本发明属于小鼠细胞基因工程和基因遗传修饰
技术领域：
，涉及基于crispr/cas9技术的muepcam基因人源化小鼠细胞肿瘤细胞模型的构建方法及其在生物医药的应用。
背景技术：
：近年来单克隆抗体作为恶性肿瘤化疗的辅助治疗已经引起广泛关注，其中一种是抗肿瘤相关抗原epcam（egp-40，trop-1,17-1a，ksa，ks1/4，aua-1，ga733-2）的单克隆抗体。epcam是表达在人部分正常上皮细胞和大多数恶性上皮细胞表面的糖蛋白。目前普遍认为它对肿瘤的生物学特性有重要作用，特别是在结直肠癌。1979年在肿瘤细胞表面抗原的研究中，发现epcam为胰腺癌抗原编码epcam的胞外段、跨膜段和胞浆段的基因在染色体4q共包含9个外显子。epcam的胞内段包括26个氨基酸和一个酪氨酸。此段对细胞间的环境有重要作用，epcam的主要功能是黏附作用，属钙离子非依赖性同型细胞间黏附。研究显示epcam和肌动蛋白细胞骨架间通过α辅肌动蛋白相互作用，这可能对黏附和组织形态形成起重要作用。epcam表达于人部分正常上皮细胞，和很多癌细胞表面，包括子宫颈。肺、乳腺，前列腺，肾细胞。结直肠。和皮肤鳞癌，但是黑色素瘤，cns，原发肿瘤，肉瘤，淋巴瘤干细胞中缺乏表达。恶性肿瘤的免疫治疗是一个迅速发展的领域，但是收到很多限制，比如我们对肿瘤相关抗原在肿瘤的生长，扩散和免疫逃逸中的作用的人事还有限。随着免疫治疗研究的深入，我们将了解更多恶性肿瘤的生物学知识和得到更多治疗上的重要提示。但复杂的生物过程通常需要进行体内分析，而人体内生物学的研究受到道德和技术的严重限制，因此越来越需要小鼠肿瘤细胞模型来进行人体细胞、组织和器官的体内研究。目前，科学家们已经开发了多种人源化小鼠肿瘤细胞来克服这些限制，并且现在已经成为人体细胞和组织体内研究的重要工具。在临床药物的研发过程中，小鼠被广泛用于候选药物临床前的安全性及有效性评价，如新型抗病毒药物的体内有效性评价、肿瘤的免疫治疗和开发新型的化学治疗药物、新型抗自身免疫病药物的治疗效果、药物体内代谢和肝毒性、人源抗体的前期开发评估等。因此，在不改变小鼠免疫系统的前提下，构建人源化小鼠肿瘤细胞模型具有重要的意义，可以更好的反应预期临床数据。已证实在裸鼠异种移植结直肠癌模型中epcam单克隆抗体可以破坏肿瘤细胞的特性，sears对20例胃肠道恶性肿瘤患者经不全切除术后，经过epcam单抗辅助治疗后又3例患者肿瘤被清除。wistar研究发现一种小鼠抗epcam抗原的单克隆抗体（edrecolomab），可以杀死对化疗耐药静止期肿瘤细胞。edrecolomab是一种鼠源性ig2a单克隆抗体，作用机制包括抗体依赖细胞接到的细胞毒作用（adcc）和抗体依赖补体接到的细胞毒作用（adcmc）。另外可能和抗个体基因型网络的诱导有关；抗edrecolomab的抗体ab2的其中一种雅兴结构上可能模拟epcam抗原，二这种抗个体基因型抗体ab2可能反过来诱导第三级抗体ab3产生，这些ab3又可以抗epcam抗原。这种ab3反应可能增强edrecolomab的疗效。有研究显示ab3的产生和外周血循环中epcam表达阳性的肿瘤细胞的锐减有关，而且有此免疫应答的患者的生存期比没有的明显延长。能识别此抗个体基因型网络反应的t细胞被命名为t3细胞，他的存在可能也和临床疗效有关。利用基因改造技术，将小鼠肿瘤细胞模型muepcam基因的胞外区进行人源化，保留胞内区及跨膜区序列，构建人源化小鼠肿瘤细胞，具有可直接进行人hsepcam抑制剂的评价、小鼠自身免疫系统不受影响、因小鼠近交系特点实验数据高重复性的特点。利用epcam人源化的小鼠肿瘤细胞模型，可以有效的评价抗人epcam抗体及cart调动免疫系统对人源化肿瘤细胞的杀伤；模拟临床上ipilimumab单用及联用造成的各个脏器的免疫副作用，可以用于评估抗人epcam抗体及cart的安全性。因此，epcam人源化小鼠肿瘤细胞模型（ct26-huepcam）可以有效地推动抗体药物从体外筛选到临床试验的进程，并为药物临床前试验提供充足有力的数据(抗肿瘤药效分析及验证、免疫治疗与小分子药物、免疫治疗抗体药物与化疗联合用药的药效评价等)。综上所述，建立一种epcam基因人源化小鼠肿瘤细胞模型的构建方法非常必要。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种epcam基因人源化小鼠肿瘤细胞模型的构建方法；可用于建立抗人epcam抗体临床前筛选的epcam人源化小鼠肿瘤细胞模型及药效评价平台。本发明的目的还在于提供一种epcam基因修饰人源化小鼠肿瘤细胞模型的应用。本发明的第一个方面，提供了：一种epcam基因人源化小鼠肿瘤细胞的构建方法，包括如下步骤：第1步，确定epcam人源序列以及所述epcam人源序列在小鼠细胞模型epcam基因中的替换区域；所述小鼠细胞模型epcam基因的胞外区替换为所述epcam人源序列，而胞内区保留小鼠细胞模型的原有序列；第2步，在人源化替换区域设计并验证针对小鼠细胞模型序列的sgrna；第3步，设计并构建携带所述epcam人源序列的人源化载体；第4步，将cas9-sgrna载体导入小鼠细胞中，对小鼠细胞模型epcam基因敲除，获得epcam基因敲除的细胞；第5步，构建含有人源化epcam基因的载体，通过病毒包装过程将人源化的epcam基因包装到慢病毒中，经侵染敲除鼠源epcam的细胞，使小鼠细胞模型表达含有人源epcam基因的胞外区序列。在一个实施方式中，epcam人源序列如seqidno.8所示。在一个实施方式中，针对小鼠细胞模型序列的sgrna的序列如seqidno.2或者seqidno.3所示。在一个实施方式中，第3步中人源化打靶载体的构建方法包括：使用bsmbi酶切lenticrisprv2质粒，再将产物与sgrna连接，转化至感受态细胞中。在一个实施方式中，含有人源epcam基因的载体的构建方法是：将含有epcam人源胞外区、epcam鼠源跨膜区和胞内区的序列插入至plvx慢病毒包装载体中，再包装至慢病毒中获得。在一个实施方式中，人源胞外区的序列如seqidno.9所示。本发明的第二个方面，提供了：由上述方法构建得到的epcam基因人源化小鼠肿瘤细胞。本发明的第三个方面，提供了：上述的肿瘤细胞在用于制备肿瘤疾病研究的模型中的应用。在一个实施方式中，肿瘤疾病研究的模型是指以人epcam为靶点的cart、carnk、抗体药的靶细胞。有益效果本发明方法构建的epcam人源化小鼠肿瘤细胞，将小鼠epcam基因的胞外区替换为人源序列，而胞内区则保留完整的鼠源序列。制作成功的人源化小鼠肿瘤细胞模型拥有人源胞外区，可筛选人源免疫检查点药物(如抗体药；cart、carnk等)；而鼠源胞内区则保证其胞内信号传导不受影响，将外部刺激忠实地转化为胞内行为(激活或抑制)。epcam人源化小鼠不仅可以用于抗体肿瘤药效的评估，对药物开发的临床效果有着重要的指导意义。同时也是抗人epcam抗体药物安全性评价的理想模型，对epcam抗体药物的毒理学进行临床前体内评价。epcam人源化小鼠不仅可供于抗人epcam抗体单药评价，同时可用于epcam抗体联合其他药物(小分子或抗体药)抗肿瘤药效评价，cart、carnk细胞杀伤肿瘤评价，对临床前药效评价有着深远的指导意义。附图说明图1是muepcam基因敲除示意图；敲除位点选在atg后第三个外显子上图2是cas9-sgrna载体构建测序比对结果；图3sgrna敲除效率；muepcam-sgrna1切除效率为：68.9%muepcam-sgrna2切除效率为：52.4%图4plvx-huepcampcr扩增m：dl5000marker1：huepcampcr产物图5plvx-huepcam重组质粒测序比对结果；图6ct26细胞muepcam&huepcam表达情况；ct26-huepcamcellpool中muepcam敲除效率为：61.6%；huepcam表达效率为：91.8%图7ct26-huepcam稳定细胞株muepcam&huepcam表达情况；a：ct26细胞中muepcam表达情况b：ct26细胞中huepcam表达情况c、e、g、i、k：ct26-huepcam稳定细胞株中muepcam表达情况d、f、h、j、l：ct26-huepcam稳定细胞株中huepcam表达情况具体实施方式1.1muepcamsgrna设计1.1.1sgrna寡核苷酸链合成使用crispr在线设计工具(http://crispr.mit.edu/)根据评分系统，分别在epcam的3号外显子上设计2个20bp的sgrna。根据这两条标准找到外显子上的核心序列：epcamsgrna-1和epcamsgrna-2。编码链模板5′端添加caccg，非编码链模板3′端添加aaac……………….c，与bsmbi酶切后形成的粘性末端互补，设计2对crispr寡核苷酸链。1.1.2muher23号外显子序列：如下所示，其中下划线为靶向位置：tggcgtctaaatgcttggcgatgaaagcagaaatgactcacagcaagtctgggaggaggataaagcccgaaggggcgatccagaacaacgatgggctgtacgaccccgactgcgacgagcaggggctcttcaaagccaagcagtgcaacggcaccgccacgtgctggtgtgtcaacaccgccggagtccgaagaaccgacaaggacacggagatcacgtgctccgagcgcgtgaggaccta（seqidno.1）1.1.3muepcamsgrna序列设计得到的两条sgrna序列如下：muepcamsgrna-1guidesequence:gagcccctgctcgtcgcagtcgg（seqidno.2）muepcamsgrna-2guidesequence:tcacgtgctccgagcgcgtgagg（seqidno.3）1.1.4epcam靶向位点及sgrna寡核苷酸序列设计2对crispr寡核苷酸链分别如下所示：第一对：epcamsgrna-1oligo1：5’-caccggagcccctgctcgtcgcagt-3’；（seqidno.4）epcamsgrna-1oligo2：5’-aaacactgcgacgagcaggggctcc-3’；（seqidno.5）第二对：epcamsgrna-2oligo1：5’-caccgtcacgtgctccgagcgcgtg-3’；（seqidno.6）epcamsgrna-2oligo2：5’-aaaccacgcgctcggagcacgtgac-3’；（seqidno.7）1.2cas9-muepcamsgrna载体构建合成上述设计得到的sgrna单链，形成双链dna后构建于载体中。具体步骤如下：1.2.1使用bsmbi酶切1μglenticrisprv2质粒，30min，37℃；反应体系如下：1.2.2使用天根胶回收试剂盒纯化酶切质粒产物，按说明书进行操作。1.2.3sgrnaoligo退火及双链的形成反应体系如下：退火程序如下：1.2.4lenticrisprv2&sgrna连接，16℃孵育2h。反应体系如下：1.2.5将连接后的质粒转化至感受态细胞dh5α中，均匀涂至amp抗性lb固体培养基平板中，置于37℃培养箱中培养12-16小时，单个菌落即可出现。1.2.6挑取单个菌落扩大培养并质粒小提。1.2.7测序鉴定质粒构建成功，命名为lenticrisprv2-muepcamsgrna-1&lenticrisprv2-muepcamsgrna-2。1.2.8结论：测序结果显示成功构建muepcam基因敲除载体：lenticrisprv2-muepcamsgrna-1lenticrisprv2-muepcamsgrna-21.3脂质体法转染v2-muepcamsgrna1.3.1欲混试剂：a&bab1.3.2提前一天用完全培养基（10％胎牛血清的高糖dmem培养基）接种小鼠结肠癌细胞ct26，于5％co2，37℃恒温培养箱中培养，1.3.3细胞达到70-90%汇合度时转染1.3.4使用opti-memlipofectaminer3000试剂充分混匀1.3.5使用opti-mem培养基稀释dna制备dna欲混液，然后添加p3000tm试剂充分混匀1.3.6将稀释dna与稀释的lipofectaminer3000试剂混合（1:1）1.3.7孵育5mins1.3.8加入dna-脂质体复合物至细胞中1.3.948-72h用含1ng/ml嘌呤霉素（puro）完全培养基抗性筛选1.3.10待对照细胞完全死亡，改用完全培养基恢复培养2-3天1.3.11消化，收集细胞用于facs法鉴定敲除效率1.4流式检测muepcam敲除效率1.4.1收集1.3中cellpool细胞，至15ml离心管中，1000r/min，离心5min后弃液。1.4.2再加入10ml预冷的pbs重悬细胞，并用移液器轻轻吹打混合均匀，1000r/min，离心5min后弃液，再加入10ml预冷的pbs同前述方法清洗1遍，细胞计数，最后用pbs重悬细胞制成1×106/ml的单细胞悬液。（3）用muepcam-apc（bd563478）来标记表达经敲除的ct26细胞。取离心管标记为分析管向其中加入细胞悬液1ml，加入2ulmuepcam-apc（bd563478）。（4）避光，4℃孵育30min。1000r/min，离心10min，弃液，用预冷的pbs清洗2次，离心弃液。（5）最后加入500μlpbs，轻柔地重悬细胞，使之成为单细胞悬液。将其对应移入标记好的流式上样管。（6）另取一个上样管，加入0.1ml初始细胞悬液，补加0.4mlpbs，作为阴性对照管。（7）用流式细胞仪进行检测，操作如下：a．用分析管中的细胞检测样品中的敲除muepcam的ct26细胞的比例。b．用分析管中的细胞检测样品中的敲除muepcam的ct26细胞的比例。检测结果如图3所示，切割效率如下所示：sgrna名称切割效率muepcam-sgrna168.9%muepcam-sgrna252.4%由此可以看出，sgrna1具有更高的切割效率，后续实验将使用sgrna-1进行基因敲除的细胞系。2muepcam人源化2.1muepcam人源化序列2.1.1人源胞外区、鼠源跨膜区、鼠源胞内区序列：设计的人源化muepcam的序列（seqidno.8）如下所示：其中人源胞外区为下划线所示（seqidno.9），鼠源跨膜区（seqidno.10）如斜体所示，鼠源胞内区（seqidno.11）如黑体所示：cctcgagatggcgcccccgcaggtcctcgcgttcgggcttctgcttgccgcggcgacggcgacttttgccgcagctcaggaagaatgtgtctgtgaaaactacaagctggccgtaaactgctttgtgaataataatcgtcaatgccagtgtacttcagttggtgcacaaaatactgtcatttgctcaaagctggctgccaaatgtttggtgatgaaggcagaaatgaatggctcaaaacttgggagaagagcaaaacctgaaggggccctccagaacaatgatgggctttatgatcctgactgcgatgagagcgggctctttaaggccaagcagtgcaacggcacctccatgtgctggtgtgtgaacactgctggggtcagaagaacagacaaggacactgaaataacctgctctgagcgagtgagaacctactggatcatcattgaactaaaacacaaagcaagagaaaaaccttatgatagtaaaagtttgcggactgcacttcagaaggagatcacaacgcgttatcaactggatccaaaatttatcacgagtattttgtatgagaataatgttatcactattgatctggttcaaaattcttctcaaaaaactcagaatgatgtggacatagctgatgtggcttattattttgaaaaagatgttaaaggtgaatccttgtttcattctaagaaaatggacctgacagtaaatggggaacaactggatctggatcctggtcaaactttaatttattatgttgatgaaaaagcacctgaattctcaatgcagggtctaaaagccgggatcatcgctgtcattgtggtggtgtcattagcagtcatcgcggggattgttgtcctggttatatctacaaggaagaaatcagcaaaatatgagaaggctgagataaaggagatgggtgagatccacagagagcttaatgcctagtctagag2.1.2huepcam全长基因pcr扩增引物：用于扩增huepcam基因的pcr引物序列如下所示，直接获得相应的序列，可以通过基因合成的方法获得人源化序列。huepcam-fl-xho1-f：cctcgagatggcgcccccgcaggtcct（seqidno.12）huepcam-fl-xba1-r：ctctagactaggcattaagctctctgtgg（seqidno.13）2.1.3huepcampcr鉴定&测序引物：扩增后，通过如下的引物对产物进行鉴定和测序：huepcam-jc-f：ccagaacaatgatgggcttt（seqidno.14）huepcam-jc-r：gacaccaccacaatgacagc（seqidno.15）2.2plvx-huepcam构建通过xbai和xho1酶切位点将huepcam基因克隆入plvx慢病毒包装载体，经pcr扩增筛选阳性重组质粒进行鉴定，分别如图4和图5所示，测序验证正确。反应体系如下：h2o31ulbuffer5ulq5（诺唯赞）1ulprimerf1ulprimerr1ulsample1ultotal50ul反应程序如下：2.3lv-huepcam慢病毒制备2.3.1293t细胞接种将生长状态良好的293t细胞用0.25%胰蛋白酶消化制备单细胞悬液并调整浓度为4x10^5/ml，取10ml接种于10cm培养皿中。37˚c，5%co2培养箱内培养过夜，第二天细胞汇合度将达到80%。2.3.2病毒包装将8.5µgpmd2g、17µgpspax2和plvx-huepcam质粒34µg加到3mlopti-mem内混匀，加入120µlx-tremegenehpdnatransfectionreagent混匀，室温静置15min。逐滴加入到培养瓶内，充分混匀。12h后更换为含10
