本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及葡萄球菌噬菌体组合物及其在防治葡萄球菌感染疾病的药物中应用。
背景技术：
葡萄球菌为革兰氏阳性菌，菌体直径约0.8μm，呈小球形，可分解甘露醇，绝大多数菌株为凝固酶阳性和触酶试验阳性。葡萄球菌是奶牛乳房炎的主要病原菌，广泛分布于自然界、奶牛乳头以及奶牛皮肤表面，可经挤奶等方式在牛群内传播。随着抗生素的广泛应用，其表现出越来越普遍的多重耐药，极易对奶牛的健康和牛奶等食品的卫生安全埋下安全隐患。
噬菌体作为一种病毒，是一类专一性强、安全性高、效果稳定的新型生物制剂。葡萄球菌噬菌体组合物具有以下优点，可用于葡萄球菌的防控：
(1)特异性强：特异性作用于葡萄球菌，不影响宿主体内正常菌群，对人体和动物无毒副作用；
(2)安全放心：葡萄球菌噬菌体的应用，减少了抗生素的使用，避免耐药性较强的菌株的传播扩散，也避免人体通过牛奶等食品间接摄入大量抗生素；
(3)可多次增殖：噬菌体在动物体内特异性识别病原菌后，可实现自我繁殖，应用一次可实现多次预防。
(4)组合应用：单株葡萄球菌噬菌体可裂解的葡萄球菌菌株种类有限，多株葡萄球菌噬菌体组合后可裂解的葡萄球菌菌株数量将大幅提高。
(5)方便易用：经车间工艺制备成膏剂、液体、粉剂后，可不受应用对象、应用场景、应用环节等限制。可应用于畜禽因葡萄球菌造成的感染、畜禽养殖过程和场所、畜禽屠宰加工设备和场所、食品加工设备、食品原材料运输设备、食品原材料、半成品和成品等。
但是目前已发现的葡萄球菌噬菌体较少，裂解谱较窄，极大的限制了这类噬菌体的应用，还需要进一步的噬菌体的筛选和研究。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供了由两株葡萄球菌噬菌体vb-saum-pb67和vb-saum-pb93复配形成的噬菌体组合物及以这种噬菌体组合物为主要活性成分的药物组合物以及该组合物的应用，上述噬菌体组合物可被用于制备防治葡萄球菌感染导致的疾病的药物、饲料添加剂、消毒剂，在解决葡萄球菌感染的同时，避免了由于使用抗生素带来的抗生素残留和葡萄球菌菌株耐药性的问题。
本发明的技术方案具体如下：
一方面，本发明提供了自河南省某奶牛场污水中分离得到的两株裂解能力强的噬菌体，分别命名为葡萄球菌噬菌体vb-saum-pb67和葡萄球菌噬菌体vb-saum-pb93。葡萄球菌噬菌体vb-saum-pb67已于2019年11月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.18856；葡萄球菌噬菌体vb-saum-pb93也是于2019年11月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.18857。
上述两株噬菌体在双层琼脂培养基上均可形成直径较大、透亮的噬菌斑，噬菌斑边缘清晰，呈规则圆形，直径为0.5mm的噬菌斑。
上述两株噬菌体可分别单独使用，被应用于制备治疗或预防因葡萄球菌感染导致疾病的药物；或用于制备消毒剂，用于解决畜禽产品生产加工过程中的葡萄球菌污染问题。
进一步地，本发明还提供了一种葡萄球菌噬菌体组合物，该组合物是基于鸡尾酒法将噬菌体vb-saum-pb67和噬菌体vb-saum-pb93进行复配而成。这样复配形成的噬菌体组合物的抗菌效果最佳，裂解能力最大化。
可选地，噬菌体vb-saum-pb67和噬菌体vb-saum-pb93的活体数量之比为1:1；每种噬菌体的的浓度不低于1×109pfu/ml。
可选地，所述葡萄球菌噬菌体组合物还包括噬菌体vb-saum-pb67和噬菌体vb-saum-pb93的突变体中的一种或多种；所述突变体与对应的噬菌体的同源性不小于90％。
由于噬菌体在复制过程中非常容易发生突变，因而优选的，上述噬菌体的突变体也在本申请请求保护的范围内。通过现有技术中公知的计算机程序可以适当地进行同源性的测定，vb-saum-pb67和vb-saum-pb93的突变体至少90％与所述噬菌体的天然序列相同；且所述突变体具有与最初的噬菌体大致相同的灭杀病原菌的功能。更优选的，突变体有92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与各自对应的噬菌体的天然序列相同。其中，vb-saum-pb67和vb-saum-pb93的序列可根据本发明保藏的生物材料通过公知的方法测序得到。噬菌体vb-saum-pb67和vb-saum-pb93的突变体可为点突变、缺失突变或添加突变，相对于最初的噬菌体序列，有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多碱基可发生变化。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体筛选出与其性状相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。
另一方面，本申请还提供了上述葡萄球菌噬菌体组合物在制备治疗或预防葡萄球菌感染的疾病的药物中的用途。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述组合物来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述组合物而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。
其中，所述葡萄球菌为奶牛乳房炎的病原菌，包括凝固酶阳性葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌。
此外，本发明还提供一种药物组合物或饲料添加剂，其有效成分包括上述的葡萄球菌噬菌体组合物；优选的，所述杀菌组合物还包括不同种类细菌的特定病原菌的噬菌体。
可选地，可以通过外用、口服或肠胃外途径给予本发明的药物组合物，具体而言，可以经由皮肤、口服、经直肠、外用、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鼻内和吸入途径来给予本发明的组合物。优选地，所述药物制剂形式为灌注。
可选地，所述药物组合物中还包含药学上可接受的载体。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述药物组合物配制成液体制剂，药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。它们可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当还与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时，还可以将本发明的组合物制备成注射剂(例如，水性溶液、悬浮液和乳液)，或者丸剂、胶囊、粒剂或片剂。
此外，本申请还提供一种环境消毒剂，其有效成分包括如上所述的葡萄球菌噬菌体组合物；优选地，每种噬菌体的浓度为1×109pfu/ml以上。
可选地，环境消毒剂还包含其他用于环境中病毒、细菌抑制或消灭的活性成分；优选的，可应用环境消毒剂的环境包括饲料、水和养殖环境，所述养殖环境包括料槽、地面、墙壁、粪便和垫料。
环境消毒剂的应用方法具体为：将葡萄球菌噬菌体组合物作为环境消毒剂，在屠宰场、畜禽产品加工车间及器具、养殖环境中使用，防止环境中葡萄球菌的污染。例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、医疗设施、养殖业设施、公共及私人设施或其他环境表面进行消毒去污，可有效控制目标细菌的生长及活性。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等。
此外，本发明还提供一种试剂盒，其包括上述的葡萄球菌噬菌体组合物。本领域技术人员可根据本发明公开内容和本领域常识利用上述葡萄球菌噬菌体组合物制备检测试剂盒，用于检测其特异侵染的葡萄球菌，用于检测和防控由其宿主菌葡萄球菌侵染导致的疾病。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明筛选到两株噬菌体，分别为葡萄球菌噬菌体vb-saum-pb67和vb-saum-pb93，对牛源葡萄球菌具有强的裂解作用，可用于防治由牛源葡萄球菌感染导致的疾病，如奶牛乳房炎。此外，上述两株噬菌体均为肌尾噬菌体，vb-saum-pb67和vb-saum-pb93分别在moi＝0.001和moi＝0.0001时，效价达到最高，使用少量噬菌体即可进行大批量增殖；在40～60℃和ph为5～10的条件下均能存活，不易失活。
2、本发明还提供一种葡萄球菌噬菌体组合物，可用于有效治疗葡萄球菌感染导致的疾病，该葡萄球菌噬菌体组合物是通过葡萄球菌噬菌体vb-saum-pb67和vb-saum-pb93的复配作为有效成分；与单一裂解性单株噬菌体相比，该组合物大大拓宽了其杀菌范围，增加其杀菌活性，可提高奶牛的体质和抗病力。
3、本发明涉及的噬菌体从自然界中获得，数量庞大，来源广，容易分离获得，属于天然生物。因此，由上述噬菌体或其组合物制备而的药物或消毒剂不仅可降低成本，还具有绿色环保的优点。
附图说明
图1为葡萄球菌噬菌体vb-saum-pb67的噬菌斑图片；
图2为葡萄球菌噬菌体vb-saum-pb93的噬菌斑图片；
图3为葡萄球菌噬菌体vb-saum-pb67的电镜图片；
图4为葡萄球菌噬菌体vb-saum-pb93的电镜图片；
图5为葡萄球菌噬菌体vb-saum-pb67的热稳定性结果；
图6为葡萄球菌噬菌体vb-saum-pb93热稳定性结果；
图7为葡萄球菌噬菌体vb-saum-pb67的ph值稳定性结果；
图8为葡萄球菌噬菌体vb-saum-pb93的ph值稳定性结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1噬菌体的分离、纯化和扩增
取河南和山东省青岛市某奶牛场粪便污水，加入葡萄球菌对数期菌液，并加入适量营养肉汤，置于37℃、170rpm摇床培养16h。取出5ml液体，11000rpm/min离心10min，上清液经0.22μm的无菌微孔滤膜滤过后，得到噬菌体原液。
利用双层平板法分离噬菌体，将噬菌体原液10倍比稀释，分别取100μl稀释液与100μl相应的葡萄球菌菌液混合，37℃孵育5min，混合入0.8％的上层琼脂培养基，均匀地铺在1.5％下层琼脂培养基上，冷却后于37℃温箱倒置培养过夜。次日，观察成斑情况，挑取单个噬菌斑，重复纯化3次，分别得到单一的噬菌体。
纯化完成后抠取单斑浸出，取100μl噬菌体浸出液与100μl宿主菌对数期菌液于5ml液体nb培养基中，37℃、170rpm摇床中振荡培养至液体变清亮，得到噬菌体增殖液。
按照上述方法分别得到2株纯化后的噬菌体，分别命名为噬菌体vb-saum-pb67和噬菌体vb-saum-pb93，vb-saum-pb67分离自河南某奶牛场粪便污水，vb-saum-pb93分离自山东省青岛市某奶牛场粪便污水，两种噬菌体的成斑大小均为0.5mm，成斑图片分别见图1和图2。
实施例2噬菌体的形态学观察
取20μl效价为1×109pfu/ml噬菌体悬液滴于铜网上，以2％磷钨酸染色5～10min，将铜网放于干燥滤纸上，自然干燥，利用日立ht7700型透射电子显微镜观察。
如图3所示，噬菌体vb-saum-pb67的头部呈二十面体结构，头长100～110nm，头宽80～90nm，尾部长200nm，根据病毒分类国际委员会(ictv)的定义，噬菌体vb-saum-pb67的形态符合肌尾噬菌体科的特征，属于肌尾噬菌体。
如图4所示，噬菌体vb-saum-pb93的头部呈二十面体结构，头长60～70nm，头宽40～50nm，尾部长250nm的肌尾噬菌体，根据病毒分类国际委员会(ictv)的定义，噬菌体vb-saum-pb93的形态符合肌尾噬菌体科的特征，属于肌尾噬菌体科。
实施例3噬菌体裂解谱的测定
双层平板法测裂解谱，挑取奶牛乳房炎病例分离的102株牛源金黄色葡萄球菌和1株金黄色葡萄球菌标准株(25923)的单菌落分别接种于5ml营养肉汤中，摇床中培养得到对数期菌液。取100μl细菌菌液与100μl噬菌体按照实施例1中常规方法铺双层平板，待凝固后于37℃温箱培养过夜，观察并记录结果。其中，102株牛源金黄色葡萄球菌来自山东各地区，分别为莱西、日照等，1株为金黄色葡萄球菌标准株(25923)；103株金黄色葡萄菌中，90株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)，4株为甲氧西林敏感葡萄球菌(mssa)；9株为边缘性抗苯甲异恶唑青霉素菌株(borsa)。
通过裂解谱测定实验和下表1结果可发现，噬菌体vb-saum-pb67的总裂解率为72.82％，能裂解75株金黄色葡萄球菌。而vb-saum-pb93的总裂解率为76.70％，能裂解79株金黄色葡萄球菌。
而葡萄球菌噬菌体组合物的裂解谱最宽，达90.29％，能裂解93株金黄色葡萄球菌，并且1株葡萄球菌标准株都能够被裂解。这说明葡萄球菌噬菌体组合物的裂解能力最大化，其可弥补噬菌体单一应用时宿主谱的局限性。
表1噬菌体的裂解谱
实施例4噬菌体的效价测定
按照常规方法增殖噬菌体和宿主菌，测定噬菌体及宿主菌效价，并将噬菌体vb-saum-pb67、vb-saum-pb93和其宿主菌进行适当的稀释。分别按照感染复数为10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001、0.0000001的比例各取100μl噬菌体和宿主菌加入到nb肉汤中。于37℃、170rpm振荡培养至液体变澄清，记录液体变澄清时间。经11000rpm离心5min后，取上清用双层平板法测定噬菌体的效价。vb-saum-pb67和vb-saum-pb93分别在moi＝0.001和moi＝0.0001时，效价达到最高。vb-saum-pb67的最高效价能达到5.9×109pfu/ml，vb-saum-pb93的最高效价达6.2×109pfu/ml。
实施例5噬菌体热稳定性的测定
各取100μl噬菌体增殖液分装于无菌ep管中，分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴中作用20min、40min和60min。每一温度设2个重复。待作用结束后取样，并立即将样品置于冰浴中冷却，通过10倍倍比稀释后用双层平板法测定噬菌体的效价。以温度为横坐标，以噬菌体效价的对数值为纵坐标，绘制噬菌体热稳定性曲线。vb-saum-pb67和vb-saum-pb93的热稳定性曲线依次为图5和图6。
热稳定性结果发现，作用1h后，噬菌体vb-saum-pb67在40℃、50℃依然保持较高活性，在60℃中效价下降3个梯度，在70℃和80℃中完全失活。说明本发明噬菌体vb-saum-pb67的热稳定性较好，能够满足在工艺制备时的需要。
热稳定性结果发现，作用1h后，噬菌体vb-saum-pb93在40℃、50℃依然保持较高活性，在60℃中效价下降4个梯度，在70℃和80℃中完全失活。说明本发明噬菌体vb-saum-pb93的热稳定性较好，能够满足在工艺制备时的需要。
实施例6噬菌体的ph稳定性的测定
于无菌试管加入不同ph值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的nb肉汤4.5ml，然后将上述试管置于37℃的水浴锅中，待温度平衡后各加入500μl噬菌体增殖液混匀后，37℃水浴作用1h、2h和3h。每管样品采用双层平板法测定噬菌体效价，并且每个ph值设定2个重复。以ph值为横坐标，噬菌体效价的对数值为纵坐标绘制噬菌体ph值稳定性曲线。vb-saum-pb67和vb-saum-pb93的ph稳定性曲线依次见图7和图8。
ph测定结果显示，两种噬菌体在ph5～10环境中作用3h后，噬菌体效价均较稳定，效价基本保持不变。这说明本发明的两株噬菌体能够耐受一定的酸碱环境。
实施例7噬菌体组合物在治疗奶牛乳房炎的功效实验
奶牛乳房炎的治疗试验在青岛市莱西某奶牛场进行，选取场内16头临床型乳房炎的奶牛，且病原菌为金黄色葡萄球菌。随机分为2组，噬菌体治疗组和抗生素对照组，每组8头奶牛。将2组奶牛饲养在同一个牛舍中，噬菌体治疗组用按照1:1混合的2种葡萄球菌噬菌体混合制剂，在每次挤奶后对乳房炎奶头灌注50ml的2种用无菌生理盐水稀释至均1×109pfu/ml的噬菌体混合制剂；抗生素对照组使用氨苄西林钠进行注射治疗。一天2次，处理1周后，观察乳房炎乳房的表观症状，乳汁性状、并测定其分泌乳汁中的体细胞数量，对治疗效果进行评价，治疗效果评价标准如下：
①完全治愈：乳房和乳汁性状正常且体细胞数检测合格判定；
②症状改善：乳房肿胀或者乳汁性状变性呈棉絮状、坏奶块、血奶、呈淡棕色或黄褐色，有凝片或血丝有所改善，但未完全正常，体细胞数仍偏高；
③治疗前后无差异的判定为症状无变化或者病情加重。
实验结果表明，噬菌体治疗组中有3头完全治愈，有4头奶牛的乳房炎症状有所改善，有效率达到87.5％；抗生素对照组中仅有1头奶牛的乳房炎症状得到缓解，其他7头奶牛的乳房炎症状没有减轻。这说明：以灌注的方式进行饲喂的葡萄球菌噬菌体组合物能够有效治疗葡萄球菌引起的奶牛乳房炎，效果远高于对照组。
实施例8噬菌体组合物在清除奶牛养殖环境中的葡萄球菌的应用实验
养殖环境中的葡萄球菌的清除试验在青岛市莱西某奶牛场中进行，将1g垫料均匀摊开，将1ml浓度为1×105cfu/ml的金黄色葡萄球菌atcc25923菌液均匀喷洒在垫料表面，然后将预先将用生理盐水稀释后的噬菌体组合物消毒液(组合物中2株噬菌体的效价均为5×108pfu/ml)喷洒在垫料表面，分别在喷洒3h后，使用平板计数法对垫料表面的葡萄球菌的菌落进行菌落计数。试验同时以喷洒pbs缓冲液作为对照。
试验结果表明，使用噬菌体组合物消毒液喷洒3h后，垫料表面的葡萄球菌的数量降到50cfu/1g垫料以下；pbs对照组垫料中的葡萄球菌无明显变化，说明所述噬菌体组合物以环境消毒剂的方式可以有效清除掉奶牛养殖环境中的葡萄球菌。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
1.一种葡萄球菌噬菌体组合物，其特征在于，包括保藏编号为cgmccno.18856的葡萄球菌噬菌体vb-saum-pb67以及保藏编号为cgmccno.18857的葡萄球菌噬菌体vb-saum-pb93。
2.根据权利要求1所述的葡萄球菌噬菌体组合物，其特征在于，大肠杆菌噬菌体与沙门氏菌噬菌体的活体数量之比为1:1；每种噬菌体的的浓度不低于109pfu/ml。
3.根据权利要求2所述的葡萄球菌噬菌体组合物，其特征在于，所述葡萄球菌噬菌体组合物还包括葡萄球菌噬菌体vb-saum-pb67和葡萄球菌噬菌体vb-saum-pb93的突变体中的一种或多种；所述突变体与对应的噬菌体的同源性不小于90％。
4.如权利要求1所述的葡萄球菌噬菌体组合物在制备治疗或预防葡萄球菌感染的疾病的药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述葡萄球菌为奶牛乳房炎的病原菌，包括凝固酶阳性葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌。
6.一种药物组合物或饲料添加剂，其有效成分包括权利要求1-3中任一项所述的葡萄球菌噬菌体组合物；优选的，所述杀菌组合物还包括不同种类细菌的特定病原菌的噬菌体。
7.根据权利要求6所述的药物组合物或饲料添加剂，其特征在于，所述药物制剂形式为口服给药剂型、外用剂型或肠外给药剂型。
8.一种环境消毒剂，其特征在于，有效成分包括如权利要求1-3所述的葡萄球菌噬菌体组合物；优选地，每种噬菌体的浓度为1×109pfu/ml以上。
9.如权利要求8所述的环境消毒剂，其中还包含其他用于环境中病毒、细菌抑制或消灭的活性成分；优选的，可应用环境消毒剂的环境包括饲料、水和养殖环境，所述养殖环境包括料槽、地面、墙壁、粪便和垫料。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-3中任一项所述的葡萄球菌噬菌体组合物。
技术总结