本发明属于生物技术领域，具体涉及一种突变型egfr表达质粒的构建以及突变型egfr高表达的肝癌细胞的构建。
技术背景
肝癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一,具有恶性程度高、浸润和转移性强、先天性耐药等特点,位居癌症发病之第6位，死亡率之第3位。目前全球估计的每年新病例发生数约74.83万人，我国是全球肝癌发病率最高和病死数最多的国家，肝癌患者占全球的55％。最近有研究表明，在原发性肝癌患者的肝癌组织和癌旁肝组织常有egfr的高表达，而egfr及其下游信号转导通路关键蛋白，如mapk/erk、akt的激活与肝癌的生物学行为及预后关系更为密切。
egfr，人表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor)是由原癌基因her1编码的上皮生长因子(egf)的受体。egfr由1186个氨基酸组成，相对分子量为170kd。egfr广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，在许多上皮来源的恶性肿瘤中，如乳腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、头颈鳞癌等细胞表面都有异常过表达。egfr一种具有酪氨酸蛋白激酶(tpk)活性的细胞膜表面糖蛋白受体，能结合具有激动功能的多种配体，egfr与其相应配体egf、tgf-α等结合后，可诱导受体自身二聚体化，同时其胞内tpk结构域发生磷酸化而活化，继而介导mapk、pi3k等多种信号通路的激活，促进转录因子、蛋白激酶等的活化。egfr信号通路对恶性肿瘤的生长、增殖、侵袭、转移和分化等生理过程发挥重要的作用。且已经证明egfr与肿瘤的分化程度、恶性程度及浸润程度、放化疗敏感性、肿瘤耐药性及预后等密切相关。因此，egfr家族被认为是抗肿瘤治疗的理想分子靶点之一。目前，针对egfr的肿瘤分子靶向药物，主要有西妥昔单抗、帕尼单抗、吉非替尼、厄洛替尼等。
在恶性肿瘤中，egfr是突变率较高的基因之一。突变型egfr受体或配体表达的增加导致egfr的持续活化，同时启动不同的信号转导途径。egfr突变不仅造成了肿瘤对靶向药物的耐药性，也是的egfr的靶向特异性药物的脱靶，严重影响治疗的效果。因此，寻找新的靶向药物，能够抑制恶性肿瘤egfr高表达或者抑制egfr突变引起的信号通路的激活，对肿瘤的治疗有主要的意义。
技术实现要素：
本发明解决的问题是构建一种基于外源重组质粒pcdh-puro-egfr(i645l)构建的稳定高表达突变型egfr的重组mhcc97-l肝癌细胞。在经过egfr-i645l基因全长的获得，pcdh-puro-egfr(i645l)质粒构建的基础上，通过包装病毒，然后对病毒感染后的细胞进行嘌呤霉素筛选，传代，建立egfr(i645l)稳定表达mhcc97-l细胞株。
本发明通过下述技术方案实现：
(一).pcdh-puro-egfr(i645l)真核表达载体构建，通过多克隆位点将egfr-i645l全长基因构建于真核质粒pcdh-ef1-mcs-puro(如图1)，使用的克隆酶切位点为xbai和noti。这种突变型egfr真核表达载体，其能高效表达功能突变型egfr，此egfr蛋白第645位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸，其序列见附件一。
(二).一种突变型egfr高表达的转化体，该转化体为mhcc97-l-egfr(i645l)重组细胞，宿主细胞为肝癌mhcc97-l细胞系细胞系。转染宿主细胞的外源性表达载体是包含egfr(i645l)全长基因的pcdh-puro-egfr(i645l)质粒。
本发明基于外源重组质粒pcdh-puro-egfr(i645l)构建的稳定高表达突变型egfr的重组mhcc97-l肝癌细胞。具体经过egfr-i645l基因全长的获得，pcdh-puro-egfr(i645l)质粒构建、包装病毒，然后对病毒感染后的细胞进行嘌呤霉素筛选，传代，建立稳定表达mhcc97-l细胞。较转染前，重组mhcc97-l肝癌细胞能够5-7倍表达egfr蛋白，并且其第645位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸，此突变能显著性激活egfr的磷酸化，持续激活egfr通路。此细胞的建立可以为以肝癌肿瘤的egfr通路相关药物筛选及耐药研究提供细胞模型，提高筛选的特异性及灵敏性；也可应用于egfr影响的相关通路蛋白的差异性比较研究。
附图说明
图1.pcdh-ef1-mcs-puro质粒图谱；
图2.酶切后纯化的pcdh-ef1-mcs-puro质粒和egfr基因片段电泳检测图；
图3.pcdh-puro-egfr(i645l)质粒酶切鉴定图谱；
图4.egfr(i645l)稳定表达mhcc97-l细胞株蛋白westernblot检测
附件一.egfr基因序列
egfr核酸序列
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具体实施方式
(a)egfr(i645l)全长基因的扩增
·提取mhcc97-h细胞的总rna，经反转录后获得cdna，以此为模板，经pcr反应获得egfr(i645l)基因全长，所述的引物为：
·上游引物：gctcagaatgcgaccctccgggacg
下游引物：atttgcggccgctcatgctccaataaattcactgc
·将获得的egfr(i645l)基因全长进行xbai和noti双酶切后回收(如图2)。
·pcdh-ef1-mcs-puro质粒进行xbai和noti双酶切后回收(如图2)。
·将酶切后质粒和pcr产物连接后转化dh5α感受态。挑取单克隆后测序。获得pcdh-puro-egfr(i645l)真核表达载体(如图3)。
(b)病毒的构建及富集
·pcdh-puro-egfr(i645l)质粒的病毒需要在293t细胞中获得，每种病毒由三种质粒构成，分别是包装质粒pspax2，包膜质粒pvsv.g和慢病毒载体pcdh-puro-egfr(i645l)。
·第一天：将2×106个hek-293t细胞种在10cm皿中，使用7ml添加胎牛血清的dmem培养基培养，此培养基中不含抗生素。置于37℃,5％co2(co2体积含量5％的空气)培养箱中培养。
·第二天：在hek-293t细胞长至覆盖率达到80％汇合时，使用lipofectamine2000做细胞转染。
·7.2ugpspax2包装质粒；0.8ugpvsv.g包膜质粒；8ug慢病毒载体pcdh-puro-egfr(i645l)与30ullipofectamine2000混合加入到293t细胞中。
·置于37℃,5％co2培养箱中强制转染6-8小时。之后添加9ml含有体积浓度10％胎牛血清的dmem培养基。
·培养72小时后收取培养基，1000rpm离心5min，取上清，得病毒培养液。
(c)mhcc97-l细胞感染
·在六孔板中种2*105/孔的mhcc97-l细胞使用2ml添加含有体积浓度10％胎牛血清的dmem培养基培养，此培养基中不含抗生素置于37℃,5％co2培养箱中培养。
·第二天将培养基全部抽走，将3ml新鲜的病毒培养液添加到mhcc97-l培养皿种，强制转染24小时。
·第三天将培养液吸走2ml,并添加2ml的dmem 10％fbs(体积)培养2-3天。
·镜检有一部分荧光细胞后，将细胞传代到10cm皿中，传代第二天开始嘌呤霉素的筛选，浓度为到2ug/ml.一直持续筛选，出现克隆后，挑取单克隆进行培养。提取细胞蛋白，通过western蛋白检测筛选后扩大培养，得到目标细胞株(如图4)。
序列表
<110>中国科学院大连化学物理研究所
<120>一种突变型egfr高表达的重组mhcc97-l肝癌细胞及构建
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>3633
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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1.一种突变型egfr高表达的重组mhcc97-l肝癌细胞，其特征在于：该肝癌mhcc97-l细胞系内感染有表达载体mhcc97-l-egfr(i645l)。
2.如权利要求1所述突变型egfr高表达的重组mhcc97-l肝癌细胞，其特征在于：其能高效表达功能突变型egfr，此egfr蛋白第645位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸，其cds序列具有如序列表1所示序列。
3.一种突变型egfr高表达的重组mhcc97-l肝癌细胞的构建方法，
1)egfr-i645l真核表达载体的构建，该载体为pcdh-puro-egfr(i645l)表达载体，通过多克隆位点将egfr-i645l全长基因构建于真核质粒pcdh-ef1-mcs-puro，使用的克隆酶切位点为xbai和noti；其能高效表达功能突变型egfr，此egfr蛋白第645位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸，其cds序列具有如序列表1所示序列；
2)包装病毒，然后对病毒感染后的细胞进行嘌呤霉素筛选，传代，建立稳定表达mhcc97-l细胞。
技术总结