【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种胎盘造血干细胞提取的方法。
背景技术：
人类胎盘是宝宝赖以生存的各种营养物质输送的纽带，由羊膜、绒毛膜和基蜕膜构成。羊膜和绒毛膜来源于胎儿，不同区域的基蜕膜则起源于母体。胎盘除在胎儿发育、营养支持和维持耐受中发挥重要作用外，还是一个干细胞储备库。胎盘来源的造血干细胞，可以分化成各种血液细胞和免疫细胞，因此在未来可以和脐带血中的造血干细胞一样用于恶性血液疾病的治疗。对人类胎盘的研究发现，胎盘是一个造血器官。从怀孕第三周开始直至出生，胎盘在发挥物质交换、免疫调控、活性因子分泌等功能的同时，也承担着造血功能。
从胎盘中提取的造血干细胞不但具有含量丰富和移植后排斥反应低、无伦理障碍等优点，还有以下优点:胎盘中的造血干细胞更为早期，增殖能力强；胎盘众多的造血干细胞还可用来大规模制备红细胞和巨核细胞/血小板，用来替代输血。
鉴于胎盘造血干细胞的这些优点，胎盘组织造血干细胞库技术的开展是干细胞研究领域的一大进展，将有效解决移植时骨髓或动员后外周血来源不足，脐带血数量不够等技术难题，有望取代骨髓、动员后外周血和脐带血用于造血干细胞移植治疗恶性血液系统疾病，因此，胎盘造血干细胞的提取至关重要。
目前现行的最接近的技术方案：将胎盘组织剪碎，清洗得到造血干细胞的方法，但得到的干细胞数量较少，容易染菌。因此，我们提出一种胎盘造血干细胞提取的方法。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提供一种胎盘造血干细胞提取的方法，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种胎盘造血干细胞提取的方法，其步骤具体如下：
步骤一：将胎盘运到实验室，准备ep管、冰冻袋并粘贴条码，其中5个ep管标注母血“m”，4个ep管标注脐血“q”。取脐血全血1ml和0.5ml于2个ep管中(1ml冻存保存，0.5ml血型检测)，然后将剩余脐血与母血采用1500rpm/5min离心后分装，离心脐血并分装上清液，上清液装入2支ep管中，每管0.5ml，冻存，离心母血并分装上清液，装入4支ep管中，其中3支ep管冻存用于复核复检，每支约0.5ml，1支按照第三方检测单次检测用量需要分装后送检，用于传染病五项和alt检测；母血球转到1支ep管中，与母血浆、脐血一起冻存保存，登记样本储存位置。
步骤二：用na清洗胎盘至清洗液颜色淡红，至少清洗胎盘15次。
步骤三：将胎盘内的脐带通过泵管与泵的一端连接，同时将泵的另一端通过泵管与三联袋中的一个袋连接，三个袋均通过连接管相互连接，开通泵，将分布在胎盘绒毛微血管中的胎儿血抽出，移到三联袋。
步骤四：将胎盘内的绒毛微血管与带针头导管的一端连接，且带针头导管另一端置于消化液中，开泵，将胎盘中剩余的血液清洗完全。
步骤五：清洗完毕后，关闭泵，热合三联袋采血管道。
步骤六：采用压浆法，提取造血干细胞。
步骤七：将血袋置摇床混匀5min，并分流一小部分到小转移袋中。
步骤八：将混匀后血袋放置于双人双面超净台上，用碘伏棉球和乙醇消毒液棉球消毒后，从小转移袋中抽取2.5mlhsc样本血样并分装到3个贴有条形码的ep管中，分别为1.5ml、0.5ml和0.5ml(其中1.5ml为出库hsc复核备用，置-20℃保存；0.5ml再分装后分别用于细胞计数、活性测定、血型测定；0.5ml用于cfu-gm培养)，如做分型，增加取样1.5ml用于hla分型检测。
步骤九：根据血量加入hes，在双人双面超净台内，用碘伏和乙醇消毒液棉球消毒后，在血袋中加入所需的hes，置摇床混匀5min。
步骤十：血分仪分析细胞数量。
步骤十一：细胞活性测定
步骤十二：将血袋配平后放入大型落地式冷冻离心机，温度4-10℃，转速480rpm，离心6min。
步骤十三：压浆。
步骤十四：将血袋放回大型落地式冷冻离心机内原位置，温度4-10℃，转速1500rpm，离心5min。
步骤十五：压浆。
步骤十六：重复上述15-16步骤。
步骤十七：高速离心后，使用分浆夹分出转移袋中部分血浆到样本采集袋中(控制转移袋中血20～40ml)并使血浆留在血袋导管中，在转移袋一端热合剪下后在洁净a级区内用注射器抽取导管中血浆分别注入3个ep管中，连同hsc样本全血、母血血浆、母血血球一起放-20℃冰箱(共计8管)保存以备复核，关闭血袋导管上的夹子热合剪下部分导管。
步骤十八：取热合后的样本采集袋，用于接种检菌瓶，进行细菌培养。
步骤十九：混匀含白细胞的转移袋，在a级工作台内消毒(碘伏、乙醇消毒液)血袋外口，用50ml注射器取出浓缩的白细胞转移至冰冻袋内，同时留取血样0.5ml，用于制备后细胞分类计数和cd34 cd45dim流式细胞检测。
步骤二十：配制冷冻保护剂，按照冰冻袋内hsc体积，对照换算表抽取适量dmso和右旋糖酐，使dmso保护细胞的终浓度为9.8％，混匀后放-20℃冰箱冷却平衡5-15min到4℃以下，同时把hsc冰冻袋放4℃冰箱平衡15min。
步骤二十一：消毒冰冻袋管口按照条形码号连接对应注射器，冰冻袋平整摆放在水平摇床上固定，将注射器固定于10通道自动注射泵上，将细胞冷冻保护剂缓慢匀速地注入冰冻袋中，排出注射器和导管内剩余细胞冷冻保护剂到hsc中，使hsc与细胞冷冻保护剂充分混匀，避免出现细胞冻伤现象。
步骤二十二：热合掉冰冻袋导管，同时每一份hsc预留2节hsc血样，粘贴对应条形码，将冰冻袋和一节血样放入已预冷的冻存盒内(已粘贴对应条形码)，另一节hsc血样转入样本孔，核对样本与冻存盒、冰冻袋一致无误后，连同样本转交表交予冻存室，并做好记录。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：制备过程简单化，操作方便，减少机械化损伤；整个过程血液未离开无菌环境，降低染菌率。
附图说明
图1为本发明胎盘造血干细胞提取的方法中胎盘血液抽出流程示意图。
图中：1、绒毛微血管；2、消化液；3、带针头导管；4、脐带；5、泵；6、三联袋；7、泵管；8、连接管。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
如图1所示，一种胎盘造血干细胞提取的方法，其步骤具体如下：
步骤一：将胎盘运到实验室，准备ep管、冰冻袋并粘贴条码，其中5个ep管标注母血“m”，4个ep管标注脐血“q”。取脐血全血1ml和0.5ml于2个ep管中1ml冻存保存，0.5ml血型检测，然后将剩余脐血与母血采用1500rpm/5min离心后分装，离心脐血并分装上清液，上清液装入2支ep管中，每管0.5ml，冻存，离心母血并分装上清液，装入4支ep管中，其中3支ep管冻存用于复核复检，每支约0.5ml，1支按照第三方检测单次检测用量需要分装后送检，用于传染病五项和alt检测；母血球转到1支ep管中，与母血浆、脐血一起冻存保存，登记样本储存位置。
步骤二：用na清洗胎盘至清洗液颜色淡红，至少清洗胎盘15次。
步骤三：将胎盘内的脐带4通过泵管7与泵5的一端连接，同时将泵5的另一端通过泵管7与三联袋6中的一个袋连接，三个袋均通过连接管8相互连接，开通泵5，将分布在胎盘的绒毛微血管1中的胎儿血抽出，移到三联袋6。
步骤四：将胎盘内的绒毛微血管1与带针头导管3的一端连接，且带针头导管3另一端置于消化液2中，开泵，将胎盘中剩余的血液清洗完全。
步骤五：清洗完毕后，关闭泵，热合三联袋6采血管道。
步骤六：采用压浆法，提取造血干细胞。
步骤七：将血袋置摇床混匀5min，并分流一小部分到小转移袋中。
步骤八：将混匀后血袋放置于双人双面超净台上，用碘伏棉球和乙醇消毒液棉球消毒后，从小转移袋中抽取2.5mlhsc样本血样并分装到3个贴有条形码的ep管中，分别为1.5ml、0.5ml和0.5ml其中1.5ml为出库hsc复核备用，置-20℃保存；0.5ml再分装后分别用于细胞计数、活性测定、血型测定；0.5ml用于cfu-gm培养，如做分型，增加取样1.5ml用于hla分型检测。
步骤九：根据血量加入hes，在双人双面超净台内，用碘伏和乙醇消毒液棉球消毒后，在血袋中加入所需的hes，置摇床混匀5min。
步骤十：血分仪分析细胞数量。
步骤十一：细胞活性测定
步骤十二：将血袋配平后放入大型落地式冷冻离心机，温度4-10℃，转速480rpm，离心6min。
步骤十三：压浆。
步骤十四：将血袋放回大型落地式冷冻离心机内原位置，温度4-10℃，转速1500rpm，离心5min。
步骤十五：压浆。
步骤十六：重复上述15-16步骤。
步骤十七：高速离心后，使用分浆夹分出转移袋中部分血浆到样本采集袋中控制转移袋中血20～40ml并使血浆留在血袋导管中，在转移袋一端热合剪下后在洁净a级区内用注射器抽取导管中血浆分别注入3个ep管中，连同hsc样本全血、母血血浆、母血血球一起放-20℃冰箱共计8管保存以备复核，关闭血袋导管上的夹子热合剪下部分导管。
步骤十八：取热合后的样本采集袋，用于接种检菌瓶，进行细菌培养。
步骤十九：混匀含白细胞的转移袋，在a级工作台内消毒碘伏、乙醇消毒液血袋外口，用50ml注射器取出浓缩的白细胞转移至冰冻袋内，同时留取血样0.5ml，用于制备后细胞分类计数和cd34 cd45dim流式细胞检测。
步骤二十：配制冷冻保护剂，按照冰冻袋内hsc体积，对照换算表抽取适量dmso和右旋糖酐，使dmso保护细胞的终浓度为9.8％，混匀后放-20℃冰箱冷却平衡5-15min到4℃以下，同时把hsc冰冻袋放4℃冰箱平衡15min。
步骤二十一：消毒冰冻袋管口按照条形码号连接对应注射器，冰冻袋平整摆放在水平摇床上固定，将注射器固定于10通道自动注射泵上，将细胞冷冻保护剂缓慢匀速地注入冰冻袋中，排出注射器和导管内剩余细胞冷冻保护剂到hsc中，使hsc与细胞冷冻保护剂充分混匀，避免出现细胞冻伤现象。
步骤二十二：热合掉冰冻袋导管，同时每一份hsc预留2节hsc血样，粘贴对应条形码，将冰冻袋和一节血样放入已预冷的冻存盒内已粘贴对应条形码，另一节hsc血样转入样本孔，核对样本与冻存盒、冰冻袋一致无误后，连同样本转交表交予冻存室，并做好记录。
1.一种胎盘造血干细胞提取的方法，其步骤具体如下：
步骤一：将胎盘运到实验室，准备ep管、冰冻袋并粘贴条码，其中5个ep管标注母血“m”，4个ep管标注脐血“q”。取脐血全血1ml和0.5ml于2个ep管中(1ml冻存保存，0.5ml血型检测)，然后将剩余脐血与母血采用1500rpm/5min离心后分装，离心脐血并分装上清液，上清液装入2支ep管中，每管0.5ml，冻存，离心母血并分装上清液，装入4支ep管中，其中3支ep管冻存用于复核复检，每支约0.5ml，1支按照第三方检测单次检测用量需要分装后送检，用于传染病五项和alt检测；母血球转到1支ep管中，与母血浆、脐血一起冻存保存，登记样本储存位置。
步骤二：用na清洗胎盘至清洗液颜色淡红，至少清洗胎盘15次。
步骤三：将胎盘内的脐带(4)通过泵管(7)与泵(5)的一端连接，同时将泵(5)的另一端通过泵管(7)与三联袋(6)中的一个袋连接，三个袋均通过连接管(8)相互连接，开通泵(5)，将分布在胎盘的绒毛微血管(1)中的胎儿血抽出，移到三联袋(6)。
步骤四：将胎盘内的绒毛微血管(1)与带针头导管(3)的一端连接，且带针头导管(3)另一端置于消化液(2)中，开泵，将胎盘中剩余的血液清洗完全。
步骤五：清洗完毕后，关闭泵，热合三联袋(6)采血管道。
步骤六：采用压浆法，提取造血干细胞。
步骤七：将血袋置摇床混匀5min，并分流一小部分到小转移袋中。
步骤八：将混匀后血袋放置于双人双面超净台上，用碘伏棉球和乙醇消毒液棉球消毒后，从小转移袋中抽取2.5mlhsc样本血样并分装到3个贴有条形码的ep管中，分别为1.5ml、0.5ml和0.5ml(其中1.5ml为出库hsc复核备用，置-20℃保存；0.5ml再分装后分别用于细胞计数、活性测定、血型测定；0.5ml用于cfu-gm培养)，如做分型，增加取样1.5ml用于hla分型检测。
步骤九：根据血量加入hes，在双人双面超净台内，用碘伏和乙醇消毒液棉球消毒后，在血袋中加入所需的hes，置摇床混匀5min。
步骤十：血分仪分析细胞数量。
步骤十一：细胞活性测定
步骤十二：将血袋配平后放入大型落地式冷冻离心机，温度4-10℃，转速480rpm，离心6min。
步骤十三：压浆。
步骤十四：将血袋放回大型落地式冷冻离心机内原位置，温度4-10℃，转速1500rpm，离心5min。
步骤十五：压浆。
步骤十六：重复上述15-16步骤。
步骤十七：高速离心后，使用分浆夹分出转移袋中部分血浆到样本采集袋中(控制转移袋中血20～40ml)并使血浆留在血袋导管中，在转移袋一端热合剪下后在洁净a级区内用注射器抽取导管中血浆分别注入3个ep管中，连同hsc样本全血、母血血浆、母血血球一起放-20℃冰箱(共计8管)保存以备复核，关闭血袋导管上的夹子热合剪下部分导管。
步骤十八：取热合后的样本采集袋，用于接种检菌瓶，进行细菌培养。
步骤十九：混匀含白细胞的转移袋，在a级工作台内消毒(碘伏、乙醇消毒液)血袋外口，用50ml注射器取出浓缩的白细胞转移至冰冻袋内，同时留取血样0.5ml，用于制备后细胞分类计数和cd34 cd45dim流式细胞检测。
步骤二十：配制冷冻保护剂，按照冰冻袋内hsc体积，对照换算表抽取适量dmso和右旋糖酐，使dmso保护细胞的终浓度为9.8％，混匀后放-20℃冰箱冷却平衡5-15min到4℃以下，同时把hsc冰冻袋放4℃冰箱平衡15min。
步骤二十一：消毒冰冻袋管口按照条形码号连接对应注射器，冰冻袋平整摆放在水平摇床上固定，将注射器固定于10通道自动注射泵上，将细胞冷冻保护剂缓慢匀速地注入冰冻袋中，排出注射器和导管内剩余细胞冷冻保护剂到hsc中，使hsc与细胞冷冻保护剂充分混匀，避免出现细胞冻伤现象。
步骤二十二：热合掉冰冻袋导管，同时每一份hsc预留2节hsc血样，粘贴对应条形码，将冰冻袋和一节血样放入已预冷的冻存盒内(已粘贴对应条形码)，另一节hsc血样转入样本孔，核对样本与冻存盒、冰冻袋一致无误后，连同样本转交表交予冻存室，并做好记录。
技术总结