本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及超氧化物歧化酶及其制备方法、超氧化物歧化酶口服液和固体制剂。
背景技术：
：超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod)是一类氧化还原金属酶，能清除体内超氧自由基阴离子，有效地预防超氧自由基阴离子对机体的损害作用，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。sod酶广泛分布于各种生物体内，如动物、植物、微生物等。目前，sod酶的生产主要是从动物血液或肝脏中提取，由于资源有限而且容易造成污染，难于推广应用。为此，许多研究者开始利用微生物可以大规模培养且容易获得的优势，积极探索利用微生物发酵生产sod酶。然而，目前微生物发酵生产sod酶仍有待研究。技术实现要素：本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：发明人发现，并非所有的sod酶经高压处理后均能够提高酶活性，例如月季。而且，现有的sod酶热稳定性低，在相对较高的温度下即会出现明显的酶活降低现象。因此，其对环境温度的要求较为严苛，不便于保存和实施应用。有鉴于此，发明人发现，刺梨的sod酶本身具有较好的酶活性，并且经高压处理可以显著提高酶活性。而且，其热稳定性强，即便在80℃左右酶活仍未出现明显降低，其对环境温度的要求较低，从而有利于保存和实施应用。进一步地，由于目前刺梨的sod酶序列并未公开，发明人对sod酶进行基因克隆，获得了刺梨的sod酶的氨基酸序列及编码其的dna序列。经过对刺梨sod酶的氨基酸序列进行研究分析，推断出其第15位、第67位、第87位和第142位可能是影响酶活性、高压处理效果及热稳定性的功能位点。由此，为了进一步提高该sod酶的活性，发明人对该sod酶进行了高压激活处理，以获得具有酶活高且热稳定性强的sod酶口服液或固体粉剂，可应用于食品、医药和化妆品领域中，应用前景广泛。为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种超氧化物歧化酶。根据本发明的实施例，所述超氧化物歧化酶具有seqidno：1所示的氨基酸序列或者与seqidno：1所示的氨基酸序列具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少95%、至少99%）同源性的同源序列，所述同源序列中第15位为t、第67位为g、第87位为i、第143位为v。发明人发现，上述sod酶本身具有较好的酶活性，并且经高压处理可以显著提高酶活性。而且，其热稳定性强，即便在80℃左右酶活仍未出现明显降低，对环境温度的要求较低，从而有利于保存和实施应用。进一步地，经过对上述sod酶的氨基酸序列进行研究分析，推断出其第15位、第67位、第87位和第143位可能是影响酶活性、高压处理效果及热稳定性的功能位点。实验发现，具有seqidno：1序列的sod酶及与其具有同源性（序列至少80%同源性，例如至少85%、至少90%、至少95%、至少99%）的酶的活性及热稳定性接近，且经高压激活后的sod酶的活性接近，均具有较高的酶活性。由此，根据本发明实施例的超氧化物歧化酶的酶活高，热稳定性强，可应用于食品、医药和化妆品领域中，应用前景广泛。makgvavlcssegvtgtilftqegdgpttvtgnvsglkpglhgfhvhalgdttngcmstgphfnpagkehgapedenrhagdlgniivgddgtatftivdkqipltgphsiigravvvhgdpddlgkgghelskstgnaggrvacgiiglqg（seqidno：1）根据本发明的实施例，上述超氧化物歧化酶还可以具有下列附加技术特征：根据本发明的实施例，所述超氧化物歧化酶来源于刺梨。在本发明的另一方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码前面所述超氧化物歧化酶。如前所述，采用该核酸编码的超氧化物歧化酶的酶活性高、热稳定性强，经高压处理可以显著提高酶活性，具有广泛的应用前景。根据本发明的实施例，所述核酸具有：seqidno：2所示的核苷酸序列；或者与seqidno：2所示的核苷酸序列具有至少80%（例如至少85%、至少90%、至少95%、至少99%）同源性的同源序列，所述同源序列中第43位至第45位为acg，第199位至第201位为ggc，第259位至第261位为att，第427位至第429位为gta。发明人发现，采用该核酸编码的超氧化物歧化酶的酶活性高、热稳定性强，经高压处理可以显著提高酶活性。atggcaaagggtgttgctgtactttgctccagtgagggtgttacgggaactatcctcttcacccaagagggagatggcccaactactgtgactggaaacgtttctggcctcaagcctgggcttcatggtttccatgttcatgctcttggtgacacaacaaacggttgcatgtcaactggaccacacttcaatcctgctggcaaagagcatggtgctcctgaagatgagaatcgtcatgctggtgatcttggaaatatcattgttggggatgatggaactgctaccttcacaattgttgacaagcagattcctctcactggaccacattctatcattggtagggcggttgttgtccatggagaccctgatgaccttggcaagggtggacatgagcttagcaaatccactggaaatgctggaggcagggtagcttgtggtattattggtctccaaggatga（seqidno：2）在本发明的又一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体含有前面所述核酸。由此，将含有该核酸的表达载体导入细胞中，可以实现该核酸的表达，获得的超氧化物歧化酶的酶活性高，热稳定性强，经高压处理可显著提高酶活性。在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过前面所述表达载体转化受体细胞获得的。由此，上述核酸可以在该重组细胞中表达，获得的超氧化物歧化酶的酶活性高，热稳定性强，经高压处理可显著提高酶活性。在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备前面所述超氧化物歧化酶的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：培养前面所述重组细胞，使所述重组细胞表达超氧化物歧化酶，以便得到培养液；将所述培养液进行分离纯化，以便获得超氧化物歧化酶；以及任选的将所述超氧化物歧化酶进行高压激活处理；所述高压激活处理的压力为400～600mpa，时间为1～20min，温度为6~18℃。根据本发明实施例的方法所得超氧化物歧化酶的酶活性高、热稳定性强。为了进一步提高超氧化物歧化酶的稳定性，可以对其进行高压激活处理，发明人经过大量实验得到上述较优高压激活处理条件，获得的超氧化物歧化酶活性较高。由此，利用根据本发明实施例的制备方法所得到的超氧化物歧化酶的酶活性高，经高压处理可显著提高酶活性，热稳定性强，对环境温度的要求较低，有利于保存和实施应用。并且，该方法操作简便，易于实施，适于规模化生产。根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述高压激活处理所得到的激活产物进行干燥处理，以便得到超氧化物歧化酶固体制剂。该激活产物可以用于制备超氧化物歧化酶口服液。发明人发现，经过高压激活处理的超氧化物歧化酶构象有所改变，使得其活性提高，但是，长期保存后该超氧化物歧化酶的构象容易恢复，导致酶活有所降低。通过将其干燥，制成固体制剂，超氧化物歧化酶在固态下不易发生构象恢复，从而避免酶活降低，使其长时间处于高酶活状态。根据本发明的实施例，所述干燥处理包括冷冻干燥处理和/或喷雾干燥处理。由此，以便于得到超氧化物歧化酶固体制剂。根据本发明的实施例，进行所述干燥处理之前，预先将激活产物与助干剂混合，所述助干剂为β-环糊精、麦芽糊精和/或可溶性淀粉，所述助干剂的添加量为0~50质量%。由此，可以有效提高固体制剂的干燥性，防止吸潮。根据本发明的实施例，所述冷冻干燥处理的冷阱温度为-45℃～-80℃，真空度为15～30pa，干燥时间为12～48h。由此，以便于加快激活产物干燥，且避免超氧化物歧化酶活性降低。根据本发明的实施例，所述喷雾干燥处理的进风口温度为140～180℃，出风口温度为55～70℃，进料流量为3～12ml/min。由此，以便于加快激活产物干燥，且避免超氧化物歧化酶活性降低。根据本发明的具体实施例，进风口温度为160℃，出风口温度为60℃，进料流量为3ml/min。在本发明的又一方面，本发明提出了一种超氧化物歧化酶口服液。根据本发明的实施例，所述超氧化物歧化酶口服液含有前面所述超氧化物歧化酶。由此，根据本发明实施例的超氧化物歧化酶口服液对于环境温度的要求不高，有利于保存和应用，应用前景广泛。根据本发明的实施例，所述超氧化物歧化酶口服液是通过前面所述制备超氧化物歧化酶的方法所得到的。由此，所得到的超氧化物歧化酶口服液中超氧化物歧化酶活性高。在本发明的又一方面，本发明提出了一种超氧化物歧化酶固体制剂。根据本发明的实施例，所述超氧化物歧化酶固体制剂含有前面所述超氧化物歧化酶。由此，根据本发明实施例的超氧化物歧化酶固体制剂对于环境温度的要求不高，有利于保存和应用。并且，超氧化物歧化酶具有较高的活力，保质期长，使用效果好。根据本发明的实施例，所述超氧化物歧化酶固体制剂是通过前面所述制备超氧化物歧化酶的方法所得到的。由此，所得到的超氧化物歧化酶固体制剂中超氧化物歧化酶活性高，且不易出现酶活降低的现象，保质期长，使用效果好。根据本发明的实施例，所述超氧化物歧化酶固体制剂在4℃下保存60天后，所述超氧化物歧化酶的活性降低不大于20%（例如不大于15%、不大于10%或不大于6%）。由此，通过将经高压激活处理的超氧化物歧化酶制成固体制剂，以避免经高压激活处理而改变的构象恢复，从而减少酶活降低，使其长时间处于高酶活状态，保质期长。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1在该实施例中，按照下列方法制备sod固体粉剂：1、刺梨总rna提取采用艾德莱rna提取试剂盒提取，具体步骤如下：（1）取果实组织200mg于液氮中研磨，转移至65℃预热的1mlclb裂解液（10%巯基乙醇），用移液枪头吹打混匀立即涡旋30-60s，65℃孵育5min，13000rpm离心10min。（2）转移液体至新的离心管，加入0.5倍体积的无水乙醇，吹打混匀。（3）将混合物转移至基因组清除柱中，13000rpm离心2min，弃掉废液。（4）将基因组清除柱放入离心管内，加入500μl裂解液rltplus，13000rpm离心30s，加入0.5倍体积的无水乙醇，吹打混匀。（5）将混合物置于吸附柱ra中，13000rpm离心2min，弃掉废液。（6）加入700μl的去蛋白液rw1，室温静置1分钟，13,000rpm离心30s，弃掉废液。（7）加入500μl漂洗液rw（使用前加入无水乙醇），13,000rpm离心30秒，弃掉废液。（8）重复上述步骤（7）。（9）将吸附柱ra放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，彻底除去漂洗液。（10）取出吸附柱ra，放入rnasefree离心管中，向中间部位加入40μlrnasefreewater，静置1min。（11）12000rpm离心1分钟，离心管内液体即为刺梨总rna溶液。（12）rna浓度与质量检测：取5μl的rna溶液进行1.2%的普通琼脂糖凝胶电泳。取1μlrna溶液使用nanodrop检测浓度和od260/od280比值。2、cdna第一条链的合成将rna采用如下反应体系和程序逆转录为cdna：反应体系：5×fastking-rtsupermix4μl；totalrna2μl；rnase-freeddh2o14μl；反应程序：42℃15min；95℃3min。3、刺梨sod基因片段的pcr扩增以刺梨果实反转录得到的cdna为模板，用sod基因保守区的1对引物sod-f和sod-r进行sod基因保守片段pcr扩增。基于上述得到的sod基因保守区扩增产物序列，对rna进行3’race和5’race，从而获得cdna全长序列，其编码框核苷酸序列为seqidno：1所示，编码的氨基酸序列为seqidno：2所示。sod-f：tctcctggccttcatggtttccatat（seqidno：3）sod-r：gtagtcttgctaagttcatgtccacc（seqidno：4）反应体系：template1μl；supermix10μl；ddh2o7μl；sod-r1μl；sod-f1μl；反应程序：98℃变性2min；98℃预变性10s，57℃退火20s，72℃延伸，10s，30个循环；72℃终延伸5min。4、分离获得sod（1）以上述分离的cdna全长序列为模板对编码框进行pcr扩增，将扩增片段插入到pet-30a并导入到e.colibl21(de3)中，挑选bl21(de3)（pet30a-sod）接种于20ml50ｕg/mllb培养基中，37℃220rpm振荡培养12h。（2）取上述细胞10ml接种于1l50ｕg/mllb培养基中，37℃220rpm振荡培养。（3）当od600=0.9时，加入iptg至终浓度为1mm，37℃120rpm继续振荡培养5h。（4）转移菌液至200ml离心瓶中，4℃7000g离心5min，富集菌体后用20ml细胞裂解缓冲液进行菌体重悬，对细胞全蛋白进行sds-page分析。5、高压激活将所得到的sod进行高压激酶处理，其中压力为550mpa，时间为5min，温度为16.5℃，得到激活产物，该激活产物作为口服液应用。6、制备固体粉剂将激活产物中加入10质量%（激活产物质量）的β-环糊精，再进行冷冻干燥处理，其中，冷阱温度为：-67℃，真空度为26pa，干燥时间为48h，得到固体粉剂。实施例2酶活性分析1、按照下列方式获得刺梨sod酶和月季的sod酶准确称取0.2g月季或者刺梨，加入1.8ml的pbs，将样品破碎，然后冰浴上使用碾钵碾磨制备10%样品匀浆。再用pbs稀释5倍（加入8mlpbs，清洗碾钵，收集清洗液）。稀释液进行4℃10000g离心10min。离心后取上清液，即为月季sod酶粗提液和刺梨sod酶粗提液，月季sod酶的氨基酸序列如seqidno：5所示，刺梨sod酶的氨基酸序列如seqidno：1所示。makgvavlcssegvkgtilftqegdgpttvtgnvsglkpglhgfhvhalgdttngcmstgphfnpaakehgapedenrhagdlgnitvgddgtatftivdkqipltgphsiigravvvhgdpddlgkgghelskstgnaggriacgiiglqg（seqidno：5）2、分别将月季sod酶粗提液和刺梨sod酶粗提液进行高压激酶处理，其中压力为550mpa，时间为5min，温度为16.5℃。3、采用南京建成sod酶活检测试剂盒对刺梨sod酶粗提液、高压激活刺梨sod酶粗提液、月季sod酶粗提液和高压激活月季sod酶粗提液的酶活性进行检测。结果如表1所示，可以看出，刺梨sod酶活性比月季sod酶活性高，且经高压处理后，刺梨sod酶的酶活性显著提高，而月季sod酶活性未有明显变化。由此，表明并非所有的sod酶经高压处理后均可以提高酶活性。并且，经对刺梨sod酶和月季sod酶的氨基酸序列进行比对，推断刺梨sod酶（seqidno：1）第15位、第67位、第87位、第142位可能是影响其酶活性及高压处理效果的功能位点。表1酶活性高压前酶活性（u/g）高压后酶活性（u/g）刺梨sod酶（平行样1）3625.94713.67刺梨sod酶（平行样2）3894.54868.13月季sod酶（平行样1）993.14983.12月季sod酶（平行样2）1076.921036.58实施例3热稳定性分析对实施例1步骤4所得sod进行如下稳定性分析：将sod酶分别在固定温度（50、60、70、80和90ºc）下孵育10、20、30、40、50和60分钟。孵育结束后，立即将样品转移到冰水中，在2小时内测定酶活性。结果表明，在50~80℃的范围内，sod酶均可以长时间保持较高的酶活。当达到90℃时，短时间处理（0~20min）对sod酶的酶活影响不大，长时间处理（20min以上）会导致酶活降低。由此，表明本发明的sod酶具有较高的热稳定性。同时，分别将实施例2步骤1所得月季sod酶粗提液和刺梨sod酶粗提液在固定温度（50、90℃）下孵育20、60分钟。孵育结束后，立即将样品转移到冰水中，在2小时内测定酶活性。结果如表2和表3所示，可以看出，相比于月季sod酶，刺梨sod酶随温度变化，sod酶活热变化率低，具有较好的热稳定性。表2月季sod酶活（u/g）热变化率无处理20min变化率(%)60min变化率(%)50℃993.13935.92-5.761039.504.6790℃1076.92868.63-19.34589.79-45.23表3刺梨sod酶活（u/g）热变化率0min20min变化率(%)60min变化率(%)50℃3625.903654.550.793627.040.0390℃3679.513646.99-0.883057.79-16.89在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。序列表<110>中国农业大学<120>超氧化物歧化酶及其制备方法、超氧化物歧化酶口服液和固体制剂<130>pidc3200532<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>152<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1metalalysglyvalalavalleucyssersergluglyvalthrgly151015thrileleuphethrglngluglyaspglyprothrthrvalthrgly202530asnvalserglyleulysproglyleuhisglyphehisvalhisala354045leuglyaspthrthrasnglycysmetserthrglyprohispheasn505560proalaglylysgluhisglyalaprogluaspgluasnarghisala65707580glyaspleuglyasnileilevalglyaspaspglythralathrphe859095thrilevalasplysglnileproleuthrglyprohisserileile100105110glyargalavalvalvalhisglyaspproaspaspleuglylysgly115120125glyhisgluleuserlysserthrglyasnalaglyglyargvalala130135140cysglyileileglyleuglngly145150<210>2<211>459<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atggcaaagggtgttgctgtactttgctccagtgagggtgttacgggaactatcctcttc60acccaagagggagatggcccaactactgtgactggaaacgtttctggcctcaagcctggg120cttcatggtttccatgttcatgctcttggtgacacaacaaacggttgcatgtcaactgga180ccacacttcaatcctgctggcaaagagcatggtgctcctgaagatgagaatcgtcatgct240ggtgatcttggaaatatcattgttggggatgatggaactgctaccttcacaattgttgac300aagcagattcctctcactggaccacattctatcattggtagggcggttgttgtccatgga360gaccctgatgaccttggcaagggtggacatgagcttagcaaatccactggaaatgctgga420ggcagggtagcttgtggtattattggtctccaaggatga459<210>3<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tctcctggccttcatggtttccatat26<210>4<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gtagtcttgctaagttcatgtccacc26<210>5<211>152<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>5metalalysglyvalalavalleucyssersergluglyvallysgly151015thrileleuphethrglngluglyaspglyprothrthrvalthrgly202530asnvalserglyleulysproglyleuhisglyphehisvalhisala354045leuglyaspthrthrasnglycysmetserthrglyprohispheasn505560proalaalalysgluhisglyalaprogluaspgluasnarghisala65707580glyaspleuglyasnilethrvalglyaspaspglythralathrphe859095thrilevalasplysglnileproleuthrglyprohisserileile100105110glyargalavalvalvalhisglyaspproaspaspleuglylysgly115120125glyhisgluleuserlysserthrglyasnalaglyglyargileala130135140cysglyileileglyleuglngly145150当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种超氧化物歧化酶，其特征在于，所述超氧化物歧化酶具有：
seqidno：1所示的氨基酸序列；或者
与seqidno：1所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的同源序列，所述同源序列中第15位为t、第67位为g、第87位为i、第143位为v。
2.根据权利要求1所述的超氧化物歧化酶，其特征在于，所述超氧化物歧化酶来源于刺梨。
3.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1或2所述超氧化物歧化酶。
4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述核酸具有：
seqidno：2所示的核苷酸序列；或者
与seqidno：2所示的核苷酸序列具有至少80%同源性的同源序列，所述同源序列中第43位至第45位为acg，第199位至第201位为ggc，第259位至第261位为att，第427位至第429位为gta。
5.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求3或4所述核酸。
6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过权利要求5所述表达载体转化受体细胞获得的。
7.一种制备权利要求1或2所述超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，包括：
培养权利要求6所述重组细胞，使所述重组细胞表达超氧化物歧化酶，以便得到培养液；
将所述培养液进行分离纯化，以便获得超氧化物歧化酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，进一步包括：将所述超氧化物歧化酶进行高压激活处理；
所述高压激活处理的压力为400～600mpa，时间为1～20min，温度为6~18℃。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，进一步包括：将所述高压激活处理所得到的激活产物进行干燥处理，以便得到超氧化物歧化酶固体制剂；
所述干燥处理包括冷冻干燥处理和/或喷雾干燥处理；
进行所述干燥处理之前，预先将激活产物与助干剂混合，所述助干剂为β-环糊精、麦芽糊精和/或可溶性淀粉，所述助干剂的添加量为0~50质量%；
所述冷冻干燥处理的冷阱温度为-45℃～-80℃，真空度为15～30pa，干燥时间为12～48h；
所述喷雾干燥处理的进风口温度为140～180℃，出风口温度为55～70℃，进料流量为3～12ml/min。
10.一种超氧化物歧化酶口服液，其特征在于，含有权利要求1或2所述超氧化物歧化酶。
11.根据权利要求10所述的超氧化物歧化酶口服液，其特征在于，所述超氧化物歧化酶口服液是通过权利要求8所述制备超氧化物歧化酶的方法所得到的。
12.一种超氧化物歧化酶固体制剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述超氧化物歧化酶。
13.根据权利要求12所述的超氧化物歧化酶固体制剂，其特征在于，所述超氧化物歧化酶固体制剂是通过权利要求9所述制备超氧化物歧化酶的方法所得到的；
所述超氧化物歧化酶固体制剂在4℃下保存60天后，所述超氧化物歧化酶的活性降低不大于20%。
技术总结本发明提出了超氧化物歧化酶及其制备方法、超氧化物歧化酶口服液和固体制剂，所述超氧化物歧化酶具有：SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或者与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的同源序列，所述同源序列中第15位为T、第67位为G、第87位为I、第143位为V。本发明的超氧化物歧化酶具有较高酶活以及热稳定性，且经高压处理可显著提高酶活性，可应用于食品、医药和化妆品领域中，应用前景广泛。
技术研发人员：廖小军;王永涛;赵靓;赵阳
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2020.04.30
技术公布日：2020.06.09
