本发明属于农残检测技术领域，具体涉及豇豆血红素铁结合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术：
酶抑制法在农残中的应用是在1951年提出的，其应用广泛也较早。酶抑制法的主要检测原理是有机磷类、氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶与羧酸酯酶等有很强的抑制力，能进一步影响酯酶酶促反应中酶与底物反应过程，从而影响底物与显色剂的反应，这种显色反应可以在生物体外反应出农药的抑制力，通过观察反应体系的颜色变化或者酶与某种特定化合物结合后的理化信号强弱判定样品中是否含有农药，以及农药残留量是否超标。一般情况下，在体外的实验检测中，农药的引入会使检测用酶的酶活受到一定的影响，当提高农药的加入量时，所用酶的酶活会减小，而酶对底物水解后生成的底物累积量是与酶活性正相关的，酶活力越大，产物则越多。主要方法有：检测生成产物的醋酸变化量的δph法；检测生成产物醋酸的电位法；检测生成产物醋酸与nahco3反应后进一步生成二氧化碳，然后检测二氧化碳产生的压力；检测水解产物与显色剂作用后的颜色的比色法等。近年来市场上使用的农残检测技术、农药残留检测设备大多都是基于酶抑制法的原理设计的。目前市场上也已经研制出了多种基于酶抑制法原理的农残快速检测试剂盒，且国外多个国家也将这类试剂盒作为在田间进行初步筛查农药残留量的主要手段。酶抑制法有着方法简单易于操作，成本低，检测用时短，可行性高，样品检测量大，有时对样品的要求不高，简单处理后即可检测等特点，适合基层的技法人员、家庭及个人使用的检测方法。作为目前市场使用最广泛的方法，国内也出台了多个标准指导其使用，如gb/t18625、gb/t18626、gb/t18630等。因此，在可期的未来，酶抑制法依然是农残快检技术中一个非常重要的检测方法。
酶抑制法在国内广泛推广的这些年中，所使用的酶源主要有动物来源的乙酰胆碱酯酶，酶源单一且提取成本昂贵，且易受酶浓度、底物种类与浓度、ph值等的影响。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种植物性来源的豇豆血红素铁结合蛋白，功效类似于乙酰胆碱酯酶，对多种农药敏感性高，可将其应用于在酶抑制法农残快检，且制备成本低廉、稳定性好、保存期长。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了豇豆血红素铁结合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)将豇豆粉碎后与pb缓冲溶液混合后，震荡提取，静置2h后，离心得上清液；
(2)将所述上清液过凝胶层析柱分离纯化，以pb缓冲液作为流动相，流速设置为0.75ml/min，1.5mpa作为最大柱压值，紫外检测器波长为280nm，收集每个吸收峰下洗脱液；
(3)筛选所述洗脱液中比酶活为3～5u/μg，酶活＞0.6u/ml，且与氯化血红素结合能力kd值<3.50μm的部分，得到所述豇豆血红素铁结合蛋白。
优选的，步骤(1)所述豇豆粉碎后过100目筛，收集筛下成分，得豇豆粉；所述豇豆粉与所述pb缓冲溶液的质量体积比为1g：(20～30)ml。
优选的，步骤(1)所述震荡提取的温度为38～42℃，震荡频率为10～20rpm，提取的时间为25～40min。
优选的，步骤(2)所述凝胶过滤层析柱包括superdex-75凝胶过滤层析柱。
优选的，步骤(2)得所述洗脱液后，还包括以流动相的进样体积作为横坐标，280nm吸收值为纵坐标绘制分离纯化曲线，同时根据洗脱峰的酶活、蛋白质含量测算比酶活。
本发明还提供了利用所述制备方法制备得到的豇豆血红素铁结合蛋白，所述豇豆血红素铁结合蛋白对有机磷和氨基甲酸酯类农药敏感，所述豇豆血红素铁结合蛋白的酶活≥0.6u/ml，比酶活≥3.5u/μg，与氯化血红素结合的kd值<3.50μm。
本发明还提供了所述豇豆血红素铁结合蛋白在检测果蔬农药残留中的应用。
优选的，所述检测果蔬农药残留的方法包括酶抑制法，以吲哚乙酸酯为底物检测酶活的酶抑制法，通过酶抑制率判定样品中是否含有农药。
优选的，所述果蔬农药残留包括有机磷和氨基甲酸酯类农药。
本发明还提供了一种检测果蔬农药残留的试剂盒，所述试剂盒包括所述豇豆血红素铁结合蛋白。
本发明提供了一种豇豆血红素铁结合蛋白的制备方法，以耐热性强、适应各种条件、在不同环境中能良好的生长的豇豆种子为原材料提取豇豆粗酶液，并将提取液进一步分离纯化，具有产量大和来源广的优势。
本发明利用比色法和荧光法研究了所述豇豆血红素铁结合蛋白对农药毒死蜱、克百威的敏感性；同时还利用native-page对农药敌敌畏进行敏感性检测，发现所述豇豆血红素铁结合蛋白对上述农药都有较好的敏感性，因而有很大的优势可以作为替代酶源用于酶抑制法的农残快检中。
附图说明
图1为豇豆酯酶凝胶过滤纯化图；
图2为比色法检测10个峰的酶活性；
图3为荧光法检测凝胶层析分离纯化10个峰的酶活性；
图4为豇豆酯酶凝胶层析后活性峰的sds-page电泳图；
图5为比色法农药敏感性研究方法流程图；
图6为荧光法农药敏感性研究方法流程图；
图7为豇豆血红素铁结合蛋白与氯化血红素的结合曲线；
图8为比色法检测两种农药对ⅰ、ⅲ、ⅴ的抑制曲线，其中a为毒死蜱，b为克百威；
图9为荧光法检测两种农药对ⅰ、ⅲ、ⅴ的抑制曲线，其中a为毒死蜱，b为克百威；
图10为豇豆酯酶与猪肝酯酶对敌敌畏的native-page的1-na染色图，其中左图未经农药处理，右图经农药处理；
图11为豇豆酯酶与猪肝酯酶对敌敌畏的native-page的r250染色图，其中左图未经农药处理，右图经农药处理。
具体实施方式
本发明提供了豇豆血红素铁结合蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)将豇豆粉碎后与pb缓冲溶液混合后，震荡提取，静置2h后，离心得上清液；
(2)将所述上清液过凝胶层析柱分离纯化，以pb缓冲液作为流动相，流速设置为0.75ml/min，1.5mpa作为最大柱压值，紫外检测器波长为280nm，收集每个吸收峰下洗脱液；
(3)筛选所述洗脱液中比酶活为3～5u/μg，酶活＞0.6u/ml，且与氯化血红素结合能力kd值<3.50μm的部分，得到豇豆血红素铁结合蛋白。
本发明将豇豆粉碎后与pb缓冲溶液混合后，恒温震荡提取，静置2h后，离心得上清液。本发明在所述豇豆粉碎后优选过100目筛，收集筛下成分，得豇豆粉；所述豇豆粉与所述pb缓冲溶液的质量体积比优选为1g：(20～30)ml，更优选为1g：(22～28)ml，最优选为1g：25ml。本发明对所述pb缓冲溶液的来源并没有特殊限定，优选的浓度为0.02mol/l，ph值6.5。本发明将混合后得到的混合液震荡提取，所述震荡提取优选在恒温条件下进行，所述恒温优选为38～42℃，更优选为40℃。本发明所述震荡的频率优选为10～20rpm，更优选为15rpm。本发明所述提取的时间优选为25～40min，更优选为30min。本发明在所述恒温震荡提取后静置2h，离心得上清液。本发明所述静置的温度优选为4℃。本发明所述离心的转速优选为8000rpm，所述离心的时间优选为10min，所述离心温度为4℃。本发明对所述豇豆的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售豇豆属(vigna)植物的种子即可。
本发明将所述上清液过凝胶过滤层析柱，以pb缓冲液(0.02mol/l，ph6.5)作为流动相，样液流速设置为0.75ml/min，1.5mpa作为最大柱压值，紫外检测器波长280nm，收集每个吸收峰下的洗脱液。本发明得所述上清液后，利用蛋白纯化系统，优选以superdex-75凝胶过滤层析柱进行纯化分离。在本发明中，共可得到10个洗脱峰的洗脱液，在得所述洗脱液后，优选还包括以流动相的进样体积作为横坐标，280nm吸收值为纵坐标绘制分离纯化曲线，同时根据洗脱峰的酶活、蛋白质含量测算比酶活，采用微量热泳动法检测所得蛋白与氯化血红素的结合能力。本发明在得到所述洗脱液后，优选采用荧光底物法检测酶活性，采用bca法检测蛋白质浓度。本发明在检测所得蛋白与氯化血红素的结合能力时，优选以血红素铁结合蛋白特异性底物氯化血红素为配体，采用微量热泳动法检测所得蛋白与氯化血红素的结合能力，结合曲线如图7所示。本发明所述比酶活优选为酶活/蛋白质含量。本发明所述与氯化血红素的结合能力以kd值表示。
本发明筛选所述洗脱液中比酶活为3～5u/μg，酶活＞0.6u/ml，且与氯化血红素结合能力kd值<3.50μm的部分，得豇豆血红素铁结合蛋白。
本发明还提供了利用所述制备方法制备得到的豇豆血红素铁结合蛋白，所述豇豆血红素铁结合蛋白对有机磷和氨基甲酸酯类农药敏感，所述豇豆血红素铁结合蛋白的酶活为0.6u/ml，比酶活为3.5u/μg。本发明所述豇豆血红素铁结合蛋白能与氯化血红素结合，且kd值为3.05μm。本发明所述豇豆血红素铁结合蛋白的氨基序列编码为与豇豆(vigna)的albumin-2-like蛋白序列相同(xp_017414661.1)。
本发明还提供了所述豇豆血红素铁结合蛋白在检测果蔬农药残留中的应用。
本发明所述检测果蔬农药残留的方法优选包括酶抑制法；所述果蔬农药残留优选包括毒死蜱、克百威和敌敌畏，因此可将所述豇豆血红素铁结合蛋白用于检测果蔬农药残留，如制备试剂盒或试纸条等。本发明对所述酶抑制法的具体操作步骤并没有特殊限定，利用本领域的常规操作步骤即可。
本发明还提供了一种检测果蔬农药残留的试剂盒，所述试剂盒包括所述豇豆血红素铁结合蛋白。
下面结合实施例对本发明提供的豇豆血红素铁结合蛋白及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
豇豆血红素铁结合蛋白的提取与纯化
将豇豆种子研磨成粉末状100目过筛，按料液比1:25(g：ml)以pb缓冲液混合，在恒温条件下(40℃)15rpm振荡提取30min后，4℃静置2h，4000rpm离心15min，取上清液保存于4℃。利用蛋白纯化系统，选择superdex-75凝胶过滤层析柱，以pb缓冲液(0.02mol/l，ph6.5)作为流动相，样液流速设置为0.75ml/min，设置1.5mpa作为最大柱压值，紫外检测器波长为280nm。收集每个峰下的洗脱液。
豇豆血红素铁结合蛋白分离纯化结果
豇豆血红素铁结合蛋白凝胶层析分离纯化结果
将流动相的进样体积作为横坐标，uv-280nm响应值作为纵坐标，制作superdex-7510/300gl的分离纯化曲线，结果如图1所示，豇豆酯酶经过凝胶过滤superdex-75层析后，分离出了10个峰，依据出峰顺序依次编号ⅰ～ⅹ，其中iii号纯化酶为所述豇豆血红素铁结合蛋白。
豇豆血红素铁结合蛋白凝胶层析纯化酶筛选结果
将收集的10个峰经过比色法与荧光法的酶活性检测，结果如图2和图3所示，ⅰ至ⅵ号纯化酶其活性较高；则检测ⅰ～ⅵ号纯化酶的蛋白含量与sds-page电泳图，结果见表1与图4，比酶活较高的有ⅰ、ⅲ、ⅳ、ⅴ号纯化酶，其比酶活分别为7.375u/μg、3.824u/μg、6.074u/μg、3.657u/μg，由凝胶过滤纯化图可以看出ⅳ和ⅴ号纯化酶是相邻峰，且ⅳ测出的酶活0.213u/ml，酶活相对较低，为了进一步得知纯化后的峰对农药的敏感性，通过酶活、蛋白浓度、比酶活综合分析，可选择ⅰ、ⅲ、ⅴ号纯化酶与几种不同农药反应，筛选出对农药敏感性高的纯化酶。
表1豇豆粗酯酶凝胶层析纯化结果
其中，比色法农药敏感性研究方法(农药为毒死蜱和克百威)流程如图5所示：在96孔板中，采用多功能酶标仪spectramax进行检测。取pb缓冲液(0.02mol/l，ph6.5)和待检酶液加入，然后加入已知浓度的农药，充分混合，在一定条件下抑制一段时间，再加入底物1-na，混合均匀，在一定条件下反应一段时间，最后加入显色剂固蓝b盐，混合均匀。将不加农药加待检豇豆血红素铁结合蛋白液的孔作为无抑制对照组，将不加入豇豆血红素铁结合蛋白液和农药只含有pb缓冲液(0.02mol/l，ph6.5)的孔作为空白对照，在最大吸收波长处检测显色反应3min后的吸光度值，每组实验重复3次(n＝3)。
荧光法农药敏感性研究方法流程(农药为毒死蜱和克百威)如图6所示：在96孔板中，采用多功能酶标仪spectramax进行检测。取pb缓冲液(0.02mol/l，ph6.5)和酶液加入，然后加入已知浓度的农药，充分混合，在一定条件下抑制一段时间，再加入底物吲哚乙酸酯，充分混合，以激发光360(25)nm，发射光465(25)nm测定其荧光值。将不加农药加待检豇豆酯酶液的孔作为无抑制对照组，将不加入豇豆酯酶液和农药只含有pb缓冲液(0.02mol/l，ph6.5)的孔作为空白对照，在最大吸收波长处检测显色反应3min后的吸光度值，每组实验重复3次(n＝3)。
冻干后的豇豆血红素铁结合蛋白溶解后加入1×蛋白上样缓冲液，在沸水浴中加热3min后冷却，在常温、6000rpm、3min条件下离心，取离心后的上清液上样进行sds-page电泳分离，电泳完成后，采用考马斯亮蓝r-250染色液对page胶进行染色。具体方法如下:电泳后的page胶置于培养皿中，加入染液染色过夜，再用脱色液对page胶进行脱色，直至能显现蛋白条带。
比色法与荧光法检测筛选豇豆血红素铁结合蛋白对农药敏感性结果如图8～9和表2所示，两种方法对同一酶的检测结果有一定的差异性，其中ⅰ与ⅴ号纯化酶的差异较大，用荧光法检测ⅰ号纯化酶对毒死蜱的过程中，不同浓度的毒死蜱对ⅰ号纯化酶的抑制率所得拟合曲线的相关性太低，导致曲线无法拟合；用比色法检测ⅴ号纯化酶对克百威的过程中，从1×10-7mol/l起低浓度的克百威无法抑制ⅴ号纯化酶的酶活，所检测的吸光值会超过阳性对照，使所得抑制率结果为负值，且相关性太低，导致曲线无法拟合；从相关性与ic50结果可知，ⅲ号纯化酶检测结果要优于ⅰ号纯化酶与ⅴ号纯化酶检测结果。
表2ⅰ、ⅲ、ⅴ对农药敏感性分析结果
注：-表示曲线无法拟合。
豇豆血红素铁结合蛋白native-page对农药敏感性检测结果
采用native-page测定豇豆血红素铁结合蛋白的活性及其对农药的敏感性。配制native-page的8％分离胶和50％浓缩胶。待测豇豆粗酶液按照4:1的比例加入5×native-page蛋白上样缓冲液，冻干后的纯化豇豆血红素铁结合蛋白溶解后加入1×native-page蛋白上样缓冲液，将样品上样进行native-page分离。
电泳完成后，采用底物1-na与固蓝b盐显色剂对胶进行染色具体方法如下：将电泳后的胶置于装有10-4mol/l的敌敌畏农药溶液的培养皿中静置反应20min；去除农药溶液，再加入5mg/ml的1-na底物溶液中静置反应20min；去除底物溶液，再加固蓝b盐显色剂静置显色20min；去除显色剂，观察胶的显色情况。
豇豆血红素铁结合蛋白对农药敌敌畏native-page图谱如图10～11所示。因为猪肝酯酶对农药敌敌畏很敏感，所以选择猪肝酯酶作为阳性对照组。从1-na染色(图10)上可以看出3种酶在胶条上都具有活性，敌敌畏对豇豆ⅲ号纯化酶与豇豆粗酶的主要抑制条带集中在顶部的第一个蛋白条带上，对猪肝酯酶的主要抑制条带在第二个蛋白条带上。经过敌敌畏抑制后的图再经过r250染色后，蛋白条带又显现出来，说明豇豆酯酶中的蛋白酶已存在于胶条中但酶活受到农药的抑制而没有条带。为了使所得到的ⅲ号纯化酶进一步得到纯化，可将ⅲ号纯化酶的顶部第一条酶活性条带切割后，用缓冲液提取蛋白用sds-page电泳分析，分子量为27.5kd。
实施例2
样品提取，分别称取10g匀浆破碎后的混合有机磷农药的样品和25ml丙酮混合，涡旋震荡浸提10min，然后过滤除杂，用35℃的氮气吹干丙酮，加入磷酸盐缓冲液定容至1000μl；
增敏处理，1000μl样品提取液中，加入300μl的0.05％次氯酸钙溶液，30℃氧化反应15min，再加入300μl的10％亚硝酸钠溶液，30℃还原反应15min，得到待测液；
酶抑制检测，在酶标板中，取75μl的待测液，再加入50μl的50μg/ml的纯化豇豆血红素铁结合蛋白工作液，混合均匀，35℃恒温抑制15min，与100μlpb缓冲液(0.02mol/l，ph6.5)混合，再加入50μl的反应底物吲哚乙酸酯，混合均匀，以激发光360(25)nm，发射光465(25)nm检测10min内荧光值的变化。以75μlpb缓冲液(0.02mol/l，ph6.5)替代待测样品液的孔作为无抑制对照组，每组实验重复3次(n＝3)以下列公式计算酶抑制率，以抑制率大于50％为含有农药的阈值。
酶抑制率计算公式为：
上式中：
flu对照——对照组荧光值变化；
flu样品——样品组荧光值变化。
将所述豇豆血红素铁结合蛋白有机磷和氨基甲酸酯农药的ic50测算数据进行统计，如表3所示：
表3豇豆血红素铁结合蛋白对常用有机磷和氨基甲酸酯农药的ic50
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.豇豆血红素铁结合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将豇豆粉碎、与pb缓冲溶液混合后，震荡提取，静置2h后，离心得上清液；
(2)将所述上清液过凝胶层析柱分离纯化，以pb缓冲液作为流动相，流速设置为0.75ml/min，1.5mpa作为最大柱压值，紫外检测器波长为280nm，收集每个吸收峰下洗脱液；
(3)筛选所述洗脱液中比酶活为3～5u/μg，酶活＞0.6u/ml，且与氯化血红素结合能力kd值<3.50μm的部分，得到豇豆血红素铁结合蛋白。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(1)所述豇豆粉碎后过100目筛，收集筛下成分，得豇豆粉；所述豇豆粉与所述pb缓冲溶液的质量体积比为1g：(20～30)ml。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(1)所述震荡提取的温度为38～42℃，震荡频率为10～20rpm，提取的时间为25～40min。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(2)所述凝胶过滤层析柱包括superdex-75凝胶过滤层析柱。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(2)得所述洗脱液后，还包括以流动相的进样体积作为横坐标，280nm吸收值为纵坐标绘制分离纯化曲线，同时根据洗脱峰的酶活、蛋白质含量测算比酶活。
6.利用权利要求1～5任一项所述制备方法制备得到的豇豆血红素铁结合蛋白，其特征在于，所述豇豆血红素铁结合蛋白对有机磷和氨基甲酸酯类农药敏感，所述豇豆血红素铁结合蛋白的酶活≥0.6u/ml，比酶活≥3.5u/μg，与氯化血红素结合的kd值<3.50μm。
7.权利要求6所述豇豆血红素铁结合蛋白在检测果蔬农药残留中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述检测果蔬农药残留的方法包括酶抑制法，以吲哚乙酸酯为底物检测酶活的酶抑制法，通过酶抑制率判定样品中是否含有农药。
9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述果蔬农药残留包括有机磷和氨基甲酸酯类农药。
10.一种检测果蔬农药残留的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求6所述豇豆血红素铁结合蛋白。
技术总结