本发明涉及t细胞技术领域，特别是涉及具有提高免疫应答功效的t细胞及其制备方法和应用。
背景技术：
目前用于提高机体免疫力的t细胞治疗技术包括扩增的t细胞治疗技术、car-t细胞治疗技术和tcr-t细胞治疗技术。第一种技术是简单大量扩增患者的特定细胞用于治疗，t细胞功能没有实质的改变。car-t和tcr-t细胞治疗技术是通过表达人工改造或者筛选的t细胞受体，增强对肿瘤或者病毒的识别能力，从而达到清除病毒和肿瘤的目的。这三种现存的t细胞治疗技术都不能增强未改造的体内其它免疫细胞的功能，因此对慢性病毒感染和实体瘤的治疗无效。
肿瘤可以说是当今社会影响人类健康的第一大杀手，每年几乎都会有数百万人死于癌症。目前对于肿瘤的治疗手段除了早期的手术切除，还有化疗、放疗。免疫疗法在近几年取得了突飞猛进的发展，包括免疫检查点抑制剂和细胞过继性疗法。前者主要包括pd-l1和ctla-4抗体，后者主要指tcr-t和car-t技术。其中前者可以通过抑制免疫细胞的抑制性信号通路最大限度地诱导机体免疫应答，从而清除肿瘤。但是肿瘤抗原通常都是低亲和力的，即便抑制了免疫抑制信号，也很难激起很强的免疫反应，所以只是在个别肿瘤治疗中起到了一定的作用。后者中tcr-t主要是通过筛选得到具有肿瘤抗原识别能力的t细胞，然后获得t细胞的tcr序列，接着通过基因改造技术使患者来源的t细胞也表达这种能识别肿瘤抗原的tcr，最后通过体外培养获得大量细胞回输治疗患者。但是同样机体中天然存在的这种tcr对肿瘤抗原的亲和力是很低的，很难激起有效的免疫反应。car-t则是通过基因改造技术，将对肿瘤抗原具有高亲和力的嵌合抗原受体表达在患者的t细胞上，最后通过体外培养获得大量细胞回输治疗患者。优点是受体对抗原亲和力高，而且摆脱了mhc分子的限制性，能够直接识别肿瘤抗原，极大地提高了对肿瘤细胞的杀伤能力。缺点是可能会在患者体内引起细胞因子风暴，并且具有神经毒性。细胞因子风暴，往往表现为高热、低血压、休克等，发生率超过60％-70％，其中较为严重的细胞因子风暴的发生率，大约在20％-30％。一般需要糖皮质激素、il-6抗体等药物进行控制。神经系统毒性，多表现为脑水肿、颅内压升高、癫痫、意识状态改变等，其发生机制目前尚不清楚，国外时不时出现患者因为car-t导致的神经毒性而去世的报道。而且car-t收费接近天价，很难在患者中普及。最重要的一点是很难找到一种只在肿瘤细胞上特异性表达的受体分子，而且针对实体瘤的治疗效果也一般，目前只有car-19和car-20在白血病患者中取得了不错的疗效。
慢性病毒感染主要包括hiv和hbv。抗hiv感染免疫：hiv主要感染人体cd4 t细胞，导致严重免疫缺陷。据联合国“2005年全球艾滋病传播报告”称：自1981年确认hiv病毒感染以来，迄今累计感染人口6500万，已造成2800万人死亡，现有aids患者3800万；2005年死亡患者280万，新感染人口约400万；中国目前实际感染人数超过100万，进入快速增长期。因为aids的cd4 t细胞被破坏导致免疫缺陷，所以患者经常伴随着广谱性机会病毒、寄生虫和细胞感染。由于hiv感染破坏cd4 t细胞，患者抗hiv感染免疫始终处于异常的免疫抑制状态。在感染早期，hiv感染cd4 t细胞并进行大量的复制，此时b细胞可诱导较强的免疫反应。但因为体液免疫也需要cd4 th细胞的辅助，因此随后b细胞的免疫应答被抑制。后期hiv降低复制，免疫应答持续受到抑制。目前还没有十分有效的治疗和预防aids的方法，因为抗感染免疫的关键调控细胞被感染和破坏，使抗感染适应性免疫应答无法有效诱导。抗hbv感染免疫：人类乙型肝炎病毒(hbv)感染是世界范围内的公共卫生问题。由于mhc多态性和易感性格局，以及其他关键基因的突变或多态性的存在，中国有大约1.2亿个没有症状的携带者，当免疫力降低时容易转化为hbv慢性患者。hbv慢性感染可持续十年，患者的肝组织反复受到损伤，进行性发展为肝硬化和肝癌。慢性乙肝的长期发展过程是hbv逃逸抗感染免疫以及宿主免疫系统对hbv免疫耐受的综合结果。典型的hbv慢性感染随感染时间可划分为四个阶段：免疫耐受阶段、免疫应答阶段、hbeag转阴后非活动性携带阶段和再次急性发作阶段。发生慢性感染的根本原因是hbv能有效逃逸抗感染免疫，患者免疫系统始终未能清除hbv感染，目前对于hbv没有十分有效的治疗手段。
胞内细菌感染如结核杆菌、李斯特菌等。巨噬细胞可以吞噬胞内菌，但是因为胞内菌大多数能够逃脱吞噬杀伤，因此巨噬细胞无法裂解细菌，反而导致细菌的隐蔽和扩散。因为特异性抗体无法中和细胞内的菌，所内抗胞内菌感染主要依赖细胞免疫。其中cd4 th细胞分泌的inf-γ可以活化巨噬细胞的杀菌功能，cd8ctl能够有效杀伤靶细胞，使胞内菌释放，在经过抗体调理后被巨噬细胞吞噬。结核杆菌能够通过多种途径抑制免疫反应：抑制吞噬细胞早期的吞噬体形成过程，此外抑制抗原从吞噬小体释放，从而不能有效诱导mhc-i提呈抗原和激活cd8ctl免疫应答。
就目前的情况，针对肿瘤的免疫检查点抑制剂治疗仅对个别肿瘤有治疗效果，因为机体的t细胞对肿瘤抗原的亲和力很低，即使抑制了对t细胞的抑制反应，机体对肿瘤抗原也很难有很强的免疫反应。重要的是很难找到这种只在肿瘤细胞上特异性表达的受体分子，并且实体瘤治疗效果很差。病毒感染、细菌感染则只能通过药物抑制病毒的复制来延长病人的生存周期，没有好的根治手段。根本原因就是机体天然存在的cd8 t细胞对抗原的亲和力太低，不能有效识别肿瘤细胞和病毒感染的靶细胞从而有效清除肿瘤和病毒。
综上所述，肿瘤、慢性病毒感染(如hiv、hbv)、细菌感染(如结核杆菌、超级细菌)目前都没有有效的治疗手段，并且治疗费用昂贵。
因此，亟待提供一种能够增强有机体(例如患者)t细胞免疫应答的t细胞。
技术实现要素：
基于此，本发明的主要目的是提供一种具有提高免疫应答功效的t细胞，特别是一种具有提高免疫应答功效的cd8 t细胞。该t细胞能够在识别并杀伤靶细胞的同时激发其他抗原特异性t细胞的免疫应答。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种具有提高免疫应答功效的t细胞，通过将外源基因cd40l、4-1bbl整合到抗原特异性t细胞染色体上过表达制备获得。该处所述的抗原包括病毒、细菌、真菌、肿瘤等，也可以是多肽、蛋白质，或者是通过基因表达在细胞和上列微生物中的能引起t细胞免疫应答的物质。
本发明的另一目的是提供一种具有提高免疫应答功效的t细胞的制备方法。
该技术目的是通过以下技术方案实现的：
一种具有提高免疫应答功效的t细胞的制备方法，包括如下步骤：
获取抗原特异性t细胞，并用特异性抗原激活所述的抗原特异性t细胞；
构建携带有外源基因cd40l、4-1bbl的病毒颗粒，用所述病毒颗粒转染所述激活的抗原特异性t细胞，从而将外源基因cd40l、4-1bbl整合到所述的激活的抗原特性t细胞的染色体上。
在其中一些实施例中，所述的病毒颗粒的构建选用逆转录病毒。
在其中一些实施例中，所述的逆转录病毒为migr1。
在其中一些实施例中，所述的病毒颗粒的构建选慢病毒。
在其中一些实施例中，所述的抗原特异性t细胞为cd8 t细胞。
在其中一些实施例中，所述的特异性抗原为抗原特异性t细胞能够识别的多肽。所述的特异性抗原是指肿瘤、病毒和细菌等来源的可被t细胞识别的多肽，以及通过基因表达的肿瘤、病毒和细菌等来源的多肽。例如，n4。
本发明的再一目的是提供一种上述的具有提高免疫应答功效的t细胞在促进与所述t细胞相邻的免疫细胞的免疫应答功能、细胞增殖中的应用。所述的免疫细胞例如t细胞、dc细胞、巨噬细胞、nk细胞、b细胞等等。所述的免疫应答功能包括促进细胞因子分泌、抗原呈递、杀伤功能等等。
在其中一些实施例中，所述的应用是将所述的所述免疫细胞与所述的提高免疫应答功效的t细胞共培养。
在其中一些实施例中，本发明的又一目的是提供一种上述的具有提高免疫应答功效的t细胞在治疗肿瘤、慢性病毒感染、细菌感染、真菌感染中的应用。
与现有技术相比，本发明具备如下的有益效果：
本发明将外源基因cd40l、4-1bbl整合到抗原特异性t细胞染色体上过表达制备获得具有提高免疫应答功效的t细胞。该具有提高免疫应答功效的t细胞不仅自身增殖快、ifn-γ的表达量高，关键是，还能够显著促进其周围的未携带外源基因的抗原特异性t细胞(例如：与之共培养的未携带外源基因的抗原特异性t细胞，将其回输入肿瘤组织后该肿瘤组织中的抗原特异性t细胞)增殖、ifn-γ表达水平，在激活周围抗原特异性t细胞免疫应答能力、细胞增殖方面发挥着“将军”引领作用，在治疗肿瘤、慢性病毒感染、细菌感染中作用至关重要。
附图说明
图1为实施例1扩增结果电泳图；
图2至图7为实施例1构建的携带外源基因的逆转录病毒质粒的图谱；
图8为实施例2的操作路程示意图；
图9、图10为实施例2通过流式细胞仪和rt-pcr检测ot-icd8 t细胞cd40l和4-1bbl的表达结果图；
图11为实施例3的操作流程示意图以及结果图；
图12为实施例4的操作流程示意图以及结果图；
图13为实施例5的操作流程示意图以及结果图；
图14为实施例6的操作流程示意图；
图15、图16为实施例6的流式检测结果图；
图17为实施例7的操作流程示意图以及结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的进一步详细的说明。为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1、制备携带外源基因的逆转录病毒表达质粒
1、构建克隆：(1)提取小鼠的脾细胞和dc细胞(树突状细胞)的总rna，反转录后作为cdna库。(2)以cdna库为模板，pcr扩增cd40l和4-1bbl序列，以migr1为载体pcr扩增iers序列，以公司合成的2a序列为模板pcr扩增2a序列。该步骤中：
pcr扩增采用的引物包括：
pcr扩增的体系为：
pcr扩增采用的程序为：
pcr扩增所得的cd40l序列(seqidno.19)、4-1bbl序列(seqidno.20)(参见图1)分别如下所示：
seqidno.19：
atgatagaaacatacagccaaccttcccccagatccgtggcaactggacttccagcgagcatgaagatttttatgtatttacttactgttttccttatcacccaaatgattggatctgtgctttttgctgtgtatcttcatagaagattggataaggtcgaagaggaagtaaaccttcatgaagattttgtattcataaaaaagctaaagagatgcaacaaaggagaaggatctttatccttgctgaactgtgaggagatgagaaggcaatttgaagaccttgtcaaggatataacgttaaacaaagaagagaaaaaagaaaacagctttgaaatgcaaagaggtgatgaggatcctcaaattgcagcacacgttgtaagcgaagccaacagtaatgcagcatccgttctacagtgggccaagaaaggatattataccatgaaaagcaacttggtaatgcttgaaaatgggaaacagctgacggttaaaagagaaggactctattatgtctacactcaagtcaccttctgctctaatcgggagccttcgagtcaacgcccattcatcgtcggcctctggctgaagcccagcagtggatctgagagaatcttactcaaggcggcaaatacccacagttcctcccagctttgcgagcagcagtctgttcacttgggcggagtgtttgaattacaagctggtgcttctgtgtttgtcaacgtgactgaagcaagccaagtgatccacagagttggcttctcatcttttggcttactcaaactctga
seqidno.20：
atggaccagcacacacttgatgtggaggataccgcggatgccagacatccagcaggtacttcgtgcccctcggatgcggcgctcctcagagataccgggctcctcgcggacgctgcgctcctctcagatactgtgcgccccacaaatgccgcgctccccacggatgctgcctaccctgcggttaatgttcgggatcgcgaggccgcgtggccgcctgcactgaacttctgttcccgccacccaaagctctatggcctagtcgctttggttttgctgcttctgatcgccgcctgtgttcctatcttcacccgcaccgagcctcggccagcgctcacaatcaccacctcgcccaacctgggtacccgagagaataatgcagaccaggtcacccctgtttcccacattggctgccccaacactacacaacagggctctcctgtgttcgccaagctactggctaaaaaccaagcatcgttgtgcaatacaactctgaactggcacagccaagatggagctgggagctcatacctatctcaaggtctgaggtacgaagaagacaaaaaggagttggtggtagacagtcccgggctctactacgtatttttggaactgaagctcagtccaacattcacaaacacaggccacaaggtgcagggctgggtctctcttgttttgcaagcaaagcctcaggtagatgactttgacaacttggccctgacagtggaactgttcccttgctccatggagaacaagttagtggaccgttcctggagtcaactgttgctcctgaaggctggccaccgcctcagtgtgggtctgagggcttatctgcatggagcccaggatgcatacagagactgggagctgtcttatcccaacaccaccagctttggactctttcttgtgaaacccgacaacccatgggaatga。
克隆构建所需载体及pcr产物的酶切体系：
migr1-cd40l反应体系：
均37℃过夜酶切，保证充分切开。
migr1-4-1bbl反应体系：
均37℃过夜酶切，保证充分切开。
migr1-cd40l-ires-4-1bbl反应体系：
37℃过夜酶切，保证充分切开。
migr1-cd40l-p2a-4-1bbl反应体系：
37℃过夜酶切，保证充分切开，随后加入0.2ulcip继续切割1h，防止载体自连。
migr1-4-1bbl-ires-cd40l反应体系：
均37℃过夜酶切，保证充分切开。
migr1-4-1bbl-ta2-cd40l反应体系：
以上克隆的构建分别采用了酶切连接和基因重组手段：首先我们以cdna为模板pcr扩增出cd40l和4-1bbl片段，然后利用xhoi和ecori酶切位点在t4连接酶的作用下分别将cd40l(seqidno.1和seqidno.2扩增)和4-1bbl片段(seqidno.3和seqidno.4扩增)构建到了migr1载体上，从而获得了质粒migr1-cd40l和migr1-4-1bbl。其次利用限制性内切酶ncoi、sali-hf对质粒migr1-cd40l双酶切获得线性化载体，然后在重组酶的作用下，将4-1bbl片段(seqidno.5和seqidno.6扩增)构建到migr1-cd40l上，从而获得逆转录病毒表达质粒migr1-cd40l-ires-4-1bbl。利用限制性内切酶ecori单酶切质粒migr1-cd40l获得线性化载体，在重组酶的作用下，将p2a片段(seqidno.7和seqidno.8扩增)、4-1bbl片段(seqidno.9和seqidno.10扩增)构建到migr1-cd40l上，从而获得逆转录病毒表达质粒migr1-cd40l-p2a-4-1bbl。利用限制性内切酶ecori、sali-hf双酶切质粒migr1-4-1bbl获得线性化载体，在重组酶的作用下，将ires片段(seqidno.11和seqidno.12扩增)、cd40l片段(seqidno.13和seqidno.14扩增)构建到migr1-4-1bbl上，从而获得逆转录病毒表达质粒migr1-4-1bbl-ires-cd40l。利用限制性内切酶ecori单酶切质粒migr1-4-1bbl获得线性化载体，在重组酶的作用下，将t2a片段(seqidno.15和seqidno.16扩增)、cd40l片段(seqidno.17和seqidno.18扩增)构建到migr1-4-1bbl上，从而获得逆转录病毒表达质粒migr1-4-1bbl-t2a-cd40l。
参照以上操作，所得携带外源基因的逆转录病毒质粒包括单独携带外源基因cd40l的逆转录病毒表达质粒(migr1-cd40l，参见图2)、单独携带外源基因4-1bbl的逆转录病毒表达质粒(migr1-4-1bbl，参见图3)、同时携带外源基因4-1bbl和cd40l的转录病毒表达质粒(migr1-4-1bbl-t2a-cd40l、参见图7，migr1-4-1bbl-ires-cd40l、参见图6，migr1-cd40l-p2a-4-1bbl、参见图5，migr1-cd40l-ires-4-1bbl、参见图4)。
2、包装病毒：
利用lipo2000转染试剂将携带外源基因的逆转录病毒载体分别和helper质粒(辅助质粒)转染进提前培养好的293t细胞，分别在48h、72h、96h收集细胞上清，分装后放在-80℃保存。
实施例2、在ot-icd8 t细胞表面表达cd40l和4-1bbl
a.293t传代并铺板，包装逆转录病毒，同实施例1。
b.取6周～8周龄的ot-i小鼠，分离脾脏细胞并加入n4激活。
c.24h后用不同的携带外源基因的逆转录病毒转导激活的ot-icd8 t细胞：
处理①：用单独携带外源基因cd40l的逆转录病毒转导激活的ot-icd8 t细胞；
处理②：用单独携带外源基因4-1bbl的逆转录病毒转导激活的ot-icd8 t细胞；
处理③用携带外源基因4-1bbl-2a-cd40l的逆转录病毒转导激活的ot-icd8 t细胞；
处理④：用携带外源基因4-1bbl-ires-cd40l的逆转录病毒转导激活的ot-icd8 t细胞；
处理⑤：用携带外源基因cd40l-2a-4-1bbl的逆转录病毒转导激活的ot-icd8 t细胞；
处理⑥：用携带外源基因cd40l-ires-4-1bbl的逆转录病毒转导激活的ot-icd8 t细胞。
d.再过24h后将细胞分为两部分，一部分用于流式检测，一部分用于检测rt-pcr。操作请参见图8。
通过以上操作获得：能够表达外源基因cd40l的cd8 t细胞、能够表达外源基因4-1bbl的cd8 t细胞、同时表达4-1bbl和cd40l的cd8 t细胞。
将不同的质粒包装成逆转录病毒后，转导n4激活的ot-icd8 t细胞，并通过流式细胞仪和rt-pcr检测ot-icd8 t细胞cd40l和4-1bbl的表达。结果参见图9、图10。
从数据可以得知4-1bbl和cd40l在转导细胞后都能有效表达。
(1)在双蛋白表达载体中当，4-1bbl在前cd40l在后时即migr1-4-1bbl-t2a-cd40l和migr1-4-1bbl-ires-cd40l转导的两组细胞cd40l蛋白表达水平明显高于migr1-cd40l-p2a-4-1bbl和migr1-cd40l-ires-4-1bbl这两组转导的细胞，甚至比migr1-cd40l这组转导的细胞还高，其中migr1-4-1bbl-t2a-cd40l转导的ot-icd8 t细胞cd40l的表达水平最高，空载体migr1和migr1-4-1bbl转导的细胞几乎没有表达。
(2)单独转导migr1-4-1bbl的细胞表达4-1bbl最高，其次是migr1-4-1bbl-t2a-cd40l和migr1-4-1bbl-ires-cd40l转导的细胞，但是4-1bbl的表达后两组转导的细胞明显低于migr1-4-1bbl转导的细胞。migr1-4-1bbl-t2a-cd40l和migr1-4-1bbl-ires-cd40l这两组转导的细胞无论是cd40l还是4-1bbl的表达都比migr1-cd40l-p2a-4-1bbl和migr1-cd40l-ires-4-1bbl这两组转导的细胞强，而且同时表达两种蛋白的cd8 t细胞比例最高。
(3)与此同时，还提取了各组细胞的rna，通过rt-pcr技术检测不同病毒转导的细胞中4-1bbl和cd40l的mrna的表达水平。首先是各组细胞cd40l的转录水平，migr1和migr1-4-1bbl几乎没有表达和空白对照相比，与蛋白表达水平一致。单独转导migr1-cd40l的细胞中的基因转录水平也基本和蛋白表达一致，migr1-4-1bbl-t2a-cd40l转导的细胞cd40l的转录水平也明显高于其他组，符合蛋白表达的情况。而migr1-cd40l-p2a-4-1bbl转导的细胞转录水平比migr1-cd40l转导的细胞高，应该是病毒转导效率高导致的。而蛋白表达低可能由于细胞内水解酶的剪切效率低，不能有效将融合蛋白cd40l和4-1bbl切开，所以流式检测cd40l的表达不高。接下来看4-1bbl的转录水平，migr1和migr1-cd40l转导的细胞4-1bbl的转录水平和空白对照相当。单独转导migr1-4-1bbl的细胞以及migr1-cd40l-ires-4-1bbl转导的细胞4-1bbl的转录水平与蛋白表达水平相符。而migr1-cd40l-p2a-4-1bbl和migr-4-1bbl-t2a-cd40l转导的细胞虽然转录水平很高，可能由于水解酶不能有效切割融合蛋白，导致检测到的4-1bbl的蛋白表达低。
实施例3、在ot-icd8 t细胞表面表达cd40l和4-1bbl后检测细胞增殖
a.取6-8周龄的ot-i小鼠，分离脾脏细胞后加入n4刺激培养。
b.24h后将激活的ot-icd8 t细胞均匀分开，用实施例1所得不同的病毒分别转导激活的cd8 t细胞。
c.再过24h后分别将cd8 t细胞收集起来，在显微镜下计数。操作流程参见图11a。
检测结果参见图11b。过表达cd40l时与对照相比能促进细胞的增殖，但是没有统计学差异。过表达4-1bbl则能有效促进细胞的增殖，而且同时过表达4-1bbl和cd40l时辅助作用更强，说明4-1bbl和cd40l在促进细胞增殖时存在一个相互叠加的效果。
实施例4、在ot-icd8 t细胞表面表达cd40l和4-1bbl后检测对未成熟dc(cd80lowcd40lowmhc-iilow)的辅助激活作用
a.第-3天取6周～8周龄c57bl/6雌鼠股骨和胫骨，分离骨髓细胞后并加入gm-csf和il4培养dcs。
b.第0天取6周～8周龄ot-i小鼠，分离脾脏细胞后加入n4刺激培养。
c.24h后用用实施例1所得不同的病毒转导激活的ot-icd8 t细胞。
d.再过24h左右，分别将ot-i脾细胞和培养了5天的dcs收集计数。
e.将ot-i脾细胞和dcs按1:2混合，并加入10ng/mlil15，充分混匀后铺于圆底96孔板培养。
f.共培养18h后，流式检测dcs表面膜蛋白的表达。操作及结果参见图12。
首先是dcs(树突状细胞)表面cd40的表达，结果令人困惑tgm过表达cd40l非但没有促进dcs表面cd40的上调，反而造成了cd40表达的下调，而且与tgm表面cd40l的表达呈现负相关。
反观4-1bbl的表达促进了dcs表面cd40l的上调。但是migr1-4-1bbl-t2a-cd40l和migr1-4-1bbl-ires-cd40l这两组转导的细胞虽然也表达4-1bbl，但是与migr1-4-1bbl转导的细胞相比要低得多，而cd40l的表达则要高的多，所以这两组实验中dcs表面cd40的表达也是下调的。
此外，过表达4-1bbl还能促进dcs表面cd80的上调，但是对mhc-ii表达没有什么促进作用，而cd40l的高表达依然起到反作用，即下调了mhc-ii的表达，推测可能和cd40的下调有关。本实施例说明，转导migr1-4-1bbl的tgm能有效促进dcs的进一步成熟。
实施例5、在ot-icd8 t细胞表面表达cd40l和4-1bbl后检测对未经改造的ot-icd8 t细胞的增殖辅助作用
a.第-5天取6周～8周龄的c57bl/6雌鼠，分离股骨和胫骨中的骨髓细胞，并加入gm-csf(粒细胞集落刺激生物因子)和il4(重组人白介素-4)培养骨髓细胞来源的树突状细胞，培养期间隔一天换一次培养液。
b.第0天取6周～8周龄的cd45.2-ot-i小鼠，分离脾脏后加入n4刺激培养。
c.24h后用实施例1所得不同病毒转导激活的ot-icd8 t细胞，并将培养6天的树突状细胞加入800ng/mlcpg(腺嘌呤鸟嘌呤核苷酸)刺激进一步成熟，继续培养16h。
d.第2天将cpg刺激培养的dcs收集起来并计数，取所需数量的细胞加入n4负载肽，在37℃培养箱中孵育2.5h。同时取6周～8周龄的cd45.2 ot-i小鼠并分离脾脏细胞，用无血清的rpmi1640培养基重悬细胞。取所需数量的细胞加入rpmi1640培养基稀释到10million/ml，转入50mltube中，tube最多加7ml，加入cfse(荧光染料cfda-se)，进行1/2500稀释，终浓度为2μm。包上锡箔纸室温放置7min，期间不断摇晃均匀，结束后加入5倍体积预冷的20％fbsrpmi1640培养基，320g4℃离心10min。
e.弃上清，并用1×pbs清洗细胞两次，重新计数。
f.并将病毒转导的cd45.2-ot-i脾细胞以及负载肽的dcs收集起来重新计数，与cd45.2 ot-i脾细胞按一定比例混匀后，铺在圆底96孔细胞培养板中培养，并加入10ng/mlil15。
g.共培养36h后，流式检测。操作见图13a。结果参见图13b、13c。
本发明发现只过表达cd40l的tgm就能促进tum(旁观t细胞或者旁侧t细胞)的增殖与空载体病毒转导的细胞相比，但是没有统计学差异。只过表达4-1bbl的细胞相比于只过表达cd40l的细胞能更有效地促进细胞增殖，但是和空载体对照相比依然没有统计学差异。migr1-4-1bbl-t2a-cd40l转导的细胞，即同时过表达4-1bbl和cd40l的细胞从数据可以发现能够显著促进细胞增殖，但是和空载体对照相比依然没有统计学差异，然而和只单独过表达其中一种共刺激分子的细胞相比，都有显著差异。从前面的数据已经知道这种病毒转导的细胞共表达两种蛋白的细胞比例最高，推测可能当两种蛋白同时存在于一种细胞上时提供的信号更强，能更加有效的促进其他细胞的增殖，暗示转导cd40l和4-1bbl的细胞可能主要通过和其它细胞直接接触来促进细胞增殖，而不是通过分泌细胞因子，因为migr1-4-1bbl-t2a-cd40l转导的细胞ifn-γ的表达量远远低于migr1-4-1bbl转导的细胞，但是还有待进一步验证。
实施例6、在ot-icd8 t细胞表面表达cd40l和4-1bbl后检测对未经改造的ot-icd8 t细胞的细胞免疫功能的辅助作用
a.取6周～8周龄的cd45.2-ot-i小鼠，分离脾脏后加入n4刺激培养。
b.24h后分别用实施例1所得不同病毒转导激活的ot-icd8 t细胞。
c.再过24h左右取6-8周龄的cd45.2 ot-i小鼠，分离脾脏细胞并计数重悬。
d.将步骤b所得病毒转导的cd45.2-ot-i脾细胞收集起来重新计数，与步骤c所得cd45.2 ot-i脾细胞按1:1混匀后，铺在圆底96孔细胞培养板中培养，并加入10ng/mlil15和50ng/mln4。
e.共培养72h左右，流式检测。
操作请参见图14。结果请参见图15、图16。
不管cd8 t细胞是否过表达共刺激分子，当被n4激活后就会产生ifn-γ。但是不过表达共刺激分子的cd8 t细胞或者只过表达cd40l的t细胞只能产生低水平的ifn-γ，而过表达了4-1bbl的cd8 t细胞都能协助产生高水平的ifn-γ。过表达4-1bbl的细胞能有效促进更多的cd8 t细胞表达inf-γ，而且能有效提高ifn-γ的平均表达水平。
通过比较migr1-4-1bbl-2a-cd40l和migr1-4-1bbl转导的细胞，发现过表达高水平的cd40l也能提高表达ifn-γ的cd8 t细胞的比例，但是不能有效增强ifn-γ的平均表达水平，也就是单个细胞ifn-γ的表达量较低。而且比较migr1-4-1bbl和migr1-4-1bbl-ires-cd40l以及migr1-4-1bbl-2a-cd40l转导的细胞可以得出结论，4-1bbl的表达水平越高则ifn-γ的表达水平越高，即ifn-γ的表达与4-1bbl的表达呈现正相关。
结合以上数据推测，cd40l可能更倾向于促进ifn-γ cd8 t细胞的增殖来提高ifn-γ cd8 t细胞的比例，但是不能刺激cd8 t细胞ifn-γ的表达，而4-1bbl则既可以促进cd8 t细胞的增殖，又能够有效刺激ifn-γ的高表达。
过表达cd40l的tgm虽然也能提高ifn-γ tum的比例与对照相比，但是与过表达4-1bbl的细胞相比，其辅助作用微乎其微。和之前的数据一致，过表达4-1bbl的细胞能显著刺激tumifn-γ的分泌，这种作用依然和4-1bbl的表达量呈现正相关。
实施例7、在ot-icd8 t细胞表面表达cd40l和4-1bbl后回输治疗mo5
a.复苏mo5细胞，并传至3-4代。
b.第1天将细胞收集起来并计数，用无菌1×pbs将细胞重悬并稀释到4million/ml。将mo5细胞通过注射器接种到6-8周龄c57bl/6小鼠的后背皮下，每只小鼠50μl(0.2million)，然后将小鼠随机分成四组。
c.从第7天开始每隔3天记录一次肿瘤的大小。
d.第10天取6-8周龄ot-i小鼠，分离脾脏细胞后加入n4刺激培养。
e.24h后用实施例1不同的病毒转导激活的ot-icd8 t细胞。
f.第12天分别将细胞收集起来并计数，最后用无菌1×pbs稀释到10million/ml。通过小鼠尾静脉将步骤e所得ot-i脾细胞注射到小鼠外周，每只小鼠200μl(2million)。
操作参见图17a。结果参见图17b、图17c。
根据结果所示：上述体外实验就已经知道过表达cd40l对细胞功能的发育和预期相差甚远，而过表达4-1bbl则能有效刺激细胞的增殖和功能发育。体内也是如此，只过表达cd40l的细胞几乎不能抑制肿瘤的生长，而过表达4-1bbl的细胞则能有效抑制肿瘤细胞的增殖。为什么migr1-4-1bbl转导的细胞抗肿瘤作用最强呢？通过体外的实验数据可以很清楚地发现只过表达4-1bbl的tgm相比于同时过表达4-1bbl和cd40l的细胞促进细胞增殖的能力不如后者，但是能够有效刺激cd8 t细胞ifn-γ的平均表达水平，暗示在抗肿瘤免疫中cd8 t细胞的杀伤能力取决于cd8 t细胞的功能发育，而不是数量。
综上所述，本发明将外源基因4-1bbl整合到抗原特异性t细胞染色体上过表达制备获得具有提高免疫应答功效的t细胞。该具有提高免疫应答功效的t细胞不仅自身增殖快、ifn-γ的表达量高，关键是，还能够显著促进其周围的未携带外源基因的抗原特异性t细胞(例如：与之共培养的未携带外源基因的抗原特异性t细胞，将其回输入肿瘤组织后该肿瘤组织中的抗原特异性t细胞)增殖、ifn-γ表达水平，在激活周围抗原特异性t细胞免疫应答能力方面发挥着“将军”引领作用。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110>广州保瑞医疗技术有限公司
<120>具有提高免疫应答功效的t细胞及其制备方法和应用
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1.一种具有提高免疫应答功效的t细胞，其特征在于，通过将外源基因cd40l、4-1bbl整合到抗原特异性t细胞染色体上过表达制备获得。
2.权利要求1所述的具有提高免疫应答功效的t细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取抗原特异性t细胞，并用特异性抗原激活所述的抗原特异性t细胞；
构建携带有外源基因cd40l、4-1bbl的病毒颗粒，用所述病毒颗粒转染所述激活的抗原特异性t细胞，从而将外源基因cd40l、4-1bbl整合到所述的激活的抗原特异性t细胞染色体上。
3.根据权利要求2所述的具有提高免疫应答功效的t细胞的制备方法，其特征在于，所述的病毒颗粒的构建选用逆转录病毒。
4.根据权利要求3所述的具有提高免疫应答功效的t细胞的制备方法，其特征在于，所述的逆转录病毒为migr1。
5.根据权利要求2所述的具有提高免疫应答功效的t细胞的制备方法，其特征在于，所述的病毒颗粒的构建选用慢病毒。
6.根据权利要求2至5任一项所述的具有提高免疫应答功效的t细胞的制备方法，其特征在于，所述的抗原特异性t细胞为cd8 t细胞。
7.根据权利要求2至5任一项所述的具有提高免疫应答功效的t细胞的制备方法，其特征在于，所述的特异性抗原为抗原特异性t细胞能够识别的多肽。
8.权利要求1所述的具有提高免疫应答功效的t细胞在促进与所述t细胞相邻的免疫细胞的免疫应答功能、细胞增殖中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用是将所述的免疫细胞与所述的提高免疫应答功效的t细胞共培养。
10.权利要求1所述的具有提高免疫应答功效的t细胞在治疗肿瘤、慢性病毒感染、细菌、真菌感染中的应用。
技术总结