备小鼠骨髓巨噬细胞，培养6天后，用异硫氰酸荧光素标记cd11b孵育30min后，用流式细胞仪对10000个细胞进行分析，分析前散荧光(反应细胞大小)和侧散荧光(反应细胞内含颗粒大小和数量)的比例，据此对细胞类群进行分析，表明培养的细胞属于同一类群，有少量聚集和细胞碎片产生，同时小鼠骨髓巨噬细胞细胞表面cd11b的阳性率高于85％，参见图3。
使用本发明的试剂盒制备小鼠骨髓巨噬细胞，培养6天后，使用吞噬能力鉴定用菌株做小鼠骨髓巨噬细胞吞噬实验，在免疫荧光镜下观察并且拍照(200×)，发现细胞体内有大量绿色荧光，表明使用本发明制备的小鼠骨髓巨噬细胞具有吞噬能力，参见图4。
本发明克服了目前制备和鉴定小鼠骨髓巨噬细胞过程费时，试剂种类多，程序复杂，易污染的问题。本发明的小鼠骨髓巨噬细胞制备和鉴定试剂盒操作简便，集实验中所需的大部分试剂于一体，并对诱导条件进行了优化，极大的提高了原代细胞培养的制备效率和存活率，建立原代细胞培养体系的成功率高；将制备和鉴定集合一起，为小鼠巨噬细胞的原代培养提供一站式服务，极大地方便了小鼠巨噬细胞的原代培养体系的建立。
本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。
1.一种用于制备小鼠骨髓巨噬细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：
试剂盒本体，在所述试剂盒本体内盛装有磷酸盐缓冲溶液(10×pbs)试剂瓶、青链霉素抗生素试剂瓶、红细胞裂解液试剂瓶、细胞培养基试剂瓶、胎牛血清试剂瓶、小鼠成纤维细胞l929培养上清试剂瓶、cd11b抗体试剂瓶、吐温20试剂瓶、吞噬能力鉴定用菌株瓶和说明书。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述磷酸盐缓冲溶液试剂瓶装有磷酸盐缓冲溶液试剂，磷酸盐缓冲溶液试剂由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠和氯化钾组成，氯化钠1.37mol/l，氯化钾27mmol/l，磷酸氢二钠100mmol/l，磷酸二氢钾18mmol/l，ph7.4。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述青链霉素抗生素试剂瓶装有浓度为10000u/ml青霉素g钠和10mg/ml硫酸链霉素的混合抗生素。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述红细胞裂解液试剂瓶装有红细胞裂解液试剂,红细胞裂解液试剂由氯化铵和三羟甲基氨基甲烷组成，氯化铵139.6mmol/l,三羟甲基氨基甲烷16.96mmol/l，ph7.2。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述细胞培养基试剂瓶装有细胞培养基试剂，细胞培养基试剂含有dmem细胞培养基。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述胎牛血清试剂瓶装有胎牛血清试剂。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述小鼠成纤维细胞l929培养上清试剂瓶装有小鼠成纤维细胞l929培养上清试剂。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述cd11b抗体试剂瓶装有浓度为0.5mg/ml的异硫氰酸荧光素标记cd11b抗体。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述吞噬能力鉴定用菌株试剂瓶装有吞噬能力鉴定用菌株，吞噬能力鉴定用菌株是带有绿色荧光的大肠杆菌。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的试剂盒在小鼠骨髓巨噬细胞的制备中的应用。
技术总结