本发明涉及农副产品回收利用领域，尤其涉及一种针叶樱桃渣回收提取sod的方法。
背景技术：
针叶樱桃(malpighiaemarginatad.c.)是金虎尾科金虎尾属凹缘金虎尾的果实，其富含有多种维生素和矿物质成分。尤其其含有一种特有的抗衰老因子(sod)，也称之为超氧化物歧化酶，其是生物体中抗氧化酶系的重要成分。医学研究表明：sod对各种疾病均有一定的疗效，尤其在治疗类风湿关节炎、红斑狼疮和皮肌炎等方面疗效显著，在防辐射、抗衰老和抗肿瘤等方面也均有良好的表现。
大多数植物、微生物中都含有该物质，其根据金属辅基的不同，主要分为cu/zn-sod、fe-sod和mn-sod三种，大多数植物的细胞质和叶绿体中均含有cu/zn-sod，mn-sod存在于原核细胞和真核细胞的线粒体中，而fe-sod则只存在于原核细胞和极少数的植物中。
而针叶樱桃恰好含有fe-sod，其更加有利于人体吸收并且实现美容养颜的效果，因此其也常作为“美颜果实”被人所熟知，现有的市面上利用针叶樱桃制备的产品大多为果粉、药粉和饮料等，其大多采用压榨针叶樱桃果实后，以压榨所得的汁液进行制备。
但是，实际上经过压榨后被废弃的针叶樱桃渣中仍含有较多的sod成分，而现有的针叶樱桃渣无法得到有效的利用，造成了大量的浪费。
如中国专利局于2019年9月13日公开的一种针叶樱桃维生素c胶原蛋白粉及其制备方法和应用的发明专利，授权公开号为cn105558256b，其将鱼鳞清洗并加水研磨成鱼鳞浆液，然后调ph值为碱性酶解，酶解后酶灭活，过滤，滤液脱色，调ph为酸性，最后浓缩，获得鱼鳞提取液，备用；将针叶樱桃青果清洗后榨汁，过滤，滤液脱色，最后浓缩，获得针叶樱桃汁，备用；混合鱼鳞提取液和针叶樱桃汁，喷雾干燥，获得所述针叶樱桃维生素c胶原蛋白粉。在该发明专利的技术方案中，对针叶樱桃的利用也仅是简单的榨汁利用，导致原料利用率低。
技术实现要素：
为解决现有的针叶樱桃利用率低，其大多均仅通过简单的压榨后提取汁液并利用汁液制成产品，对于压榨后的针叶樱桃渣无法实现有效的利用，导致大量营养成分尤其在榨汁过程中在渣料中大量存在的sod浪费的问题，本发明提供了一种针叶樱桃渣回收提取sod的方法。
本发明的目的在于：一、对针叶樱桃渣sod进行有效的回收利用；二、确保从针叶樱桃渣中提取sod时具有较高的效率；三、确保所提取的sod具有较高的比活性，具有较高的纯度；四、提高sod的提取率，确保绝大多数的sod均能够提取得到。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种针叶樱桃渣回收提取sod的方法，包括以下步骤：
s1、取针叶樱桃渣作为原料，进行预处理和破碎后得到碎末；所述预处理包括分筛除杂质和清洗；通过分筛去除杂质，并清洗去除尘土等均为常规操作，其甚至还可包括剪除压榨时混入的枝叶等，有利于后续操作的进行；所述针叶樱桃渣为针叶樱桃压榨后的果渣；
s2、将步骤s1所述碎末和纤维素酶共置于水中，进行超声破碎，所述超声浸提的频率为10～25khz、功率为50～150w、时长为10～15min；过滤去除滤渣，得到滤液；其中，所述碎末质量与纤维素酶酶活的比例为1g：(600～1000)u，所述碎末质量与水的质量之比为1:2～1:4；
s3、利用截留分子量为50000～60000da的过滤膜对步骤s2所述滤液进行过滤，得到一级滤液和一级截留液，再利用截留分子量为10000～30000da过滤膜对所述一级滤液进行过滤，得到二级滤液和二级截留液；其中，所述滤液指通过过滤膜的液体，截留液指无法通过过滤膜的液体；
s4、将步骤s3所述一级截留液和二级滤液混合，得混合液；将所述混合液加入乙醇溶液，混合均匀后去除沉淀物，所得液体再利用截留分子量为50000～60000da的过滤膜进行0.35mpa压滤，得到压滤液，利用分子量为10000～30000da的过滤膜对所述压滤液进行过滤，得到三级截留液，将所述二级截留液和三级截留液混合，得到粗提液；所述乙醇溶液由乙醇和氯仿按体积比1：(0.4～0.6)混合而成，所述乙醇溶液和所述混合液的体积比为1：(0.5～0.25)；
s5、将步骤s4所述粗提液和丙酮按体积比1：(0.8～1.2)混合，取沉淀物，再将沉淀物溶于盐溶液中，40～45℃处理10～20min，静置2～4h，取上清液进行冷冻干燥，即可得sod粉末；所述盐溶液中磷酸二氢钠浓度为0.4～0.7g/l，磷酸氢二钠浓度为7～11g/l，余量为水。
在上述方法中，主要通过重复过滤和截留，实现最大化sod的收集，并且在该过程中能够去除如大多数植物蛋白、细胞壁、果胶和纤维素等一系列的杂质，提高所制得sod的纯度，减少杂质含量，在后续将粗提液和丙酮混合的过程中，利用丙酮析出sod沉淀，再将sod置于盐溶液中溶解，热处理并静置分离杂质，实现进一步的纯化，最后取上清液即可制得sod粉末。整体方法简洁高效，破碎、超声浸提、过滤、截留、混液以及二次纯化，最后进行干燥，整体过程中操作时长较短，并且无需通过离子交换柱等分离装置，进行吸附和洗脱，能够减少在提取过程中sod由于分离装置造成的损耗。
优选方式下，步骤s1所述破碎具体为：将针叶樱桃渣用打浆机破碎成≤2mm的碎块。
优选方式下，步骤s2所述过滤为使用160目筛。
优选方式下，步骤s4所述去除沉淀物采用200目过滤去除沉淀。
优选方式下，步骤s5所述取沉淀物的方法为：使用200目筛过滤，取沉淀；所述冷冻干燥的参数为：温度为-40℃，真空度10pa，时间为48h。
优选方式下，所述针叶樱桃渣回收提取sod的方法，包括步骤：
s1、取1kg的针叶樱桃渣作为原料，进行分筛去除杂质、清洗针叶樱桃渣并对其用打浆机破碎成≤2mm的碎块，得到碎末；
s2、将步骤s1所述碎末和纤维素酶以质量比1g:600u的比例加入至所述碎末2倍质量的水中，使得水完全没过碎末，进行频率为20khz、功率为100w的超声破碎10min，使用160目筛网过滤去除滤渣，得到滤液；
s3、利用截留分子量为50000da的过滤膜对步骤s2所述滤液进行过滤，得到一级滤液和一级截留液，再利用截留分子量为30000da的过滤膜对所述一级滤液进行过滤，得到二级滤液和二级截留液；
s4、将步骤s3所述一级截留液和二级滤液混合得混合液，将所述混合液加入乙醇溶液，混合均匀后采用200目筛过滤去除沉淀物，所得溶液再利用截留分子量为50000da过滤膜进行0.35mpa压滤，得到压滤液；利用截留分子量为30000da的过滤膜对所述压滤液进行过滤，得到三级截留液，将所述二级截留液和三级截留液混合，得到粗提液；其中，所述乙醇溶液由无水乙醇和氯仿按体积比：13:7混合而成；所述乙醇溶液和所述混合液的体积比为1:0.5；
s5、将步骤s3所述粗提液和丙酮以体积比1:1的比例混合，使用200目筛网过滤出沉淀物，再将所述沉淀物溶于盐溶液中，45℃条件下低温热处理15min，静置3h，取上清液在温度为-40℃、真空度10pa、冷冻干燥48h，即可得sod粉末；其中，所述盐溶液中磷酸二氢钠浓度为0.4g/l，磷酸氢二钠浓度为7g/l，余量为水。
本发明的有益效果是：
1)能够实现高效快速的回收提取针叶樱桃渣中的sod；
2)方法简洁高效，对设备需求低；
3)sod的提取率高，提取所得的sod粉末得率更高，其含有的超氧化物歧化酶具有较高的比活性。
附图说明
图1为本发明实施例和对比例制备sod粉末得率的对比图；
图2为本发明实施例和对比例制备sod粉末酶活性的对比图。
具体实施方式
以下结合具体实施例和说明书附图对本发明作出进一步清楚详细的描述说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例所用原料均为市售或本领域技术人员可获得的原料；如无特殊说明，本发明实施例所用方法均为本领域技术人员所掌握的方法。
一种针叶樱桃渣回收提取sod的方法，
所述方法包括以下步骤：
1)取针叶樱桃渣作为原料，进行预处理和破碎后得到碎末；
2)将碎末和酶共置于水中，进行超声破碎，过滤去除滤渣，得到滤液；
3)利用过滤膜对滤液进行过滤，得到一级滤液和一级截留液，再利用过滤膜对一级滤液进行过滤，得到二级滤液和二级截留液；
4)将一级截留液和二级滤液混合并加入乙醇溶液，混合均匀后去除沉淀物，再利用过滤膜进行压滤，得到压滤液，利用过滤膜对压滤液进行过滤，得到截留液，将二级滤液和截留液混合，得到粗提液；
5)将粗提液和丙酮混合，过滤出沉淀物，再将沉淀物溶于盐溶液中，低温热处理后静置，取上清液进行冷冻干燥，即可得sod粉末。
在上述方法中，主要通过重复过滤和截留，实现最大化sod的收集，并且在该过程中能够去除如大多数植物蛋白、细胞壁、果胶和纤维素等一系列的杂质，提高所制得sod的纯度，减少杂质含量，在后续将粗提液和丙酮混合的过程中，利用丙酮析出sod沉淀，再将sod置于盐溶液中溶解，热处理并静置分离杂质，实现进一步的纯化，最后取上清液即可制得sod粉末。整体方法简洁高效，破碎、超声浸提、过滤、截留、混液以及二次纯化，最后进行干燥，整体过程中操作时长较短，并且无需通过离子交换柱等分离装置，进行吸附和洗脱，能够减少在提取过程中sod由于分离装置造成的损耗。
作为优选，
步骤1)所述预处理包括分筛和清洗；
步骤1)所述破碎后得到的碎末粒径≤2mm。
通过分筛去除杂质，并清洗去除尘土等均为常规操作，其甚至还可包括剪除压榨时混入的枝叶等，有利于后续操作的进行；通过常规的破碎方法将针叶樱桃渣破碎为粒径≤2mm的碎末，有利于后续的超声浸提过程进行，提高浸提效率。
作为优选，
步骤2)所述酶为纤维素酶。
酶的加入主要是用以植物细胞的破壁，在压榨过程中大量植物细胞的细胞壁仍保持完整，这也是针叶樱桃渣中残余较大量sod的主要原因之一，因此若要实现sod的高效提取，便首先要进行破壁。破壁常用的有物理法和酶解法等，物理法的破壁效率通常较低、并且无法保障其破壁效果，而酶解法容易引入小分子的杂质难以去除，因此本发明结合物理法和酶解法同时进行，在利用纤维素酶对细胞壁进行一定程度的减薄，再以超声进行进一步的破壁，该种破壁方式能够确保破壁程度高，实现最大程度地提取sod，又可以避免细胞壁过度破碎引入难以分离的杂质，并且细胞壁的两大主要成分，果胶和纤维素，若选用果胶酶进行辅助酶解破壁的话，果胶酶的分子量与fe-sod的分子量十分接近，也容易引入难去除的杂质，但选用纤维素酶则容易分离，剩余的果胶成分也非常容易通过沉淀的方式进行分离。
作为优选，
步骤2)所述超声破碎频率为10～25khz；
步骤2)所述超声破碎功率为50～150w；
步骤2)所述超声破碎时间为10～15min。
采用上述条件的超声进行浸提，能够确保细胞壁的破碎、sod的提取溶解，又能够避免超声强度过大或时间过长导致sod的分解或被破坏。
作为优选，
步骤3)和步骤4)所述过滤膜的截留分子量为50000～60000；
步骤3)和步骤4)所述过滤膜的截留分子量为10000～30000。
针叶樱桃中sod的分子量在40000左右，因此选用上述的过滤膜能够实现最佳的过滤和截留效果。
作为优选，
步骤4)所述乙醇溶液由乙醇和氯仿按体积比1：(0.4～0.6)混合而成。
通过乙醇和氯仿混合溶液能够更好地分离出不溶的果胶杂质，提高产品纯度。
作为优选，
步骤5)所述粗提液与丙酮以体积比1：(0.8～1.2)的比例混合；
步骤5)所述盐溶液中含有0.4～0.7g/l磷酸二氢钠和7～11g/l磷酸氢二钠。
粗提液与丙酮混合后能够析出sod沉淀，再进一步利用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶液配合使其溶解，提高sod的纯度。
作为优选，
步骤5)所述低温热处理为在40～45℃条件下处理10～20min。
该低温热处理条件能够进一步使得部分杂质蛋白质或酶变性，与磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠析出沉淀，提高sod纯度。
如无特殊说明，下述针叶樱桃渣的制备方法为：
实施例1
一种针叶樱桃渣回收提取sod的方法，步骤如下：
s1、取1kg的针叶樱桃渣作为原料，进行分筛去除杂质、清洗针叶樱桃渣并对其用打浆机破碎成≤2mm的碎块，得到碎末；
s2、将步骤s1所述碎末和纤维素酶以质量比1g:600u的比例加入至所述碎末2倍质量的水中，使得水完全没过碎末，进行频率为20khz、功率为100w的超声破碎10min，使用160目筛网过滤去除滤渣，得到滤液；
s3、利用截留分子量为50000da的过滤膜对步骤s2所述滤液进行过滤，得到一级滤液和一级截留液，再利用截留分子量为30000da的过滤膜对所述一级滤液进行过滤，得到二级滤液和二级截留液；
s4、将步骤s3所述一级截留液和二级滤液混合得混合液，将所述混合液加入乙醇溶液，混合均匀后采用200目筛过滤去除沉淀物，所得溶液再利用截留分子量为50000da过滤膜进行0.35mpa压滤，得到压滤液；利用截留分子量为30000da的过滤膜对所述压滤液进行过滤，得到三级截留液，将所述二级截留液和三级截留液混合，得到粗提液；其中，所述乙醇溶液由无水乙醇和氯仿按体积比：13:7混合而成；所述乙醇溶液和所述混合液的体积比为1:0.5；
s5、将步骤s3所述粗提液和丙酮以体积比1:1的比例混合，使用200目筛网过滤出沉淀物，再将所述沉淀物溶于盐溶液中，45℃条件下低温热处理15min，静置3h，取上清液在温度为-40℃、真空度10pa、冷冻干燥48h，即可得sod粉末；其中，所述盐溶液中磷酸二氢钠浓度为0.4g/l，磷酸氢二钠浓度为7g/l，余量为水。
利用电泳法对本实施例步骤s2所述滤渣和步骤s5所得sod粉末分别进行检测，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离各成分，根据在凝胶条上所呈的色带进行鉴别，经检测：
本实施例步骤s2所述滤渣中几乎无sod成分检出，步骤s5所得sod粉末检出fe-sod。
本实施例还可以包括溶液配制、取樱桃渣等前处理步骤。
实施例2
一种针叶樱桃渣回收提取sod的方法，步骤如下：
s1、取1kg的针叶樱桃渣作为原料，进行分筛去除杂质、清洗针叶樱桃渣并对其用打浆机破碎成≤2mm的碎块，得到碎末；
s2、将步骤s1所述碎末和纤维素酶以质量比1g:900u的比例加入至所述碎末3倍质量的水中，使得水完全没过碎末，进行频率为20khz、功率为125w的超声破碎14min，使用160目筛网过滤去除滤渣，得到滤液；
s3、利用截留分子量为55000da的过滤膜对步骤s2所述滤液进行过滤，得到一级滤液和一级截留液，再利用截留分子量为20000da的过滤膜对所述一级滤液进行过滤，得到二级滤液和二级截留液；
s4、将步骤s3所述一级截留液和二级滤液混合得混合液，将所述混合液加入乙醇溶液，混合均匀后采用200目筛过滤去除沉淀物，所得溶液再利用截留分子量为55000da过滤膜进行0.35mpa压滤，得到压滤液；利用截留分子量为20000da的过滤膜对所述压滤液进行过滤，得到三级截留液，将所述二级截留液和三级截留液混合，得到粗提液；其中，所述乙醇溶液由无水乙醇和氯仿按体积比1:0.6混合而成；所述乙醇溶液和所述混合液的体积比为1:0.3；
s5、将步骤s3所述粗提液和丙酮以体积比1:1.1的比例混合，使用200目筛网过滤出沉淀物，再将所述沉淀物溶于盐溶液中，44℃条件下低温热处理18min，静置3h，取上清液在温度为-40℃、真空度10pa、冷冻干燥48h，即可得sod粉末；其中，所述盐溶液中磷酸二氢钠浓度为0.6g/l，磷酸氢二钠浓度为10g/l，余量为水。
利用电泳法对本实施例步骤s2所述滤渣和步骤s5所得sod粉末分别进行检测，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离各成分，根据在凝胶条上所呈的色带进行鉴别，经检测：本实施例步骤s2所述滤渣中几乎无sod成分检出，步骤s5所得sod粉末检出fe-sod。
实施例3
一种针叶樱桃渣回收提取sod的方法，步骤如下：
s1、取1kg的针叶樱桃渣作为原料，进行分筛去除杂质、清洗针叶樱桃渣并对其用打浆机破碎成≤2mm的碎块，得到碎末；
s2、将步骤s1所述碎末和纤维素酶以质量比1g:700u的比例加入至所述碎末2倍质量的水中，使得水完全没过碎末，进行频率为10khz、功率为50w的超声破碎10min，使用160目筛网过滤去除滤渣，得到滤液；
s3、利用截留分子量为50000da的过滤膜对步骤s2所述滤液进行过滤，得到一级滤液和一级截留液，再利用截留分子量为30000da的过滤膜对所述一级滤液进行过滤，得到二级滤液和二级截留液；
s4、将步骤s3所述一级截留液和二级滤液混合得混合液，将所述混合液加入乙醇溶液，混合均匀后采用200目筛过滤去除沉淀物，所得溶液再利用截留分子量为50000da过滤膜进行0.35mpa压滤，得到压滤液；利用截留分子量为30000da的过滤膜对所述压滤液进行过滤，得到三级截留液，将所述二级截留液和三级截留液混合，得到粗提液；其中，所述乙醇溶液由无水乙醇和氯仿按体积比1:0.5混合而成；所述乙醇溶液和所述混合液的体积比为1:0.4；
s5、将步骤s3所述粗提液和丙酮以体积比1:0.9的比例混合，使用200目筛网过滤出沉淀物，再将所述沉淀物溶于盐溶液中，42℃条件下低温热处理10min，静置2h，取上清液在温度为-40℃、真空度10pa、冷冻干燥48h，即可得sod粉末；其中，所述盐溶液中磷酸二氢钠浓度为0.6g/l，磷酸氢二钠浓度为9g/l，余量为水。
利用电泳法对本实施例步骤s2所述滤渣和步骤s5所得sod粉末分别进行检测，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离各成分，根据在凝胶条上所呈的色带进行鉴别，经检测：本实施例步骤s2所述滤渣中几乎无sod成分检出，步骤s5所得sod粉末检出fe-sod。
实施例4
一种针叶樱桃渣回收提取sod的方法，步骤如下：
s1、取1kg的针叶樱桃渣作为原料，进行分筛去除杂质、清洗针叶樱桃渣并对其用打浆机破碎成≤2mm的碎块，得到碎末；
s2、将步骤s1所述碎末和纤维素酶以质量比1g:800u的比例加入至所述碎末3倍质量的水中，使得水完全没过碎末，进行频率为15khz、功率为100w的超声破碎11min，使用160目筛网过滤去除滤渣，得到滤液；
s3、利用截留分子量为55000da的过滤膜对步骤s2所述滤液进行过滤，得到一级滤液和一级截留液，再利用截留分子量为25000da的过滤膜对所述一级滤液进行过滤，得到二级滤液和二级截留液；
s4、将步骤s3所述一级截留液和二级滤液混合得混合液，将所述混合液加入乙醇溶液，混合均匀后采用200目筛过滤去除沉淀物，所得溶液再利用截留分子量为55000da过滤膜进行0.35mpa压滤，得到压滤液；利用截留分子量为25000da的过滤膜对所述压滤液进行过滤，得到三级截留液，将所述二级截留液和三级截留液混合，得到粗提液；其中，所述乙醇溶液由无水乙醇和氯仿按体积比1:0.5混合而成；所述乙醇溶液和所述混合液的体积比为1:0.3；
s5、将步骤s3所述粗提液和丙酮以体积比1:0.9的比例混合，使用200目筛网过滤出沉淀物，再将所述沉淀物溶于盐溶液中，43℃条件下低温热处理15min，静置2.5h，取上清液在温度为-40℃、真空度10pa、冷冻干燥48h，即可得sod粉末；其中，所述盐溶液中磷酸二氢钠浓度为0.7g/l，磷酸氢二钠浓度为9g/l，余量为水。
利用电泳法对本实施例步骤s2所述滤渣和步骤s5所得sod粉末分别进行检测，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离各成分，根据在凝胶条上所呈的色带进行鉴别，经检测：本实施例步骤s2所述滤渣中几乎无sod成分检出，步骤s5所得sod粉末检出fe-sod。
实施例5
一种针叶樱桃渣回收提取sod的方法，步骤如下：
s1、取1kg的针叶樱桃渣作为原料，进行分筛去除杂质、清洗针叶樱桃渣并对其用打浆机破碎成≤2mm的碎块，得到碎末；
s2、将步骤s1所述碎末和纤维素酶以质量比1g:1000u的比例加入至所述碎末4倍质量的水中，使得水完全没过碎末，进行频率为25khz、功率为150w的超声破碎15min，使用160目筛网过滤去除滤渣，得到滤液；
s3、利用截留分子量为60000da的过滤膜对步骤s2所述滤液进行过滤，得到一级滤液和一级截留液，再利用截留分子量为10000da的过滤膜对所述一级滤液进行过滤，得到二级滤液和二级截留液；
s4、将步骤s3所述一级截留液和二级滤液混合得混合液，将所述混合液加入乙醇溶液，混合均匀后采用200目筛过滤去除沉淀物，所得溶液再利用截留分子量为60000da过滤膜进行0.35mpa压滤，得到压滤液；利用截留分子量为10000da的过滤膜对所述压滤液进行过滤，得到三级截留液，将所述二级截留液和三级截留液混合，得到粗提液；其中，所述乙醇溶液由无水乙醇和氯仿按体积比1:0.6混合而成；所述乙醇溶液和所述混合液的体积比为1:0.25；
s5、将步骤s3所述粗提液和丙酮以体积比1:1.2的比例混合，使用200目筛网过滤出沉淀物，再将所述沉淀物溶于盐溶液中，45℃条件下低温热处理20min，静置4h，取上清液在温度为-40℃、真空度10pa、冷冻干燥48h，即可得sod粉末；其中，所述盐溶液中磷酸二氢钠浓度为0.7g/l，磷酸氢二钠浓度为11g/l，余量为水。
利用电泳法对本实施例步骤s2所述滤渣和步骤s5所得sod粉末分别进行检测，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离各成分，根据在凝胶条上所呈的色带进行鉴别，经检测：本实施例步骤s2所述滤渣中几乎无sod成分检出，步骤s5所得sod粉末检出fe-sod。
对比例1
一种针叶樱桃渣回收提取sod的方法，步骤如下：
s1、取1kg的针叶樱桃渣作为原料，进行分筛去除杂质、清洗针叶樱桃渣并对其用打浆机破碎成≤2mm的碎块，得到碎末；
s2、将碎末加入至足量的水中，使得水完全没过碎末，进行频率为20khz、功率为100w的超声破碎10min，使用160目筛网过滤去除滤渣，得到滤液；
s3、利用截留分子量为50000da的过滤膜对步骤s2所述滤液进行过滤，得到一级滤液和一级截留液，再利用截留分子量为30000da的过滤膜对所述一级滤液进行过滤，得到二级滤液和二级截留液；
s4、将步骤s3所述一级截留液和二级滤液混合得混合液，将所述混合液加入乙醇溶液，混合均匀后采用200目筛过滤去除沉淀物，所得溶液再利用截留分子量为50000da过滤膜进行0.35mpa压滤，得到压滤液；利用截留分子量为30000da的过滤膜对所述压滤液进行过滤，得到三级截留液，将所述二级截留液和三级截留液混合，得到粗提液；其中，所述乙醇溶液由无水乙醇和氯仿按体积比：13:7混合而成；所述乙醇溶液和所述混合液的体积比为1:0.5；
s5、将步骤s3所述粗提液和丙酮以体积比1:1的比例混合，使用200目筛网过滤出沉淀物，再将所述沉淀物溶于盐溶液中，45℃条件下低温热处理15min，静置3h，取上清液在温度为-40℃、真空度10pa、冷冻干燥48h，即可得sod粉末；其中，所述盐溶液中磷酸二氢钠浓度为0.4g/l，磷酸氢二钠浓度为7g/l，余量为水。
利用电泳法对本实施例步骤s2所述滤渣和步骤s5所得sod粉末分别进行检测，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离各成分，根据在凝胶条上所呈的色带进行鉴别，经检测：
本实施例步骤s2所述滤渣中几乎无sod成分检出，步骤s5所得sod粉末检出fe-sod。
对比例2
一种针叶樱桃渣回收提取sod的方法，步骤如下：
s1、取1kg的针叶樱桃渣作为原料，进行分筛去除杂质、清洗针叶樱桃渣并对其用打浆机破碎成≤2mm的碎块，得到碎末；
s2、将碎末加入至足量的水中，使得水完全没过碎末，进行频率为30khz、功率为300w的超声破碎5min，使用160目筛网过滤去除滤渣，得到滤液；
s3、利用截留分子量为50000da的过滤膜对步骤s2所述滤液进行过滤，得到一级滤液和一级截留液，再利用截留分子量为30000da的过滤膜对所述一级滤液进行过滤，得到二级滤液和二级截留液；
s4、将步骤s3所述一级截留液和二级滤液混合得混合液，将所述混合液加入乙醇溶液，混合均匀后采用200目筛过滤去除沉淀物，所得溶液再利用截留分子量为50000da过滤膜进行0.35mpa压滤，得到压滤液；利用截留分子量为30000da的过滤膜对所述压滤液进行过滤，得到三级截留液，将所述二级截留液和三级截留液混合，得到粗提液；其中，所述乙醇溶液由无水乙醇和氯仿按体积比：13:7混合而成；所述乙醇溶液和所述混合液的体积比为1:0.5；
s5、将步骤s3所述粗提液和丙酮以体积比1:1的比例混合，使用200目筛网过滤出沉淀物，再将所述沉淀物溶于盐溶液中，45℃条件下低温热处理15min，静置3h，取上清液在温度为-40℃、真空度10pa、冷冻干燥48h，即可得sod粉末；其中，所述盐溶液中磷酸二氢钠浓度为0.4g/l，磷酸氢二钠浓度为7g/l，余量为水。
利用电泳法对本实施例步骤s2所述滤渣和步骤s5所得sod粉末分别进行检测，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离各成分，根据在凝胶条上所呈的色带进行鉴别，经检测：
本实施例步骤s2所述滤渣中几乎无sod成分检出，步骤s5所得sod粉末检出fe-sod。
对比例3
一种针叶樱桃渣回收提取sod的方法，所述方法包括以下步骤：
s1、取1kg的针叶樱桃渣作为原料，进行分筛去除杂质、清洗针叶樱桃渣并对其用打浆机破碎成≤2mm的碎块，得到碎末；
s2、将碎末和纤维素酶以质量比1：0.02的比例加入至足量的水中，30℃恒温搅拌1h，使用160目筛网过滤去除滤渣，得到滤液；
s3、利用截留分子量为50000da的过滤膜对步骤s2所述滤液进行过滤，得到一级滤液和一级截留液，再利用截留分子量为30000da的过滤膜对所述一级滤液进行过滤，得到二级滤液和二级截留液；
s4、将步骤s3所述一级截留液和二级滤液混合得混合液，将所述混合液加入乙醇溶液，混合均匀后采用200目筛过滤去除沉淀物，所得溶液再利用截留分子量为50000da过滤膜进行0.35mpa压滤，得到压滤液；利用截留分子量为30000da的过滤膜对所述压滤液进行过滤，得到三级截留液，将所述二级截留液和三级截留液混合，得到粗提液；其中，所述乙醇溶液由无水乙醇和氯仿按体积比：13:7混合而成；所述乙醇溶液和所述混合液的体积比为1:0.5；
s5、将步骤s3所述粗提液和丙酮以体积比1:1的比例混合，使用200目筛网过滤出沉淀物，再将所述沉淀物溶于盐溶液中，45℃条件下低温热处理15min，静置3h，取上清液在温度为-40℃、真空度10pa、冷冻干燥48h，即可得sod粉末；其中，所述盐溶液中磷酸二氢钠浓度为0.4g/l，磷酸氢二钠浓度为7g/l，余量为水。
利用电泳法对本实施例步骤s2所述滤渣和步骤s5所得sod粉末分别进行检测，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离各成分，根据在凝胶条上所呈的色带进行鉴别，经检测：
本实施例步骤s2所述滤渣中几乎无sod成分检出，步骤s5所得sod粉末检出fe-sod。
对比例4
一种针叶樱桃渣回收提取sod的方法，所述方法包括以下步骤：
s1、取1kg的针叶樱桃渣作为原料，进行分筛去除杂质、清洗针叶樱桃渣并对其用打浆机破碎成≤2mm的碎块，得到碎末；
s2、将碎末和纤维素酶以质量比1：0.05的比例加入至足量的水中，30℃恒温搅拌1h，使用160目筛网过滤去除滤渣，得到滤液；
s3、利用截留分子量为50000da的过滤膜对步骤s2所述滤液进行过滤，得到一级滤液和一级截留液，再利用截留分子量为30000da的过滤膜对所述一级滤液进行过滤，得到二级滤液和二级截留液；
s4、将步骤s3所述一级截留液和二级滤液混合得混合液，将所述混合液加入乙醇溶液，混合均匀后采用200目筛过滤去除沉淀物，所得溶液再利用截留分子量为50000da过滤膜进行0.35mpa压滤，得到压滤液；利用截留分子量为30000da的过滤膜对所述压滤液进行过滤，得到三级截留液，将所述二级截留液和三级截留液混合，得到粗提液；其中，所述乙醇溶液由无水乙醇和氯仿按体积比：13:7混合而成；所述乙醇溶液和所述混合液的体积比为1:0.5；
s5、将步骤s3所述粗提液和丙酮以体积比1:1的比例混合，使用200目筛网过滤出沉淀物，再将所述沉淀物溶于盐溶液中，45℃条件下低温热处理15min，静置3h，取上清液在温度为-40℃、真空度10pa、冷冻干燥48h，即可得sod粉末；其中，所述盐溶液中磷酸二氢钠浓度为0.4g/l，磷酸氢二钠浓度为7g/l，余量为水。
利用电泳法对本实施例步骤s2所述滤渣和步骤s5所得sod粉末分别进行检测，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离各成分，根据在凝胶条上所呈的色带进行鉴别，经检测：
本实施例步骤s2所述滤渣中几乎无sod成分检出，步骤s5所得sod粉末检出fe-sod。
对比例5
一种针叶樱桃渣回收提取sod的方法，所述方法包括以下步骤：
s1、取1kg的针叶樱桃渣作为原料，进行分筛去除杂质、清洗针叶樱桃渣并对其用打浆机破碎成≤2mm的碎块，得到碎末；
s2、将碎末、纤维素酶和果胶酶以质量比1：0.02：0.02的比例加入至足量的水中，30℃恒温搅拌1h，使用160目筛网过滤去除滤渣，得到滤液；
s3、利用截留分子量为50000da的过滤膜对步骤s2所述滤液进行过滤，得到一级滤液和一级截留液，再利用截留分子量为30000da的过滤膜对所述一级滤液进行过滤，得到二级滤液和二级截留液；
s4、将步骤s3所述一级截留液和二级滤液混合得混合液，将所述混合液加入乙醇溶液，混合均匀后采用200目筛过滤去除沉淀物，所得溶液再利用截留分子量为50000da过滤膜进行0.35mpa压滤，得到压滤液；利用截留分子量为30000da的过滤膜对所述压滤液进行过滤，得到三级截留液，将所述二级截留液和三级截留液混合，得到粗提液；其中，所述乙醇溶液由无水乙醇和氯仿按体积比：13:7混合而成；所述乙醇溶液和所述混合液的体积比为1:0.5；
s5、将步骤s3所述粗提液和丙酮以体积比1:1的比例混合，使用200目筛网过滤出沉淀物，再将所述沉淀物溶于盐溶液中，45℃条件下低温热处理15min，静置3h，取上清液在温度为-40℃、真空度10pa、冷冻干燥48h，即可得sod粉末；其中，所述盐溶液中磷酸二氢钠浓度为0.4g/l，磷酸氢二钠浓度为7g/l，余量为水。
利用电泳法对本实施例步骤s2所述滤渣和步骤s5所得sod粉末分别进行检测，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离各成分，根据在凝胶条上所呈的色带进行鉴别，经检测：
本实施例步骤s2所述滤渣中几乎无sod成分检出，步骤s5所得sod粉末检出fe-sod。
对实施例1～5和对比例1～5所得sod粉末的超氧化物歧化酶的酶活性和所述sod粉末的得率进行计算，其中得率以实施例1所制得sod粉末重量为基准(即100wt％)进行。
结果分别如图1和图2所示。从图1和图2中可明显看出，本发明技术方案制备sod粉末时得率的稳定性高，基本保持较高的稳定性，而对比例1～5中虽有部分对比例的得率更高，但是所制得产品中酶的比活性明显低于本发明实施例所得sod粉末，其杂质含量高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
1.一种针叶樱桃渣回收提取sod的方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1、取针叶樱桃渣破碎得到碎末；
s2、将步骤s1所述碎末和纤维素酶共置于水中，进行超声破碎，所述超声破碎的频率为10～25khz、功率为50～150w、时长为10～15min；过滤去除滤渣，得到滤液；其中，所述碎末质量与纤维素酶酶活的比例为1g:(600～1000)u，所述碎末与水的质量之比为1:2～1:4；
s3、利用截留分子量为50000～60000da的过滤膜对步骤s2所述滤液进行过滤，得到一级滤液和一级截留液，再利用截留分子量为10000～30000da过滤膜对所述一级滤液进行过滤，得到二级滤液和二级截留液；
s4、将步骤s3所述一级截留液和二级滤液混合，得混合液；将所述混合液加入乙醇溶液，混合均匀，去除沉淀物，所得液体再利用截留分子量为50000～60000da的过滤膜进行0.35mpa压滤，得到压滤液；利用分子量为10000～30000da的过滤膜对所述压滤液进行过滤，得到三级截留液，将所述二级截留液和三级截留液混合，得到粗提液；所述乙醇溶液由乙醇和氯仿按体积比1：(0.4～0.6)混合而成，所述乙醇溶液和所述混合液的体积比为1：(0.5～0.25)；
s5、将步骤s4所述粗提液和丙酮按体积比1：(0.8～1.2)混合，取沉淀物，再将沉淀物溶于盐溶液中，40～45℃热处理10～20min，静置2～4h，取上清液进行冷冻干燥，得sod粉末；其中，所述盐溶液中磷酸二氢钠浓度为0.4～0.7g/l，磷酸氢二钠浓度为7～11g/l，余量为水。
2.根据权利要求1所述针叶樱桃渣回收提取sod的方法，其特征在于，步骤s1所述破碎具体为：将针叶樱桃渣用打浆机破碎成≤2mm的碎块。
3.根据权利要求1所述针叶樱桃渣回收提取sod的方法，其特征在于，步骤s2所述过滤使用160目筛。
4.根据权利要求1所述针叶樱桃渣回收提取sod的方法，其特征在于，步骤s4所述去除沉淀物具体为：采用200目筛过滤去除沉淀。
5.根据权利要求1所述针叶樱桃渣回收提取sod的方法，其特征在于，步骤s5所述取沉淀物的方法为：使用200目筛过滤，取沉淀。
6.根据权利要求1所述针叶樱桃渣回收提取sod的方法，其特征在于，步骤s5所述冷冻干燥的参数为：温度为-40℃，真空度10pa，时间为48h。
7.根据权利要求1所述针叶樱桃渣回收提取sod的方法，其特征在于，包括步骤：
s1、取1kg的针叶樱桃渣作为原料，进行分筛去除杂质、清洗针叶樱桃渣并用打浆机破碎成≤2mm的碎块，得到碎末；
s2、将步骤s1所述碎末和纤维素酶以1g:600u的比例加入至所述碎末2倍质量的水中，进行频率为20khz、功率为100w的超声破碎10min，使用160目筛网过滤去除滤渣，得到滤液；
s3、利用截留分子量为50000da的过滤膜对步骤s2所述滤液进行过滤，得到一级滤液和一级截留液，再利用截留分子量为30000da的过滤膜对所述一级滤液进行过滤，得到二级滤液和二级截留液；
s4、将步骤s3所述一级截留液和二级滤液混合得混合液，将所述混合液加入乙醇溶液，混合均匀，采用200目筛过滤去除沉淀物，所得溶液再利用截留分子量为50000da过滤膜进行0.35mpa压滤，得到压滤液；利用截留分子量为30000da的过滤膜对所述压滤液进行过滤，得到三级截留液；将所述二级截留液和三级截留液混合，得到粗提液；其中，所述乙醇溶液由无水乙醇和氯仿按体积比13:7混合而成；所述乙醇溶液和所述混合液的体积比为1:0.5；
s5、将步骤s3所述粗提液和丙酮以体积比1:1的比例混合，使用200目筛网过滤出沉淀物，再将所述沉淀物溶于盐溶液中，45℃低温热处理15min，静置3h，取上清液在温度为-40℃、真空度10pa、冷冻干燥48h，得sod粉末；其中，所述盐溶液中磷酸二氢钠浓度为0.4g/l，磷酸氢二钠浓度为7g/l，余量为水。
技术总结