本发明涉及肿瘤干细胞分离技术，尤其涉及卵巢癌干细胞分离技术。
背景技术：
肿瘤干细胞(cancerstemcells,cscs)是肿瘤中具有高度的增殖、自我更新和分化潜能的一类细胞，同时具备干细胞和肿瘤细胞的特征，它们被认为是肿瘤演进、转移复发的“种子”，大量的临床和实验观察证实它们与肿瘤放化疗耐受以及肿瘤患者预后较差密切相关。很多研究已证实多种实体肿瘤中含有cscs。然而，越来越清楚的是，cscs不一定是罕见和/或静止的。肿瘤干细胞的发现和理论深入离不开对肿瘤标志物的研究。不同肿瘤组织所含的cscs标志物不尽相同，目前体外实验已证实卵巢癌中高表达aldh1、cd133、cd44等分子的这一类细胞具有致瘤性和促进肿瘤转移的能力。
cscs在肿瘤组织和细胞中只占很少的比例，一般不到1％，因此cscs的分离有难度。常见分离cscs的常用技术有以下两大类：第一，利用cscs表面标志物进行分离(以cscs标志物、生物酶类及特定染料等为基础的流式细胞术；免疫磁珠技术)；第二，利用cscs的生物学特性进行分离(无血清悬浮成球培养；根据cscs的耐药特性,采用hoechst33342染色分选侧群(sidepopulation,sp)细胞；cscs异体成瘤富集)。其中最为常用及可靠的方法就是利用cscs表面标志物来进行筛选分离。研究发现，cscs与一般的干细胞具有一些相似性(自我更新和多向分化)，最初用于分析成体干细胞的方法被用来研究cscs。体内成瘤实验是目前能用于cscs鉴定的金标准。该方法包括评估cscs在免疫缺陷小鼠中的成瘤能力。最初是用来检测白血病。随后，其应用被拓展到实体瘤，包括乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌和头颈癌。然而，体内成瘤实验不仅昂贵，而且耗时，平均需要6个月，甚至更长时间。因此，需要一个有效而且廉价的体外实验模型。肿瘤成球实验被普遍用于各种cscs相关的研究，常常作为体内成球实验的替代方法。
近些年，随着在不同肿瘤中更多cscs相关标志物的发现，该方法不仅用于cscs的分离鉴定，临床诊断和基础研究中，也在开发抗cscs靶向治疗的方法中，均具有非常好的前景。cscs理论可能是目前生物医学研究最具争议的话题之一，近10年，出现了肿瘤干细胞、干细胞样肿瘤细胞、肿瘤启动细胞及肿瘤增殖细胞等多种命名方式。关于cscs理论的争议，主要集中在cscs的来源，以及其表型和功能特征。最近一些cscs相关的临床试验，取得了振奋人心的结果，初步证明针对cscs治疗方式的可行性。随着对cscs生物学了解的深入，功能分析模型的改善及在生物技术上的进步(基因表达谱分析、二代测序和高通量筛选)，靶向cscs治疗为复发性及对传统治疗方法耐受的肿瘤提供了非常有潜力的治疗手段。cscs驱使肿瘤的侵袭和复发，因此鉴别和纯化cscs是cscs研究中的关键。
尽管分析细胞表面标志物是一种非常方便鉴别方法，但其可靠性依赖于所选择的标志物是否稳定、普遍和特异，在cscs鉴别中受肿瘤表型和基因的异质性的影响。因此，在过去的10年间，研究者尽管发现了通过肿瘤不同的表面标志物的组合能成功检测和分离不同类型的cscs，但在临床上将该方法标准化还是一个极大的挑战。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法。
本发明通过基因库挖掘及生信分析的手段，实验分为三组：人卵巢癌a2780贴壁细胞组、ocscs细胞球组以及ocscs分化的贴壁细胞组，结果发现ocscs细胞球组与另外两组相比较，ocscs细胞球组高表达aldh1、c-myc、β-catenin及cd133，oct4中度表达。本发明分离ocscs的思路：选用人卵巢癌a2780细胞株，先采用无血清悬浮成球培养的方法初步筛选，或加用化疗药物顺铂杀灭普通的卵巢癌细胞，达到富集ocscs细胞球的目的；选择ocscs的表面标志物aldh1,使用aldefluortmassay流式分选获得aldh1 ocscs及aldh1-a2780细胞；使用含生长因子的无血清培养基悬浮培养，本发明流式分选出来的aldh1 ocscs培养一月后，通过干细胞成球率检测、干性相关因子表达检测、克隆形成能力检测以及体内成瘤实验，来判断aldh1 ocscs的细胞干性能力强弱。实验结果表明aldh1 ocscs的体外成球能力及体内皮下移植瘤成瘤能力远远高于aldh1-a2780细胞，aldh1 ocscs可作为肿瘤干细胞模型进行之后的基因转染、药物递送实验。aldh1 ocscs的成功分选及传代培养有利于cscs的分子生物学特性研究，对卵巢癌的增殖、分化、耐药及转移研究有较大帮助。
本发明采用的卵巢癌干细胞分离方法，包括如下步骤：
(1)富集卵巢癌a2780成球细胞；
(2)aldefluortmassay流式分选卵巢癌干细胞，流式细胞仪设置和数据采集。
进一步地，所述步骤(1)采用无血清悬浮细胞培养法富集卵巢癌a2780成球细胞。
进一步地，所述步骤(1)无血清悬浮细胞培养法的详细操作是：复苏人卵巢癌a2780细胞株，使用完全培养基(含10％胎牛血清)中培养传代，待其生长至贴壁面积达80％,使用0.05％胰酶/edta消化5分钟，1000rpm离心5min,收集a2780细胞沉淀，使用无血清培养基重悬，无血清培养基含dmem-f12、glutamaxtm、丙酮酸钠、b27、egf、bfgf、胰岛素，双抗、预防支原体的药物plasmocintm及rock抑制剂y27632，置于低吸附培养瓶进行连续悬浮培养，富集a2780细胞球，每3天添加一次2ml无血清培养基，每7天细胞传代1次，培养过程中使用倒置显微镜观察a2780细胞球富集情况，共培养三周。
进一步地，所述步骤(1)采用顺铂细胞培养法富集卵巢癌a2780成球细胞。
进一步地，所述步骤(1)顺铂细胞培养法的详细操作是在完全培养基(含血清)中培养卵巢癌细胞a2780,待细胞长满培养皿底部后，弃掉原培养基，用pbs洗2次，加入无血清培养基，加入顺铂，第二天继续添加顺铂，第三天继续添加顺铂，培养72小时后使用无血清培养基换液，用pbs洗2次，培养7天左右光镜观察a2780细胞成球形态。
进一步地，所述步骤(1)每次加入的顺铂的终浓度为0.5μg/ml。
进一步地，所述aldefluortmassay流式分选卵巢癌干细胞的详细操作是：
(1)激活aldefluortmassay；
(2)细胞样品制备：收集a2780悬浮培养细胞球到15ml离心管，离心(1000rpm，3min)；pbs冲洗一遍，离心(1000rpm，3min)；加入1mltrypletmexpress胰酶重悬，枪头轻柔吹打，消化为单细胞悬液，离心(1000rpm，3min)；pbs冲洗一遍，离心(1000rpm，3min)，使用aldefluor缓冲液重悬细胞，细胞密度调整为1×106细胞/ml。
(3)aldefluortm测定：每个样品管加入1ml细胞悬液，再加入5ul活化aldefluortm试剂到样品管中，混匀后并立即将0.5ml的混合物转移到阴性对照管，在阴性对照管中加入5μldeab试剂。37℃孵育样品30-60min。孵育后,离心(250g，5min),弃上清；使用2％胎牛血清 2％双抗aldefluortm检测缓冲液1ml重悬，过200目筛网(以免团聚细胞堵塞流式滤嘴)，加入流式管中。整个过程冰上操作；流式分选前轻弹流式管使细胞分散；准备2支流式管，分别装3ml无血清培养基(2％双抗)，回收分选后细胞；
(4)流式细胞仪的设置和数据采集。
本发明的优点包括：把悬浮培养法与流式分选方法结合，药物筛选富集法与流式分选方法结合，通过无血清悬浮培养或化疗药物筛选，使卵巢癌中的肿瘤干细胞富集，再通过流式细胞仪分选，从而保证卵巢癌肿瘤干细胞分选的效率。与现有技术相比，本发明通过比对单纯悬浮无血清培养法、化疗药物富集方法，该方法先筛选，后流式分选的策略，卵巢癌干细胞比例可达54.8％，为下一步研究卵巢癌干细胞的提供条件。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1本发明中所述人卵巢癌a2780细胞无血清悬浮培养三周图片；
图2本发明中实施例一无血清悬浮培养后流式分选获得aldh1 ocscs比例实验图。
图3本发明中实施例一流式分选的aldh1 ocscs培养一月的实验图；
图4本发明中所述ocscs验证分化实验结果图；
图5本发明中所述ocscs验证成瘤实验对比图；
图6本发明中所述ocscs验证成瘤实验的肿瘤生长曲线图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
以下是本发明实验过程中所用到的试剂及溶液的配制方法：
1.1细胞冻存液的配制：于细胞培养室超净台中取10ml离心管，按胎牛血清9ml、dmso1ml的比例加入离心管中混匀。
1.20.4％bsa的配制：称量0.2gbsa，溶解于50ml灭菌ddh2o中，0.22μm滤头过滤待用，分装，-20℃冰箱保存。
1.3egf的配制：将50μgegf溶解于2.5ml0.4％bsa中，存储液浓度为20μg/ml(1000×)，工作浓度为20ng/ml，分装为50μl每管，使用时50ml无血清培养基中加入50μl，剩余-20℃冰箱保存。
1.4bfgf的配制：将10μgbfgf溶于10ml0.4％bsa中,存储液浓度为1μg/ml(100×)，工作浓度为10ng/ml，分装成500μl/管，使用时50ml无血清培养基中加入1管500μl，剩余-20℃冰箱保存。
1.5胰岛素储存液的配制：100mg胰岛素加入10ml无菌纯水配成10mg/ml(1000×)的浓度，分装成50μl/管，-20℃冰箱进行保存。使用终浓度为10μg/ml，使用时50ml无血清培养基加入50μl胰岛素，剩余-20℃冰箱保存。
1.6rock抑制剂的配制：将5mgy27632加入739μl无菌纯水或dmso配成存储液20mmol/l(1000×)，工作浓度为20μmol/l。使用时50ml无血清培养基加入一管50μl，剩余-20℃冰箱保存。
1.7无血清培养基配制(50ml)：加入dmem-f12培养液47ml，glutamaxtm(100×)0.5ml，丙酮酸钠(100×)0.5ml，b27(50×)1ml，egf(20ng/ml,1000×)50μl，bfgf(10ng/ml,100×)0.5ml，10μg/ml胰岛素，双抗(青霉素、链霉素100×)0.5ml，plasmocintmprophylactic(5ng/ml,500×)100μl。
1.8完全培养基(含血清)配制：10％fbs5ml，dmem培养基，1％双抗(100×)。
1.9顺铂溶液的配制：称量2mg顺铂，加入无菌生理盐水40ml，配成储存液(50μg/ml)，0.22μm滤头过滤、分装，4℃避光保存。
实施例一
一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法，包括以下步骤：
(1)卵巢癌a2780成球细胞的富集，采用无血清悬浮细胞培养法：复苏人卵巢癌a2780细胞株，使用完全培养基(含10％胎牛血清)中培养传代，待其生长至贴壁面积达80％,使用0.05％胰酶/edta消化5分钟，1000rpm离心5min,收集a2780细胞沉淀，使用无血清培养基重悬，无血清培养基含dmem-f12、glutamaxtm、丙酮酸钠、b27、egf、bfgf、胰岛素，双抗、预防支原体的药物plasmocintm及rock抑制剂y27632，置于低吸附培养瓶进行连续悬浮培养，富集a2780细胞球，每3天添加一次2ml无血清培养基，每7天细胞传代1次，培养过程中使用倒置显微镜观察a2780细胞球富集情况，共培养三周。达到一定量后即可进行步骤二流式分选操作。
加入rock抑制剂培养，可以使富集成球率高，后续流式分选得率高。
步骤二、aldefluortmassay流式分选卵巢癌干细胞及验证
(1)激活aldefluortmassay；
(2)细胞样品制备：收集a2780悬浮培养细胞球到15ml离心管，离心(1000rpm，3min)。pbs冲洗一遍，离心(1000rpm，3min)。加入1mltrypletmexpress胰酶重悬，枪头轻柔吹打，消化为单细胞悬液，离心(1000rpm，3min)。pbs冲洗一遍，离心(1000rpm，3min)，使用aldefluor缓冲液重悬细胞，细胞密度调整为1×106细胞/ml。
(3)aldefluortm测定：每个样品管加入1ml细胞悬液，再加入5ul活化aldefluortm试剂到样品管中，混匀后并立即将0.5ml的混合物转移到阴性对照管，在阴性对照管中加入5μldeab试剂。37℃孵育样品30-60min。孵育后,离心(250g，5min),弃上清。使用2％胎牛血清 2％双抗aldefluortm检测缓冲液1ml重悬，过200目筛网(以免团聚细胞堵塞流式滤嘴)，加入流式管中。整个过程冰上操作。流式分选前轻弹流式管使细胞分散。准备2支流式管，分别装3ml无血清培养基(2％双抗)，回收分选后细胞。
(4)流式细胞仪的设置和数据采集。如图2所示，aldh1作为ocscs的标志物，使用aldefluortmassay流式分选ocscs，获得aldh1 ocscs比例可达54.8％。
对分选获得的aldh1 ocscs进行下列实验：
培养获得的aldh1 ocscs，结果如图3所示，一月后aldh1 ocscs可形成细胞球。
ocscs验证分化实验：使用含10％胎牛血清培养基对aldh1 ocscs细胞球分化培养，如图4所示，第二天可见细胞球贴壁分化生长。
ocscs验证成瘤实验：分别把细胞a2780及ocscs对不同实验组的裸鼠进行皮下移植，观察成瘤效果，外观如图5所示，肿瘤生长曲线如图6所示，明显可见ocscs形成的皮下移植瘤明显大于a2780形成的皮下移植瘤，ocscs成瘤能力比细胞a2780强。
实施例二
卵巢癌a2780成球细胞的富集，顺铂细胞培养法：
在完全培养基(含血清)中培养卵巢癌细胞a2780,待细胞长满培养皿底部后，弃掉原培养基，用pbs洗2次，加入无血清培养基，并连续3天加入终浓度为0.5μg/ml顺铂，培养72小时后使用无血清培养基换液，用pbs洗2次，培养过程中使用倒置显微镜观察a2780细胞成球形态，达到一定量后即可进行步骤二流式分选操作。
步骤二、aldefluortmassay流式分选卵巢癌干细胞及验证的过程参考实施例一。
本实施例的实验验证结果与实施例一相当。
综上，本发明的方法包括将人卵巢癌a2780细胞消化成单细胞悬液；使用无血清培养基置于低吸附培养瓶中培养，或者加入化疗药物顺铂杀灭卵巢癌细胞，初步筛选出肿瘤干细胞，再根据卵巢癌干细胞的标志物aldh1,使用流式细胞仪进一步分选。本发明结合了现有悬浮培养法及流式分选方法、药物筛选富集法及流式分选方法的优点，通过无血清悬浮培养或者化疗药物筛选，使卵巢癌中的肿瘤干细胞富集，再通过流式细胞仪分选，从而保证卵巢癌肿瘤干细胞分选的效率。与现有技术相比，本发明通过比对单纯悬浮无血清培养法或化疗药物富集方法，本发明采用先筛选后流式分选的策略，使卵巢癌干细胞获得数量多，得率高，比例可达54.8％，为下一步研究卵巢癌干细胞的提供条件。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
1.一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法，其特征在于：
包括如下步骤：
(1)富集卵巢癌a2780成球细胞；
(2)aldefluortmassay流式分选卵巢癌干细胞，流式细胞仪设置和数据采集。
2.根据权利要求1所述的一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法，其特征在于：
所述步骤(1)采用无血清悬浮细胞培养法富集卵巢癌a2780成球细胞。
3.根据权利要求2所述的一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法，其特征在于：
所述步骤(1)无血清悬浮细胞培养法的详细操作是：复苏人卵巢癌a2780细胞株，使用完全培养基(含10％胎牛血清)中培养传代，待其生长至贴壁面积达80％,使用0.05％胰酶/edta消化5分钟，1000rpm离心5min,收集a2780细胞沉淀，使用无血清培养基重悬，无血清培养基含dmem-f12、glutamaxtm、丙酮酸钠、b27、egf、bfgf、胰岛素，双抗、预防支原体的药物plasmocintm及rock抑制剂y27632，置于低吸附培养瓶进行连续悬浮培养，富集a2780细胞球，每3天添加一次2ml无血清培养基，每7天细胞传代1次，培养过程中使用倒置显微镜观察a2780细胞球富集情况，共培养三周。
4.根据权利要求1所述的一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法，其特征在于：
所述步骤(1)采用顺铂细胞培养法富集卵巢癌a2780成球细胞。
5.根据权利要求4所述的一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法，其特征在于：
所述步骤(1)顺铂细胞培养法的详细操作是在完全培养基(含血清)中培养卵巢癌细胞a2780,待细胞长满培养皿底部后，弃掉原培养基，用pbs洗2次，加入无血清培养基，加入顺铂，第二天继续添加顺铂，第三天继续添加顺铂，培养72小时后使用无血清培养基换液，用pbs洗2次，培养7天左右光镜观察a2780细胞成球形态。
6.根据权利要求4所述的一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法，其特征在于：
所述步骤(1)每次加入的顺铂的终浓度为0.5μg/ml。
7.根据权利要求1所述的一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法，其特征在于：
所述aldefluortmassay流式分选卵巢癌干细胞的详细操作是：
①激活aldefluortmassay；
②细胞样品制备：收集a2780悬浮培养细胞球到15ml离心管，离心(1000rpm，3min)；pbs冲洗一遍，离心(1000rpm，3min)；加入1mltrypletmexpress胰酶重悬，枪头轻柔吹打，消化为单细胞悬液，离心(1000rpm，3min)；pbs冲洗一遍，离心(1000rpm，3min)，使用aldefluor缓冲液重悬细胞，细胞密度调整为1×106细胞/ml。
③aldefluortm测定：每个样品管加入1ml细胞悬液，再加入5ul活化aldefluortm试剂到样品管中，混匀后并立即将0.5ml的混合物转移到阴性对照管，在阴性对照管中加入5μldeab试剂。37℃孵育样品30-60min。孵育后,离心(250g，5min),弃上清；使用2％胎牛血清 2％双抗aldefluortm检测缓冲液1ml重悬，过200目筛网(以免团聚细胞堵塞流式滤嘴)，加入流式管中。整个过程冰上操作；流式分选前轻弹流式管使细胞分散；准备2支流式管，分别装3ml无血清培养基(2％双抗)，回收分选后细胞；
④流式细胞仪的设置和数据采集。
技术总结