本发明涉及一种表达细粒棘球蚴eg95蛋白的重组狂犬病病毒及其构建方法与应用，属于生物病毒疫苗技术领域。
背景技术：
棘球蚴病(hydatiddisease)又称包虫病(hydatidosis)，是由棘球绦虫的幼虫引起的一种人兽共患病。囊型包虫病(cysticechinococcosis,ce)是由细粒棘球绦虫(echinococcusgranulosus)的幼虫细粒棘球蚴(echinococcosgranulosus,e.g)感染人或动物的组织器官所致。羊或牛等是细粒棘球绦虫的中间宿主，人可作为中间宿主偶然感染，而犬类是终末宿主。犬类感染细粒棘球蚴后，幼虫可在小肠发育成熟并产生虫卵；虫卵可通过粪便排放从而污染环境，人及易感动物接触后，可于体内发育为棘球蚴，随血液循环寄生于组织器官，引起疾病。该病主要在犬类和羊或牛等家畜间循环，主要流行于畜牧业发达地区，呈世界性分布，我国主要发生在新疆、青海、宁夏、甘肃、西藏、四川等地。以新疆为例，通过调查研究显示，新疆约有50多个县市受到包虫病威胁，其中病例报告最多的地区，95％以上病例为囊型包虫病患者。据统计，我国每年因包虫病而引起的畜牧业经济损失高达30亿元。该病可引起家畜生长缓慢，生产性能下降甚至死亡，造成严重经济损失，同时也威胁着人类的健康。
eg95蛋白是一种六钩蚴抗原，分子量为24.5kda，其编码基因全长715bp，其中462bp基因可编码16.5kda分子量的蛋白质。eg95蛋白在细粒棘球绦虫的成虫、六钩蚴和原头节各阶段虫体均可表达，说明eg95在虫体发育的各阶段均有重要的生物学活性。lightowlers等研究发现，选择几种细粒棘球绦虫的同源蛋白进行免疫实验，结果发现eg95蛋白是迄今为止发现的最有效保护性抗原。eg95蛋白不仅能够在中间宿主体内引起机体的免疫应答反应，抵抗包虫病的感染，还能抑制其体内的虫体发育，保护率达到了96％～98％。
狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabiesvirus，rabv)引起的全球流行、危害严重的人兽共患病，病死率几乎为100％。rabv基因组编码五种结构蛋白，分别是核蛋白(n)、磷酸蛋白(p)、基质蛋白(m)、糖蛋白(g)和rna依赖的rna聚合酶(l)。家畜若因犬类咬伤感染rabv，一旦发病几乎全部死亡，造成畜牧业经济损失。在狂犬病流行地区，均有羊、牛等家畜狂犬病的报告。疫苗免疫接种已成为消除和预防狂犬病最重要的应对措施，狂犬疫苗接种显得尤为重要。rabv作为表达外源基因的载体，具有独特优势，已有很多研究者以rabv为载体研制多种表达各类外源病毒抗原蛋白的重组疫苗。
犬不仅是rabv的主要携带者，其作为细粒棘球绦虫的终末宿主也是包虫病传播的主要来源。在牧区，牧民常常需要牧羊犬来帮助管理羊群，也存在家庭屠宰后将病畜内脏喂狗等情况，增加包虫病与狂犬病共同流行的概率，为避免包虫病和狂犬病双重流行而造成严重的经济损失，因此对于细粒棘球绦虫和狂犬病的共同防治是很有必要的。
针对犬、牛、羊及携带细粒棘球蚴的野生动物，研制一种安全有效的可以同时预防囊型包虫病和狂犬病的重组二联疫苗，可以保障牧区畜牧业的发展和人民身体健康，减少经济损失，对两种疾病的防控均具有重要意义。
技术实现要素：
针对现有技术中对于同时预防囊型包虫病和狂犬病的重组二联疫苗研究的不足，本发明提供了一种表达细粒棘球蚴eg95蛋白的重组狂犬病病毒及其构建方法与应用，本发明通过将人工优化的细粒棘球蚴编码eg95蛋白的基因序列插入到狂犬病病毒基因组中，构建重组狂犬病病毒，获得免疫原性好、毒力弱、复制滴度高的重组病毒。该重组病毒免疫动物后，能诱导机体产生针对狂犬病病毒和囊型包虫病的高效价特异性中和抗体。
术语说明：
psad质粒：含有狂犬病病毒sad株全长基因组的质粒。
eg95蛋白：细粒棘球蚴eg95蛋白，是一种针对细粒棘球蚴感染的保护性抗原。
本发明的技术方案如下：
一种表达细粒棘球蚴eg95蛋白的重组狂犬病病毒，其特征在于，所述重组狂犬病病毒为在狂犬病病毒基因组的假基因区插入人工优化的细粒棘球蚴eg95基因，并经转染后制备得到，所述人工优化的细粒棘球蚴eg95基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述重组狂犬病病毒的基因组核苷酸序列如seqidno.2所示。
上述表达细粒棘球蚴eg95蛋白的重组狂犬病病毒的构建方法，步骤如下：
(1)在人工优化的细粒棘球蚴eg95基因的两端分别添加pfl23ⅱ、nheⅰ酶切位点，双酶切后插入至psad质粒，得重组质粒psad-eg95；所述人工优化的细粒棘球蚴eg95基因的核苷酸序列如seqidno.1所示；
(2)将步骤(1)的重组质粒psad-eg95与辅助质粒共同转染bhk-21细胞，经培养收获上清，即得表达细粒棘球蚴eg95蛋白的重组狂犬病病毒，所述重组狂犬病病毒的基因组核苷酸序列如seqidno.2所示。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述psad质粒采用现有技术制备，制备方法参照rabiesvirusexpressingdendriticcell-activatingmoleculesenhancestheinnateandadaptiveimmuneresponsetovaccination，yongjunwen等,journalofvirology,2011。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述转染的步骤为：将bhk-21细胞铺板于6孔板，10％fbs的dmem培养基培养12-16h，转染时细胞密度为80-90％，重组质粒psad-eg95的用量为2.0μg。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述辅助质粒为psad-n、psad-p、psad-l和psad-g，所述辅助质粒的用量为：psad-n0.5μg、psad-p0.25μg、psad-l0.1μg、psad-g0.15μg，其中，辅助质粒psad-n、psad-p、psad-l、psad-g按照现有技术制备，制备方法参照rabiesvirusexpressingdendriticcell-activatingmoleculesenhancestheinnateandadaptiveimmuneresponsetovaccination，yongjunwen等,journalofvirology,2011。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述培养为：将转染后的bhk-21细胞置于37℃、5％co2培养箱中培养4-5天。
本发明中，步骤(2)所得上清即为狂犬病和囊型包虫病的二联疫苗。
上述表达细粒棘球蚴eg95蛋白的重组狂犬病病毒在制备预防狂犬病和囊型包虫病的二联疫苗中的应用。
上述未详细说明的实验步骤及操作可按照现有技术进行。
有益效果：
1、本发明通过反向遗传技术成功构建表达细粒棘球蚴eg95蛋白的重组狂犬病病毒，获得免疫原性好、毒力弱、复制滴度高的重组狂犬病病毒，重组狂犬病病毒在na细胞中的滴度达到3.2×108ffu/ml，与亲本狂犬病病毒sad株的生长滴度相近，这表明eg95蛋白基因的插入对重组狂犬病病毒的复制没有明显影响；重组狂犬病病毒免疫动物，小鼠无任何明显发病症状，与亲本病毒一致，表明该重组病毒安全性高。重组狂犬病病毒还可诱导小鼠产生狂犬病病毒中和抗体和eg95特异性抗体，抗体水平高，可对细粒棘球蚴感染提供有效保护。
2、本发明成功构建了表达细粒棘球蚴eg95蛋白的重组狂犬病病毒，并进行了鉴定和动物免疫，这为该重组病毒应用于制备预防狂犬病和囊型包虫病二联疫苗奠定了良好的基础。
附图说明
图1为重组质粒psad-eg95双酶切琼脂糖凝胶电泳图；
图中，m泳道为dna标志物dl15000，1泳道为重组质粒psad-eg95条带；
图2为重组狂犬病病毒的pcr验证琼脂糖凝胶电泳图；
图中，m泳道为dna标志物dl2000，1泳道为狂犬病病毒sad株条带，2泳道为重组狂犬病病毒条带；
图3为重组狂犬病病毒的免疫荧光(ifa)染色鉴定显微镜照片，
图中，sad-eg95为重组狂犬病病毒组，sad为狂犬病病毒sad株组，mock为空白对照组，rabvn为兔源rabv多抗，eg95为鼠源eg95蛋白多抗；
图4为重组狂犬病病毒的复制动力学曲线；
图中，a的宿主细胞为na细胞；b的宿主细胞为bhk-21细胞；sad-eg95为重组狂犬病病毒组，sad为狂犬病病毒sad株组；纵坐标为病毒滴度，横坐标为病毒感染后时间；
图5为动物免疫4周后血清抗体水平柱状图；
图中，a为favn法检测狂犬病病毒中和抗体滴度柱状图，纵坐标为病毒中和抗体滴度；b为elisa检测eg95特异性抗体水平柱状图，纵坐标为od450；sad-eg95为重组狂犬病病毒组，sad为狂犬病病毒sad株组，mock为空白对照组。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备均为本技术领域的常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为普通市售产品。
实施例中的psad质粒采用现有技术制备，制备方法参照rabiesvirusexpressingdendriticcell-activatingmoleculesenhancestheinnateandadaptiveimmuneresponsetovaccination，yongjunwen等,journalofvirology,2011。
实施例中的辅助质粒psad-n、psad-p、psad-l、psad-g按照现有技术制备，制备方法参照rabiesvirusexpressingdendriticcell-activatingmoleculesenhancestheinnateandadaptiveimmuneresponsetovaccination，yongjunwen等,journalofvirology,2011。
实施例1
一种表达细粒棘球蚴eg95蛋白的重组狂犬病病毒的构建方法，步骤如下：
(1)根据genbank中细粒棘球蚴eg95基因(genbank:ky661711.1)的orf核酸序列，全长471bp，进行人工密码子优化，人工优化的细粒棘球蚴eg95基因的核苷酸序列如seqidno.1所示；在人工优化的细粒棘球蚴eg95基因的两端分别添加pfl23ⅱ、nheⅰ酶切位点，为下一步酶切与载体连接作准备，交由南京金斯瑞公司合成；
(2)用pfl23ⅱ和nheⅰ双酶切步骤(1)人工优化的细粒棘球蚴eg95基因和psad质粒，双酶切的反应体系为：10×缓冲液5μl，psad质粒/人工优化的细粒棘球蚴eg95基因4μg，pfl23ⅱ和nheⅰ内切酶各2.5μl，补加ddh2o至100μl；37℃双酶切反应120min；将双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，切胶回收目的片段和质粒载体，按照t4连接酶说明书(neb公司)进行连接，连接的反应体系为：10×缓冲液2μl，切胶回收的目的片段100μg，切胶回收的质粒载体40μg，t4连接酶1.5μl，补加ddh2o至20μl；16℃连接12h，然后4℃连接24h；连接后将连接产物转化top10感受态细胞，提取质粒，鉴定得重组质粒psad-eg95，-20℃冻存备用；
(3)将步骤(2)的重组质粒psad-eg95与辅助质粒psad-n、psad-p、psad-l、psad-g按照lipofectamine2000说明书(invitrogen公司)共同转染bhk-21细胞：将bhk-21细胞铺板于6孔板，10％fbs的dmem培养基培养12-16h，转染时细胞密度为80-90％，重组质粒psad-eg95的用量为2.0μg，辅助质粒的用量为psad-n0.5μg、psad-p0.25μg、psad-l0.1μg、psad-g0.15μg；转染后将细胞放在37℃、5％co2培养箱中继续培养4-5天，收获上清，即得表达细粒棘球蚴eg95蛋白的重组狂犬病病毒，所述重组狂犬病病毒的基因组核苷酸序列如seqidno.2所示。
其中，步骤(2)中所述鉴定的方法为：对提取到的质粒进行pfl23ⅱ和nheⅰ双酶切，双酶切的反应体系和反应条件与步骤(2)中双酶切的反应体系和反应条件相同，琼脂糖凝胶电泳验证目的条带，结果如图1所示，双酶切质粒中含有长度约为471bp的条带，与细粒棘球蚴eg95基因的长度相同，说明该质粒中成功插入细粒棘球蚴eg95基因，即为重组质粒psad-eg95。
实施例2：重组狂犬病病毒的pcr验证与ifa鉴定
取狂犬病病毒sad株和实施例1制备的重组狂犬病病毒分别感染bhk-21细胞，按照rneasyminikit试剂盒说明书提取上述感染不同病毒的bhk-21细胞的总rna，反转录得cdna，以该cdna为模板进行pcr扩增，得到狂犬病病毒g基因和l基因之间的eg95基因，琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图2所示，重组狂犬病病毒组得到目的条带，约为800bp，狂犬病病毒sad株组仅扩增出假基因区约为750bp，说明重组狂犬病病毒成功插入细粒棘球蚴eg95基因。
将96孔板铺单层bhk-21细胞，并分为三个区域，第一区域接种狂犬病病毒sad株病毒液，第二区域接种实施例1制备的重组狂犬病病毒液，第三区域接种含10％fbs的dmem培养基作为空白对照，37℃、5％co2孵箱培养96h后，弃上清，加丙酮固定。将96孔板三个区域分别加入兔源rabv多抗(1:400稀释)，和鼠源eg95蛋白多抗(1：400稀释)，每种情况设8个复孔，37℃孵箱培养1h后，pbs缓冲液洗3次；eg95蛋白抗体孔再加入埃文思蓝染色液和alexafluor488荧光染料标记的山羊抗鼠二抗(1:800稀释，proteintechgroup公司)，37℃孵育1小时，pbs缓冲液洗3次。
将上述96孔板置于荧光显微镜下观察，结果如图3所示，以兔源rabv多抗进行ifa检测(免疫荧光法检测)，重组狂犬病病毒组和狂犬病病毒sad株组均观察有大量荧光灶，空白对照组无荧光灶；以鼠源eg95蛋白多抗进行ifa检测，重组狂犬病病毒组观察有大量荧光灶，狂犬病病毒sad株组与空白对照组则无荧光灶，上述结果表明重组狂犬病病毒拯救成功，能表达狂犬病病毒的同时，还可以表达外源细粒棘球蚴eg95蛋白。
实施例3：复制动力学测定
按照0.1moi将实施例1制备的重组狂犬病病毒和狂犬病病毒sad株分别感染单层na细胞和bhk-21细胞，分别于感染后24h、48h、72h、96h取400μl细胞上清液，-80℃冰箱冻存。取样完成后，统一用bhk-21细胞测其病毒滴度。将不同时间段的样品，分别用2％fbsdmem培养基做10倍系列稀释，取100μl加入96孔板单层bhk-21细胞，每个稀释度做3个重复，37℃、5％co2孵箱培养48小时后，加入80％丙酮固定，加入fitc标记的rabvn蛋白抗体染色。荧光显微镜下观察荧光结果，绘制病毒复制动力曲线，结果如图4所示。
结果表明，重组狂犬病病毒与狂犬病病毒sad株在两种细胞上生长特性相似，24h时已开始复制，72h达到滴度最大值，与亲本狂犬病病毒sad株的生长滴度相近。在神经细胞na中，重组狂犬病病毒体现出良好的适应性和复制繁殖能力。在bhk-21细胞中，重组狂犬病病毒滴度略高于亲本狂犬病病毒sad株，说明eg95基因的插入，没有明显影响病毒的复制特性。
实施例4：动物免疫和血清中和抗体
取18只spf级balb/c小鼠(6-8周龄，雌性)，随机分为3组，除空白组不做处理外，其余两组分别免疫狂犬病病毒sad株及实施例1制备的重组狂犬病病毒，免疫量体积均为100μl，病毒含量为1×106.5tcid50。重组狂犬病病毒免疫小鼠后，小鼠无任何明显发病症状，与亲本狂犬病病毒sad株一致，表明该重组狂犬病病毒安全性高。4周后将小鼠眼球取血，分离血清，分别检测狂犬病病毒中和抗体以及eg95特异性抗体。
favn法检测狂犬病病毒中和抗体滴度：在96孔板将待测灭活血清和标准阳性血清(0.5iu/ml)50μl分别加到100μl2％fbsdmem培养基中做3倍系列稀释，每个稀释度做4个重复，加50μl含有100tcid50的狂犬病病毒cvs-11病毒液，混合均匀，37℃、5％co2孵箱孵育中和1h，每孔加50μl浓度为4×105个/mlbhk-21细胞悬液，37℃、5％co2孵箱培养48h，加入80％丙酮于-20℃固定过夜，加入fitc标记的rabvn蛋白单抗染色，37℃孵育1h。在荧光显微镜下观察结果，应用spearman-karber公式，以标准阳性血清滴度为参照系数，计算待测血清rabv中和效价(iu/ml)。
elisa检测eg95特异性抗体水平：应用重庆澳龙生物制品有限公司羊棘球蚴(eg95)elisa抗体检测试剂盒检测血清中eg95特异性抗体水平。样品按1:50稀释后加至eg95抗原包被板，37℃温育30min，洗涤液洗板3次，每孔加入hrp-羊抗鼠二抗(1:5000)100μl，37℃温育30min后，洗板3次，每孔加入100μl底物避光显色10min，再每孔加入50μl终止液，10min内置于酶标仪测定od450，按照说明书进行结果判定。
狂犬病病毒中和抗体以及细粒棘球蚴eg95特异性抗体的检测结果如图5所示，重组狂犬病病毒和亲本狂犬病病毒sad株接种的小鼠血清内均能检测到抗狂犬病病毒中和抗体(图5a)，重组狂犬病病毒组小鼠血清狂犬病病毒中和抗体滴度略高于狂犬病病毒sad株组小鼠，两组小鼠狂犬病病毒中和抗体滴度均高于0.5iu/ml，高于who对狂犬病疫苗的标准。重组狂犬病病毒组的小鼠血清检测到细粒棘球蚴eg95特异性抗体，按照elisa检测试剂盒结果判定标准，实验结果同时满足标准阳性对照孔平均od450≥0.6，标准阴性对照孔平均od450≤0.3，方为有效。此时若样品od450≤0.3，认为抗体阴性，对细粒棘球蚴感染无保护力；若样品od450介于0.3-0.6之间，则认为抗体水平低，对其感染有一定保护力；若样品od450≥0.6，认为抗体水平较高，在攻毒试验中可提供高于90％的抵抗力。结果显示(图5b)，空白组与亲本狂犬病病毒sad株组的od450均小于0.3，对细粒棘球蚴感染无保护力，而重组狂犬病病毒组od450大于0.6，表明其eg95特异性抗体水平较高，可对细粒棘球蚴感染提供有效的保护力。
以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应包含在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。
sequencelisting
<110>山东大学
<120>一种表达细粒棘球蚴eg95蛋白的重组狂犬病病毒及其构建方法与应用
<160>2
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>471
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
atggctttccagctgtgcctgatcctgttcgctacctctgttctggctcaggaatacaaa60
ggtatgggtgttgaaacccgtaccaccgaaaccccgctgcgtaaacacttcaacctgacc120
ccggttggttctcagggtatccgtctgtcttgggaagttcagcacctgtctgacctgaaa180
ggtaccgacatctctctgaaagctgttaacccgtctgacccgctggtttacaaacgtcag240
accgctaaattctctgacggtcagctgaccatcggtgaactgaaaccgtctaccctgtac300
aaaatgaccgttgaagctgttaaagctaaaaaaaccatcctgggtttcaccgttgacatc360
gaaaccccgcgtgctggtaaaaaagaatctaccgttatgacctctggttctgctctgacc420
tctgctatcgctggtttcgttttctcttgcatcgttgttgttctgacctaa471
<210>2
<211>12041
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
acgcttaacaaccagatcaaagaaaaaacagacattgtcaattgcaaagcaaaaatgtaa60
cacccctacaatggatgccgacaagattgtattcaaagtcaataatcaggtggtctcttt120
gaagcctgagattatcgtggatcaatatgagtacaagtaccctgccatcaaagatttgaa180
aaagccctgtataaccctaggaaaggctcccgatttaaataaagcatacaagtcagtttt240
gtcaggcatgagcgccgccaaacttaatcctgacgatgtatgttcctatttggcagcggc300
aatgcagttttttgaggggacatgtccggaagactggaccagctatggaattgtgattgc360
acgaaaaggagataagatcaccccaggttctctggtggagataaaacgtactgatgtaga420
agggaattgggctctgacaggaggcatggaactgacaagagaccccactgtccctgagca480
tgcgtccttagtcggtcttctcttgagtctgtataggttgagcaaaatatccgggcaaaa540
cactggtaactataagacaaacattgcagacaggatagagcagatttttgagacagcccc600
ttttgttaaaatcgtggaacaccatactctaatgacaactcacaaaatgtgtgctaattg660
gagtactataccaaacttcagatttttggccggaacctatgacatgtttttctcccggat720
tgagcatctatattcagcaatcagagtgggcacagttgtcactgcttatgaagactgttc780
aggactggtatcatttactgggttcataaaacaaatcaatctcaccgctagagaggcaat840
actatatttcttccacaagaactttgaggaagagataagaagaatgtttgagccagggca900
ggagacagctgttcctcactcttatttcatccacttccgttcactaggcttgagtgggaa960
atctccttattcatcaaatgctgttggtcacgtgttcaatctcattcactttgtaggatg1020
ctatatgggtcaagtcagatccctaaatgcaacggttattgctgcatgtgctcctcatga1080
aatgtctgttctagggggctatctgggagaggaattcttcgggaaagggacatttgaaag1140
aagattcttcagagatgagaaagaacttcaagaatacgaggcggctgaactgacaaagac1200
tgacgtagcactggcagatgatggaactgtcaactctgacgacgaggactacttttcagg1260
tgaaaccagaagtccggaggctgtttatactcgaatcatgatgaatggaggtcgactaaa1320
gagatctcacatacggagatatgtctcagtcagttccaatcatcaagcccgtccaaactc1380
attcgccgagtttctaaacaagacatattcgagtgactcataagaagttgaataacaaaa1440
tgccggaaatctacggattgtgtatatccatcatgaaaaaaactaacacccctcctttcg1500
aaccatcccaaacatgagcaagatctttgtcaatcctagtgctattagagccggtctggc1560
cgatcttgagatggctgaagaaactgttgatctgatcaatagaaatatcgaagacaatca1620
ggctcatctccaaggggaacccatagaggtggacaatctccctgaggatatggggcgact1680
tcacctggatgatggaaaatcgcccaaccatggtgagatagccaaggtgggagaaggcaa1740
gtatcgagaggactttcagatggatgaaggagaggatcctagcttcctgttccagtcata1800
cctggaaaatgttggagtccaaatagtcagacaaatgaggtcaggagagagatttctcaa1860
gatatggtcacagaccgtagaagagattatatcctatgtcgcggtcaactttcccaaccc1920
tccaggaaagtcttcagaggataaatcaacccagactactggccgagagctcaagaagga1980
gacaacacccactccttctcagagagaaagccaatcatcgaaagccaggatggcggctca2040
aattgcttctggccctccagcccttgaatggtcggctaccaatgaagaggatgatctatc2100
agtggaggctgagatcgctcaccagattgcagaaagtttctccaaaaaatataagtttcc2160
ctctcgatcctcagggatactcttgtataattttgagcaattgaaaatgaaccttgatga2220
tatagttaaagaggcaaaaaatgtaccaggtgtgacccgtttagcccatgacgggtccaa2280
actccccctaagatgtgtactgggatgggtcgctttggccaactctaagaaattccagtt2340
gttagtcgaatccgacaagctgagtaaaatcatgcaagatgacttgaatcgctatacatc2400
ttgctaaccgaacctctcccctcagtccctctagacaataaaatccgagatgtcccaaag2460
tcaacatgaaaaaaacaggcaacaccactgataaaatgaacctcctacgtaagatagtga2520
aaaaccgcagggacgaggacactcaaaaatcctctcccgcgtcagcccctctggatgacg2580
atgacttgtggcttccaccccctgaatacgtcccgctgaaagaacttacaggcaagaaga2640
acatgaggaacttttgtatcaacggaagggttaaagtgtgtagcccgaatggttactcgt2700
tcaggatcctgcggcacattctgaaatcattcgacgagatatattctgggaatcatagga2760
tgatcgggttagtcaaagtggttattggactggctttgtcaggatctccagtccctgagg2820
gcctgaactgggtatacaaattgaggagaacctttatcttccagtgggctgattccaggg2880
gccctcttgaaggggaggagttggaatactctcaggagatcacttgggatgatgatactg2940
agttcgtcggattgcaaataagagtgattgcaaaacagtgtcatatccagggcagagtct3000
ggtgtatcaacatgaacccgagagcatgtcaactatggtctgacatgtctcttcagacac3060
aaaggtccgaagaggacaaagattcctctctgcttctagaataatcagattatatcccgc3120
aaatttatcacttgtttacctctggaggagagaacatatgggctcaactccaacccttgg3180
gagcaatataacaaaaaacatgttatggtgccattaaaccgctgcatttcatcaaagtca3240
agttgattacctttacattttgatcctcttggatgtgaaaaaaactattaacatccctca3300
aaagactcaaggaaagatggttcctcaggctctcctgtttgtaccccttctggtttttcc3360
attgtgttttgggaaattccctatttacacgataccagacaagcttggtccctggagtcc3420
gattgacatacatcacctcagctgcccaaacaatttggtagtggaggacgaaggatgcac3480
caacctgtcagggttctcctacatggaacttaaagttggatacatcttagccataaaagt3540
gaacgggttcacttgcacaggcgttgtgacggaggctgaaacctacactaacttcgttgg3600
ttatgtcacaaccacgttcaaaagaaagcatttccgcccaacaccagatgcatgtagagc3660
cgcgtacaactggaagatggccggtgaccccagatatgaagagtctctacacaatccgta3720
ccctgactaccgctggcttcgaactgtaaaaaccaccaaggagtctctcgttatcatatc3780
tccaagtgtggcagatttggacccatatgacagatcccttcactcgagggtcttccctag3840
cgggaagtgctcaggagtagcggtgtcttctacctactgctccactaaccacgattacac3900
catttggatgcccgagaatccgagactagggatgtcttgtgacatttttaccaatagtag3960
agggaagagagcatccaaagggagtgagacttgcggctttgtagatgaaagaggcctata4020
taagtctttaaaaggagcatgcaaactcaagttatgtggagttctaggacttagacttat4080
ggatggaacatgggtctcgatgcaaacatcaaatgaaaccaaatggtgccctcccgataa4140
gttggtgaacctgcacgactttcgctcagacgaaattgagcaccttgttgtagaggagtt4200
ggtcaggaagagagaggagtgtctggatgcactagagtccatcatgacaaccaagtcagt4260
gagtttcagacgtctcagtcatttaagaaaacttgtccctgggtttggaaaagcatatac4320
catattcaacaagaccttgatggaagccgatgctcactacaagtcagtcagaacttggaa4380
tgagatcctcccttcaaaagggtgtttaagagttggggggaggtgtcatcctcatgtgaa4440
cggggtgtttttcaatggtataatattaggacctgacggcaatgtcttaatcccagagat4500
gcaatcatccctcctccagcaacatatggagttgttggaatcctcggttatcccccttgt4560
gcaccccctggcagacccgtctaccgttttcaaggacggtgacgaggctgaggattttgt4620
tgaagttcaccttcccgatgtgcacaatcaggtctcaggagttgacttgggtctcccgaa4680
ctgggggaagtatgtattactgagtgcaggggccctgactgccttgatgttgataatttt4740
cctgatgacatgttgtagaagagtcaatcgatcagaacctacgcaacacaatctcagagg4800
gacagggagggaggtgtcagtcactccccaaagcgggaagatcatatcttcatgggaatc4860
acacaagagtgggggtgagaccagactgtaaggactggccgtcctttcaacgatccaagt4920
ccatgaaaaaaactaacacccctcccgtacgatggctttccagctgtgcctgatcctgtt4980
cgctacctctgttctggctcaggaatacaaaggtatgggtgttgaaacccgtaccaccga5040
aaccccgctgcgtaaacacttcaacctgaccccggttggttctcagggtatccgtctgtc5100
ttgggaagttcagcacctgtctgacctgaaaggtaccgacatctctctgaaagctgttaa5160
cccgtctgacccgctggtttacaaacgtcagaccgctaaattctctgacggtcagctgac5220
catcggtgaactgaaaccgtctaccctgtacaaaatgaccgttgaagctgttaaagctaa5280
aaaaaccatcctgggtttcaccgttgacatcgaaaccccgcgtgctggtaaaaaagaatc5340
taccgttatgacctctggttctgctctgacctctgctatcgctggtttcgttttctcttg5400
catcgttgttgttctgacctaagctagcttataaagtgctgggtcatctaagcttttcag5460
tcgagaaaaaaacattagatcagaagaacaactggcaacacttctcaacctgagacttac5520
ttcaagatgctcgatcctggagaggtctatgatgaccctattgacccaatcgagttagag5580
gctgaacccagaggaacccccattgtccccaacatcttgaggaactctgactacaatctc5640
aactctcctttgatagaagatcctgctagactaatgttagaatggttaaaaacagggaat5700
agaccttatcggatgactctaacagacaattgctccaggtctttcagagttttgaaagat5760
tatttcaagaaggtagatttgggttctctcaaggtgggcggaatggctgcacagtcaatg5820
atttctctctggttatatggtgcccactctgaatccaacaggagccggagatgtataaca5880
gacttggcccatttctattccaagtcgtcccccatagagaagctgttgaatctcacgcta5940
ggaaatagagggctgagaatccccccagagggagtgttaagttgccttgagagggttgat6000
tatgataatgcatttggaaggtatcttgccaacacgtattcctcttacttgttcttccat6060
gtaatcaccttatacatgaacgccctagactgggatgaagaaaagaccatcctagcatta6120
tggaaagatttaacctcagtggacatcgggaaggacttggtaaagttcaaagaccaaata6180
tggggactgctgatcgtgacaaaggactttgtttactcccaaagttccaattgtcttttt6240
gacagaaactacacacttatgctaaaagatcttttcttgtctcgcttcaactccttaatg6300
gtcttgctctctcccccagagccccgatactcagatgacttgatatctcaactatgccag6360
ctgtacattgctggggatcaagtcttgtctatgtgtggaaactccggctatgaagtcatc6420
aaaatattggagccatatgtcgtgaatagtttagtccagagagcagaaaagtttaggcct6480
ctcattcattccttgggagactttcctgtatttataaaagacaaggtaagtcaacttgaa6540
gagacgttcggtccctgtgcaagaaggttctttagggctctggatcaattcgacaacata6600
catgacttggtttttgtgtttggctgttacaggcattgggggcacccatatatagattat6660
cgaaagggtctgtcaaaactatatgatcaggttcaccttaaaaaaatgatagataagtcc6720
taccaggagtgcttagcaagcgacctagccaggaggatccttagatggggttttgataag6780
tactccaagtggtatctggattcaagattcctagcccgagaccaccccttgactccttat6840
atcaaaacccaaacatggccacccaaacatattgtagacttggtgggggatacatggcac6900
aagctcccgatcacgcagatctttgagattcctgaatcaatggatccgtcagaaatattg6960
gatgacaaatcacattctttcaccagaacgagactagcttcttggctgtcagaaaaccga7020
ggggggcctgttcctagcgaaaaagttattatcacggccctgtctaagccgcctgtcaat7080
ccccgagagtttctgaggtctatagacctcggaggattgccagatgaagacttgataatt7140
ggcctcaagccaaaggaacgggaattgaagattgaaggtcgattctttgctctaatgtca7200
tggaatctaagattgtattttgtcatcactgaaaaactcttggccaactacatcttgcca7260
ctttttgacgcgctgactatgacagacaacctgaacaaggtgtttaaaaagctgatcgac7320
agggtcaccgggcaagggcttttggactattcaagggtcacatatgcatttcacctggac7380
tatgaaaagtggaacaaccatcaaagattagagtcaacagaggatgtattttctgtccta7440
gatcaagtgtttggattgaagagagtgttttctagaacacacgagttttttcaaaaggcc7500
tggatctattattcagacagatcagacctcatcgggttacgggaggatcaaatatactgc7560
ttagatgcgtccaacggcccaacctgttggaatggccaggatggcgggctagaaggctta7620
cggcagaagggctggagtctagtcagcttattgatgatagatagagaatctcaaatcagg7680
aacacaagaaccaaaatactagctcaaggagacaaccaggttttatgtccgacatacatg7740
ttgtcgccagggctatctcaagaggggctcctctatgaattggagagaatatcaaggaat7800
gcactttcgatatacagagccgtcgaggaaggggcatctaagctagggctgatcatcaag7860
aaagaagagaccatgtgtagttatgacttcctcatctatggaaaaacccctttgtttaga7920
ggtaacatattggtgcctgagtccaaaagatgggccagagtctcttgcgtctctaatgac7980
caaatagtcaacctcgccaatataatgtcgacagtgtccaccaatgcgctaacagtggca8040
caacactctcaatctttgatcaaaccgatgagggattttctgctcatgtcagtacaggca8100
gtctttcactacctgctatttagcccaatcttaaagggaagagtttacaagattctgagc8160
gctgaaggggagagctttctcctagccatgtcaaggataatctatctagatccttctttg8220
ggagggatatctggaatgtccctcggaagattccatatacgacagttctcagaccctgtc8280
tctgaagggttatccttctggagagagatctggttaagctcccaagagtcctggattcac8340
gcgttgtgtcaagaggctggaaacccagatcttggagagagaacactcgagagcttcact8400
cgccttctagaagatccgaccaccttaaatatcagaggaggggccagtcctaccattcta8460
ctcaaggatgcaatcagaaaggctttatatgacgaggtggacaaggtggaaaattcagag8520
tttcgagaggcaatcctgttgtccaagacccatagagataattttatactcttcttaata8580
tctgttgagcctctgtttcctcgatttctcagtgagctattcagttcgtcttttttggga8640
atccccgagtcaatcattggattgatacaaaactcccgaacgataagaaggcagtttaga8700
aagagtctctcaaaaactttagaagaatccttctacaactcagagatccacgggattagt8760
cggatgacccagacacctcagagggttgggggggtgtggccttgctcttcagagagggca8820
gatctacttagggagatctcttggggaagaaaagtggtaggcacgacagttcctcaccct8880
tctgagatgttgggattacttcccaagtcctctatttcttgcacttgtggagcaacagga8940
ggaggcaatcctagagtttctgtatcagtactcccgtcctttgatcagtcatttttttca9000
cgaggccccctaaagggatacttgggctcgtccacctctatgtcgacccagctattccat9060
gcatgggaaaaagtcactaatgttcatgtggtgaagagagctctatcgttaaaagaatct9120
ataaactggttcattactagagattccaacttggctcaagctctaattaggaacattatg9180
tctctgacaggccctgatttccctctagaggaggcccctgtcttcaaaaggacggggtca9240
gccttgcataggttcaagtctgccagatacagcgaaggagggtattcttctgtctgcccg9300
aacctcctctctcatatttctgttagtacagacaccatgtctgatttgacccaagacggg9360
aagaactacgatttcatgttccagccattgatgctttatgcacagacatggacatcagag9420
ctggtacagagagacacaaggctaagagactctacgtttcattggcacctccgatgcaac9480
aggtgtgtgagacccattgacgacgtgaccctggagacctctcagatcttcgagtttccg9540
gatgtgtcgaaaagaatatccagaatggtttctggggctgtgcctcacttccagaggctt9600
cccgatatccgtctgagaccaggagattttgaatctctaagcggtagagaaaagtctcac9660
catatcggatcagctcaggggctcttatactcaatcttagtggcaattcacgactcagga9720
tacaatgatggaaccatcttccctgtcaacatatacggcaaggtttcccctagagactat9780
ttgagagggctcgcaaggggagtattgataggatcctcgatttgcttcttgacaagaatg9840
acaaatatcaatattaatagacctcttgaattggtctcaggggtaatctcatatattctc9900
ctgaggctagataaccatccctccttgtacataatgctcagagaaccgtctcttagagga9960
gagatattttctatccctcagaaaatccccgccgcttatccaaccactatgaaagaaggc10020
aacagatcaatcttgtgttatctccaacatgtgctacgctatgagcgagagataatcacg10080
gcgtctccagagaatgactggctatggatcttttcagactttagaagtgccaaaatgacg10140
tacctatccctcattacttaccagtctcatcttctactccagagggttgagagaaaccta10200
tctaagagtatgagagataacctgcgacaattgagttctttgatgaggcaggtgctgggc10260
gggcacggagaagataccttagagtcagacgacaacattcaacgactgctaaaagactct10320
ttacgaaggacaagatgggtggatcaagaggtgcgccatgcagctagaaccatgactgga10380
gattacagccccaacaagaaggtgtcccgtaaggtaggatgttcagaatgggtctgctct10440
gctcaacaggttgcagtctctacctcagcaaacccggcccctgtctcggagcttgacata10500
agggccctctctaagaggttccagaaccctttgatctcgggcttgagagtggttcagtgg10560
gcaaccggtgctcattataagcttaagcctattctagatgatctcaatgttttcccatct10620
ctctgccttgtagttggggacgggtcaggggggatatcaagggcagtcctcaacatgttt10680
ccagatgccaagcttgtgttcaacagtcttttagaggtgaatgacctgatggcttccgga10740
acacatccactgcctccttcagcaatcatgaggggaggaaatgatatcgtctccagagtg10800
atagatcttgactcaatctgggaaaaaccgtccgacttgagaaacttggcaacctggaaa10860
tacttccagtcagtccaaaagcaggtcaacatgtcctatgacctcattatttgcgatgca10920
gaagttactgacattgcatctatcaaccggatcaccctgttaatgtccgattttgcattg10980
tctatagatggaccactctatttggtcttcaaaacttatgggactatgctagtaaatcca11040
aactacaaggctattcaacacctgtcaagagcgttcccctcggtcacagggtttatcacc11100
caagtaacttcgtctttttcatctgagctctacctccgattctccaaacgagggaagttt11160
ttcagagatgctgagtacttgacctcttccacccttcgagaaatgagccttgtgttattc11220
aattgtagcagccccaagagtgagatgcagagagctcgttccttgaactatcaggatctt11280
gtgagaggatttcctgaagaaatcatatcaaatccttacaatgagatgatcataactctg11340
attgacagtgatgtagaatcttttctagtccacaagatggttgatgatcttgagttacag11400
aggggaactctgtctaaagtggctatcattatagccatcatgatagttttctccaacaga11460
gtcttcaacgtttccaaacccctaactgacccctcgttctatccaccgtctgatcccaaa11520
atcctgaggcacttcaacatatgttgcagtactatgatgtatctatctactgctttaggt11580
gacgtccctagcttcgcaagacttcacgacctgtataacagacctataacttattacttc11640
agaaagcaagtcattcgagggaacgtttatctatcttggagttggtccaacgacacctca11700
gtgttcaaaagggtagcctgtaattctagcctgagtctgtcatctcactggatcaggttg11760
atttacaagatagtgaagactaccagactcgttggcagcatcaaggatctatccagagaa11820
gtggaaagacaccttcataggtacaacaggtggatcaccctagaggatatcagatctaga11880
tcatccctactagactacagttgcctgtgaaccggatactcctggaagcctgcccatgct11940
aagactcttgtgtgatgtatcttgaaaaaaacaagatcctaaatctgaacctttggttgt12000
ttgattgtttttctcatttttgttgtttatttgttaagcgt12041
1.一种表达细粒棘球蚴eg95蛋白的重组狂犬病病毒，其特征在于，所述重组狂犬病病毒为在狂犬病病毒基因组的假基因区插入人工优化的细粒棘球蚴eg95基因，并经转染后制备得到，所述人工优化的细粒棘球蚴eg95基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述重组狂犬病病毒的基因组核苷酸序列如seqidno.2所示。
2.权利要求1所述的表达细粒棘球蚴eg95蛋白的重组狂犬病病毒的构建方法，其特征在于，步骤如下：
(1)在人工优化的细粒棘球蚴eg95基因的两端分别添加pfl23ⅱ、nheⅰ酶切位点，双酶切后插入至psad质粒，得重组质粒psad-eg95；所述人工优化的细粒棘球蚴eg95基因的核苷酸序列如seqidno.1所示；
(2)将步骤(1)的重组质粒psad-eg95与辅助质粒共同转染bhk-21细胞，经培养收获上清，即得表达细粒棘球蚴eg95蛋白的重组狂犬病病毒，所述重组狂犬病病毒的基因组核苷酸序列如seqidno.2所示。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述转染的步骤为：将bhk-21细胞铺板于6孔板，10％fbs的dmem培养基培养12-16h，转染时细胞密度为80-90％，重组质粒psad-eg95的用量为2.0μg。
4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述辅助质粒为psad-n、psad-p、psad-l和psad-g，所述辅助质粒的用量为：psad-n0.5μg、psad-p0.25μg、psad-l0.1μg、psad-g0.15μg。
5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述培养为：将转染后的bhk-21细胞置于37℃、5％co2培养箱中培养4-5天。
6.权利要求1所述的表达细粒棘球蚴eg95蛋白的重组狂犬病病毒在制备预防狂犬病和囊型包虫病的二联疫苗中的应用。
技术总结