本发明涉及一种神经干细胞的培养方法，特别涉及一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法。
背景技术：
神经干细胞是指神经系统中处于较早发育阶段的细胞群体,它们可以通过自身的对称性或不对称性两种分裂方式进行自我复制,产生神经组织中不同发育阶段和不同分化方向的细胞,最终生成具有一定细胞数目和多种细胞类型的神经成神经元和星形胶质细胞及少突胶质细胞等三类细胞。神经干细胞对神经系统的损伤和神经退行性疾病都有直接或间接的治疗作用，因此一种临床用大规模培养神经干细胞的培养基具有巨大的应用价值。
神经干细胞的培养主要有两种方式:单层培养和神经球悬浮培养。悬浮聚球培养方式可以很好的支持干细胞的增殖并同时保持其特性，同时悬浮培养的方式也为以后实现干细胞在临床实验批量使用成为可能。
技术实现要素：
本发明提供一种神经干细胞培养基，其可用于人神经干细胞体外长期大量培养扩增。
本发明还提供一种所述利用神经干细胞培养基进行的人神经干细胞体外长期培养扩增方法培养的细胞性能稳定，并保持较高的干性。
本发明还提供一种所述利用神经干细胞培养基进行的人神经干细胞体外长期培养扩增方法，该方法能解决临床用干细胞批量生产问题。
一种神经干细胞培养基，该神经干细胞培养基包括以下组分：dmem/f12、非必需氨基酸、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、wnt3a、notch1、牛血清白蛋白、肝素钠、腐胺、亚硒酸钠、glutamax-i、内皮生长因子、黄体酮、hepes、nahco3。
作为优选，该神经干细胞培养基包括以下体积配比的组分：dmem/f1298ml，非必需氨基酸1ml，glutamax-i1ml。
作为优选，该神经干细胞培养基中重组人表皮生长因子用量是0.5-1μg。
作为优选，该神经干细胞培养基中重组人碱性成纤维细胞生长因子用量是0.5-1μg。
作为优选，该神经干细胞培养基中重组人胰岛素用量是1-2.5mg。
作为优选，该神经干细胞培养基中氢化可的松用量是100-1000μg。
作为优选，该神经干细胞培养基中wnt3a用量是10-50nmol/l。
作为优选，该神经干细胞培养基中notch1用量是10-50nmol/l。
作为优选，该神经干细胞培养基中肝素钠用量是10-50μg。
作为优选，该神经干细胞培养基中亚硒酸钠用量是5-10μg。
作为优选，该神经干细胞培养基中重组人内皮生长因子用量是0.5-2μg。
作为优选，该神经干细胞培养基中黄体酮用量是1-2μg。
作为优选。该神经干细胞培养基用hepes和nahco3共同维持培养基ph值。
作为优选，该神经干细胞培养基的ph值为7.0-7.2。
经过研究发现本方法极大的保持细胞活率(>95％)。
本发明选用商品化的dmem/f12培养液作为神经干细胞培养的基础培养基；
特殊成分的作用机理说明：肝素有下列特殊作用：1)可以与许多种蛋白质结合，增强蛋白质作用；2)促进干细胞增殖作用；3)能够间接抑制神经元，间接地达到抑制神经干细胞分化作用，有利于长期神经干细胞培养。wnt3a；notch1；胰岛素作用是通过促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，从而促进细胞分裂、生长。氢化可的松促进神经干细胞生长发育；腐胺能够刺激和诱导神经干细胞生长和增殖。亚硒酸钠促进和参与神经干细胞代谢；l-谷氨酰胺可促进神经神经干细胞发育生长期间核酸、蛋白质的合成；人转铁蛋白可结合铁离子，使神经干细胞细胞合理利用铁离子，并减少其对细胞的毒性，并且抑制成纤维细胞生长，有利于神经干细胞增多；黄体酮具有促进神经干细胞生长和调节作用。hepes和nahco3是维持细胞液中酸碱平衡作用。
本发明提供的的神经干细胞培养基能够使人神经干细胞在体外长期(>30代次)培养扩增，大量扩增后神经干细胞性能稳定；用本发明培养的神经干细胞高表达巢蛋白(nestin)、musashi、cd133等神经干细胞表面的特异性标记物；所培养的干细胞可进一步诱导分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。本发明很好地解决了人神经干细胞体外培养易分化和难以长期培养扩增的技术难题，从而为临床应用提供来源和标准统一的大量的神经干细胞，此外，本发明提供方法配制简单，实验可重复性强，操作简单易行。本发明解决了神经干细胞及其临床使用细胞来源问题，使神经干细胞在神经系统损伤和退行性疾病治疗、干细胞定向分化和毒理学、药理学以及其它功能应用成为可能。
附图说明
图1是培养7天人神经干细胞球显微照片(100倍放大)；
图2是培养7天人神经干细胞切片的nestin荧光标记显微照片(200倍放大)；
图3是培养7天人神经干细胞切片的musashi荧光标记显微照片(200倍放大)；
图4是培养7天人神经干细胞切片的cd133荧光标记显微照片(200倍放大)；
图5是培养7天人神经干细胞分化后用gfap抗体荧光标记显示星形胶质细胞图(200倍放大)；
图6是培养7天人神经干细胞分化后用tuj-1抗体荧光标记显示星形胶质细胞图(200倍放大)；
图7是培养7天人神经干细胞分化后用pdgf抗体荧光标记显示星形胶质细胞图(200倍放大)。；
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1神经干细胞的培养扩增
(1)传代扩增方式：采用所述神经干细胞培养基进行培养扩增，细胞瓶置于5％co2、37℃温度培养箱中进行培养，根据细胞增殖情况，每3-4天半量更换神经干细胞培养基一次；神经干细胞在神经干细胞培养基中连续培养，当大部分神经干细胞的干细胞球直径为500-700微米时，利用accutase37℃消化神经球成单细胞，经离心后去除，并加入一半新配制的神经干细胞培养基和另一半使用后的神经干细胞培养基互相混合，按1:2或1:4比例分瓶传代继续培养。按这种传代扩增方式可以使人神经干细胞连续培养扩增30代次以上。
实施例2神经干细胞球切片及标记蛋白鉴定
①观察细胞球，选取直径200-300um(约培养4天)的神经球一瓶，分装至3个50ml离心管内，自沉降后吸弃上清，速冻后用o.c.t包埋；
②设置切片机箱体-21℃，样品头-21℃—-19℃切片，厚度为4.5um；
③将切片置于60烘箱过夜；
④取出切片置于-20℃冻存待用；
⑤冰冻切片室温丙酮(冷丙酮)固定10min，pbs洗10min×3；
⑥缓冲液漂洗3次后，用含5％正常山羊血清的dpbs(含0.1％tritonx-100)在37℃温育30min进行封闭或4℃过夜；
⑦置切片于湿盒内，分别滴加一抗37℃4℃过夜；pbs洗10min×3；
⑧分别滴加二抗37℃30min；pbs洗10min×3；
⑨用1ug/mldapi染色10min；pbs洗10min×3；
⑩用封片液封片，荧光显微镜下观察结果。
实施例3神经干细胞的分化鉴定
神经干细胞可以分化成神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经元内含有β-tubliniii抗原，用β-tubliniii抗体荧光标记细胞，检测是否是神经元。星形胶质细胞内含有gfap抗原蛋白，用gfap抗体荧光标记细胞，检测是否是星形胶质细胞。少突胶质细胞内含(o4)抗原蛋白，用o4抗体荧光标记细胞，检测是否是少突胶质细胞。
实验方法
(1)取培养7天的神经干细胞球直接吹打或用accutase溶液消化神经干细胞球和吹打后制成单细胞悬液。
(2)细胞以3×104/ml密度种于经多聚赖氨酸(100mg/ml)包被的玻璃盖玻片上，在dmem/f12培养基中添加1％胎牛血清(fbs)，b27添加剂(1：50稀释)，撤除生长因子(egf,bfgf)进行分化培养。
(3)培养3天后用免疫细胞化学染色
①取培养3天神经干细胞的单细胞的盖玻片，用4％多聚甲醛 0.3％triton-x100固定15min；
②用dpbs漂洗3次后，用含5％正常山羊血清的dpbs(含0.1％tritonx-100)在37℃温育30min进行封闭；
③在生长有细胞的盖玻片上，分别加抗βⅲ微管蛋白(β-tubulinⅲ)单抗、抗胶质源酸性蛋白(gfap)单抗、少突标记蛋白(o4)抗体，4℃反应过夜；
④用含0.1％tritonx-100的dpbs漂洗3次，各10min；
⑤分别滴加二抗37℃30min；pbs洗10min×3；
⑥用1ug/mldapi染色10min；pbs洗10min×3；
⑦用封片液封片，荧光显微镜下观察结果。
实施例4神经干细胞基因鉴定(str分析法)
神经干细胞(neuralstemcell，nsc)不仅具有自我更新能力，还能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。长期培养神经干细胞时，由于微环境等多种影响因素可能使神经干细胞突变或遗传不稳定，所以需要用更先进的分析方法确定神经干细胞在长期培养过程中遗传是否稳定。
短串联重复序列(shorttandemrepeats，str)分析法又称为微卫星dna，重复单位为2-6bp，重复次数10～60多次，基因片段，400bp以下。str分布于染色体中，多位于非编码区附近，也可位于内含子、启动子、ali序列中，由于其核心序列单位数目的变化，因此其在人群中变异较大，构成了str的遗传多态性，现今str分析法已经广泛应用于基因定位、法医学鉴定、人类学以及遗传病的诊断等许多研究领域中。我们用str分析法了解我们长期培养的神经干细胞是否神经干细胞和遗传稳定性。
实验方法
2)、str试剂盒
str试剂盒由promega公司生产，试剂盒名称：16hssystem。编号：dc2101。
3).人神经干细胞总dna提取
(1)人神经干细胞培养
(2)每样品取1.5-1.6x106神经干细胞，胰蛋白酶37℃消化5min，1000rpm离心5min，弃上清液，加d-hank’s液悬浮沉淀细胞，重复1次；5000g离心5min，弃上清液；加入500μl细胞裂解液(内含protenasek5μl)，颠倒20次，50℃水浴3h，半小时摇动一次；冷却至室温，加入500μl平衡酚，快速颠倒1min混匀；5000g离心15min，吸取上层水相加入ep管中；水相中加入氯仿/异戊醇(24∶1)450μl，混匀，5000g离心15min；吸取上层水相与新ep管中，加入10μlrnaasea稀释液(1μlrnaasea 9μlbuffer)，37℃水浴30min；加入50μl3mol/lnaac(1/10体积)，无水乙醇加满(2.5倍体积)ep管，混匀，-20℃静置30min；10000g离心15min，弃上清；70％冷乙醇洗涤1～2次，再用无水乙醇清洗，12000g离心10min，弃上清，风干；加入10μlte缓冲液(1μl 9μl无菌水)，-20℃保存。
4)、琼脂糖凝胶电泳
(1)dnamarker：5μldl15,000；(2)电解液：tae稀释液；
(3)电泳电压：170v；(4)电泳时间：30min
5)、str反应体系
dna：最大上样量17.5μl；
5×mastermix：5μl；
10×primerpairmix：2.5μl；
去离子水：补足25μl。
6)、pcr反应
(1)反应条件96℃,2分钟；94℃，30秒循环10次；60℃30秒，循环10次；
70℃45秒循环10次；90℃30秒，循环22次；60℃30秒，循环22次；70℃45秒，循环22次；60℃分钟，4℃保存。
实施例5神经干细胞端粒酶鉴定
端粒是保护染色体末端稳定必不可少的结构。端粒长度的维持需要端粒酶活性的存在。永生细胞和肿瘤细胞能够长期生存，端粒酶起到了重要的作用。端粒酶与细胞的增殖、分化和不死性有着极为密切的关系，端粒酶显著增高与细胞癌变和细胞凋亡或衰老有正相关。
干细胞是具有增殖和分化潜能的细胞，具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。但其在体外长期培养中，分裂次数很多，存在细胞癌变的可能，因此，长期培养过程中，对其进行安全性检测极为重要。本实验通过对端粒酶活性的检测，判断长期培养神经干细胞是否可能成为癌变细胞和细胞凋亡。
实验方法
1).分组：培养7天人神经干细胞(4代、10代、30代)，以hela细胞作为阳性对照，成纤维细胞作为阴性对照；
2).试剂盒：
roche公司生产的试剂盒，名称为telotagggtelomerasepcrelisakit.编号：11854666910。
3)、制备细胞
(1)取连续培养2-24个月的人神经干细胞(nsc)球，弃上清，用d-hanks液清洗2遍；
(2)0.25％胰蛋白酶(1∶5d-hanks液体稀释)37℃消化5min(肿瘤细胞imr-32取消此步骤)，移入15ml离心管中；
(3)4℃955g离心5min，弃上清液，加dmem培养液打散；
(4)加1∶10稀释台盼蓝染色(20μl细胞 80μl染液)，计数；
(5)取约2x105细胞于1.5mlep管内，4℃3000g离心5min，弃上清；
(6)3000g离心5min，弃上清液，加d-hank’s液悬浮沉淀细胞，重复1次；3000g离心5min，弃上清液；
4)、提取rna及pcr
(1)将细胞小团在200μl裂解试剂(lysisreagent，1液)中重悬，冰上预冷并提吸至少3次，冰中孵育30min。如果将冷冻细胞团用于提取，加入裂解液前在冰上融化细胞团。
(2)4℃16000g离心20min，取上清液移入离心管中；
(3)将25μl反应复合物(reactionmixture，2液)加入适合pcr扩增的管中，加入3μl细胞提取物(相当于3x103细胞或50ug总蛋白)。并加入无菌水至总体积50ul，所有吸取步骤在冰上进行；
(4)trap-pcr。
5)、elisa检测
(1)取20μl变性试剂(denaturationreagent，3液)于离心管中(若有大量样本，建议使用无核酸酶包被的微孔板mtp)，加入5μlpcr扩增产物，20℃孵育10分钟；
(2)加入225μl杂交缓冲液(hybrizationbuffer，4液)，振荡器混匀；
(3)取100μl混合物加入mtp微孔板中，盖好金属纸，37℃300rpm振荡器中孵育2h；
(4)弃去全部液体，以清洗缓冲液(washingbuffer，5液体，试剂盒10×，使用时稀释为1×)洗3次，每孔250μl，每次至少30秒，弃去冲洗液；
(5)加入100μl抗-dig-pod工作液(anti-dig-pod，6液，使用时50倍稀释，配制成工作液)，盖好金属纸，20℃300rpm振荡器中孵育2h；
(6)弃去液体，每孔250μl清洗缓冲液冲洗5次，每次至少1.5min，小心弃去冲洗缓冲液；
(7)加入100μltmb底物溶液(tmbsubstratesoulation，8液)，盖上金属纸，20℃300rpm振荡器中孵育20min；
(8)加入100μl终止液(stopreagent，9液)，终止反应；
(9)待pod底物的颜色从蓝转黄，30min内分别检测450nm、690nm吸光度值。
1.一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基包括以下组分：dmem/f12、非必需氨基酸、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、wnt3a、notch1、牛血清白蛋白、肝素钠、腐胺、亚硒酸钠、glutamax-i、内皮生长因子、黄体酮、hepes、nahco3。
2.根据权利要求1所述的适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基包括以下体积配比的组分：dmem/f1298ml，非必需氨基酸1ml，glutamax-i1ml。
3.根据权利要求1所述的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该干细胞培养基中重组人表皮生长因子用量是0.5-1μg。
4.根据权利要求1所述的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基中重组人碱性成纤维细胞生长因子用量是0.5-1μg。
5.根据权利要求1所述的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基中重组人胰岛素用量是1-2.5mg。
6.根据权利要求1所述的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基中氢化可的松用量是100-1000μg。
7.根据权利要求1所述的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基中wnt3a用量是10-50nmol/l。
8.根据权利要求1所述的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基中notch1用量是10-50nmol/l。
9.根据权利要求1所述的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基中肝素钠用量是10-50μg。
10.根据权利要求1所述的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基中亚硒酸钠用量是5-10μg。
11.根据权利要求1所述的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基中重组人内皮生长因子用量是0.5-2μg。
12.根据权利要求1所述的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基中黄体酮用量是1-2μg。
13.根据权利要求1所述的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基用hepes和nahco3共同维持培养基ph值。
14.根据权利要求1所述的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基的ph值为7.0-7.2。
15.根据权利要求1所述的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，经过研究发现本方法极大的保持细胞活率(>95％)。
技术总结