本发明属于生物
技术领域：
，特别涉及一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用。
背景技术：
：国外对木聚糖酶的研究始于20世纪50年代，从菌种构建到产品研发和生产都比较完善，可运用工业化大批量的生产木聚糖酶。目前研究的热点主要集中在微生物木聚糖酶基因的克隆与表达，木聚糖酶的调控机理与诱导、提纯与鉴定，利用纳米技术制备固定化酶等方面。我国对木聚糖酶的研究较晚，目前的研究主要是产木聚糖酶优良菌株的筛选及驯化，产酶条件的优化，酶的纯化和理化性质的研究，木聚糖酶基因克隆、表达和重组等方面。对于适用于造纸业的碱性木聚糖酶，国际上仅有少数可用于工业化生产的碱性木聚糖酶，而在国内还没有一种同时具备嗜热嗜碱这两种性质的木聚糖酶在造纸工业批量使用。因此，急需利用各种技术筛选适合造纸工业生产的碱性木聚糖酶。碱性木聚糖酶是指最适反应条件为碱性的木聚糖酶。1973年，horikoshi等从嗜碱芽孢杆菌bacillussp.c-59-2中第一次分离得到嗜碱木聚糖酶。嗜碱木聚糖酶由于其独特的高ph耐受性，在造纸工业中，可以将蒸煮过程中再吸附和沉积在纤维表面上木聚糖降解成低聚木糖或木糖，使纤维表面和内部微观结构发生变化，增加漂白化学品对纸浆纤维的可及性，使后续漂白处理时漂白剂易于与残余木素作用，减少漂白过程的漂剂用量，其生物特性与造纸工艺合理衔接，具有广阔的应用前景。虽然国内外对于木聚糖酶的研究已经有了一定的基础，但迄今为止能够进行大规模生产的高酶活的优良菌株依然不多。不同的行业需要不同特性的酶，为了得到性状优良的、适用于造纸工业的碱性木聚糖酶，方法之一是通过蛋白质工程和基因工程对现有的木聚糖酶进行改造，提高其耐热和耐碱性。二是从极端环境(盐碱地、盐碱沙漠、碱湖和造纸工业的废水)中发掘木聚糖酶资源。利用天然资源从自然界中筛选优良性能的菌株是一种相当有效的手段。因此，亟待筛选获得适合造纸、洗涤等工业生产的碱性木聚糖酶及菌株。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种碱性木聚糖酶wmn1基因的核苷酸序列及其氨基酸序列。本发明根据木聚糖酶保守序列设计简并引物，用pcr的方法成功克隆出碱性木聚糖酶的酶基因。本发明的另一目的在于提供一种含有上述wmn1基因的表达载体。本发明的另一目的在于提供含有上述wmn1基因的大肠杆菌菌株。本发明的再一目的在于提供上述重组碱性木聚糖酶wmn1的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种碱性木聚糖酶wmn1基因，所述wmn1基因的核苷酸序列如seqidno：6所示。所述碱性木聚糖酶wmn1基因序列为一个完整的开放阅读框(orf)，该开放阅读框以起始密码子atg开始而以终止密码子taa结束，共包括1308个核苷酸。上述碱性木聚糖酶wmn1基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seqidno：7所示。碱性木聚糖酶wmn1基因开放阅读框编码435个氨基酸。一种含有本发明wmn1基因的表达载体。所述的表达载体为适于在大肠杆菌中表达的载体。本发明的wmn1基因被插入至pet-28a( )载体中。本发明的wmn1基因被插入至pet-28a( )载体中的ndei和xhoi酶切位点之间；含有本发明的wmn1基因的大肠杆菌菌株。所述的大肠杆菌菌株含有本发明的表达载体。一株表达碱性木聚糖酶wmn1的菌株，是将上述核苷酸序列构建成载体后转染到大肠杆菌(escherichiacoli，e.coli)bl21star(de3)得到。一株表达碱性木聚糖酶wmn1的菌株的制备方法，包括如下步骤：用pcr方法从bacillussp.wmn1(cctccno：m2020007)的基因组dna中克隆出酶基因全长，将其插入到原核表达载体pet-28a( )中，得到重组质粒pet-28a-wmn1，并转化大肠杆菌e.coli(escherichiacoli)bl21star(de3)菌株；经过筛选后得到表达所述的碱性木聚糖酶wmn1的重组大肠杆菌菌株e.colibl21star(de3)-wmn1；所述的pcr的所用的引物的序列：上游引物f2：5′-catatggggcacattcatcccct-3′；(下划线的序列表示的是ndei酶切位点)下游引物r2：5′-ctcgagttacgccaagtttgcacgc-3′；(下划线的序列表示的是xhoi酶切位点)所述的碱性木聚糖酶wmn1在造纸、洗涤等工业中的应用。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)根据酶基因序列blast分析结果结合酶蛋白在分子量及酶学特性等方面与己知蛋白的差异判断，碱性木聚糖酶基因wmn1为新的木聚糖酶基因。(2)利用阴离子交换层析分离到分子量约为42kda的重组酶蛋白。重组碱性内切木聚糖酶wmn1蛋白在最适作用ph、最适作用温度及对金属离子的耐受性等方面与野生酶基本一致。但重组碱性木聚糖酶对sds具有非常良好的耐受性，与sds对野生酶活性有部分抑制作用不同。重组碱性内切木聚糖酶在终浓度为1.5％的市售立白洗衣粉中的稳定性显著优于其天然的酶蛋白，显示重组酶制剂在洗涤剂等工业中的良好应用价值。附图说明图1是1％琼脂糖凝胶电泳结果；其中，a：bacillussp.wmn1基因组；b：touchdownpcr克隆wmn1木聚糖酶基因保守序列电泳图，m为dnaladdermarker，1为wmn1保守序列；c：wmn1保守序列的上游基因电泳图，m为dnaladdermarker，1为wmn1木聚糖酶基因保守序列上游基因；d：wmn1保守序列的下游基因电泳图，m为dnaladdermarker，1为wmn1木聚糖酶基因保守序列下游基因。图2是重组质粒pet-28a-wmn1的酶切鉴定；其中，m：marker1：ndei和xhoi双酶切；2：ndei单酶切；3：xhoi单酶切；4：重组质粒pet-28a-wmn1。图3是重组质粒pet-28a-wmn1在e.colibl21star(de3)中诱导不同时间的表达电泳图谱；m：蛋白marker；1：无iptg诱导的沉淀；2：1mmiptg诱导1h的沉淀；3：1mmiptg诱导3h的沉淀；4：1mmiptg诱导6h的沉淀；5：1mmiptg诱导12h的沉淀；6：1mmiptg诱导24h的沉淀。图4是不同诱导温度对重组碱性木聚糖酶活性的影响。图5是重组碱性木聚糖酶wmn1蛋白纯化电泳图；其中，m：marker；1：重组碱性木聚糖酶液氮反复冻融破碎上清液；2：液氮破碎细胞上清液过deaesepharosefastflow后的具有酶活性的峰液。图6是bacillussp.wmn1木聚糖酶阴离子交换图谱。图7是bacillussp.wmn1木聚糖酶分离纯化的电泳图谱，其中m：蛋白marker；1：bacillussp.wmn1粗酶液；2：deaesepharosefastflow阴离子层析的酶活峰液；3：superdex75凝胶过滤层析的酶活峰液。图8是重组碱性木聚糖酶wmn1的最适反应温度。图9是重组碱性木聚糖酶wmn1的温度稳定性。图10是重组碱性木聚糖酶wmn1的最适反应ph。图11是重组碱性木聚糖酶wmn1的ph稳定性。图12是金属阳离子和表面活性剂对重组碱性木聚糖酶wmn1酶活力的影响。图13是洗衣粉浓度对重组碱性木聚糖酶wmn1酶活的影响。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。实施例1(一)材料(1)菌种：嗜碱芽孢杆菌，是从土壤中筛选得到的一株具有产碱性木聚糖酶活力的菌株bacillussp.wmn1。所述菌株保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期：2020年1月3日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：cctccno：m2020007。宿主菌e.colidh5α购自invitrogen公司。(2)载体：大肠杆菌克隆载体pmd19-tvector，具有ampr抗性标志，购自takara(大连)宝生物公司。(3)培养基lb培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，固体培养基中加入15～20g琼脂，定容至1l，121℃高压灭菌20min。1％琼脂糖凝胶：1g琼脂糖溶解于100ml1×tae缓冲液中，再加入5μlgoldview。amp：溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。过滤除菌后分装成小份于-20℃贮存。以50μg/ml的终浓度添加于培养基中。kan：溶解0.5g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。过滤除菌后分装成小份于-20℃贮存。以50μg/ml的终浓度添加于培养基中。(4)主要试剂：细菌基因组提取试剂盒、pcr产物纯化试剂盒均购于generay公司；gelextractionkit为omega公司生产；m5plasmidminipreppluskit为聚合美公司生产；所用的简并引物、特异性引物和随机引物均为广州invitrogen公司合成。核酸染料goldenview为bioteke公司生产，lataq酶、extaq酶、限制性内切酶购于takara公司，dnamarker购于生工生物工程(上海)有限公司。其他试剂均为国产分析纯。(5)仪器：thermo高速冷冻离心机、bio-rad电泳仪、gehealthcare快速蛋白层析系统、thermo超微量紫外分光光度计、thermo低温培养箱、eppendorf大容量高速冷冻离心机、bio-radpcr仪、振荡摇床、压力蒸汽灭菌锅、millipore超纯水机、凝胶成像系统、分光光度计、电子天平、水浴锅、电热恒温培养箱、搅拌器、微波炉、鼓风干燥箱、eppendorf移液器、biotek酶标仪。(二)实验方法1、目标菌株的筛选(1)富集培养：称取1g采集的土样，充分混匀在100ml的无菌水中，制成菌悬液后，取1ml菌悬液加入到灭菌的5ml富集培养基中，37℃富集培养48h。富集培养基：木聚糖8.0g，蛋白胨10g，nacl15g，kh2po41.5g，na2hpo4·12h2o9.0g，mgso4·7h2o2.0g，定容至1lddh2o，ph9.0。(2)平板初筛：将富集培养后的菌液10倍逐级稀释，分别取稀释倍数为10-3、10-5、10-7的菌悬液0.5ml涂布于含有木聚糖的碱性选择培养基平板上，37℃培养48h，筛选出透明圈较大的单菌落挑入碱性斜面培养基，经多次筛选后得到单一菌落，并保藏为原始菌种。选择培养基：木聚糖8.0g，kno31.0g，mgso4·7h2o0.5g，nacl15g，kh2po41.5g，琼脂15～20g，溶于1lddh2o，ph9.0。碱性斜面培养基：葡萄糖10g/l，蛋白胨5g/l，酵母提取物5g/l，kh2po41g/l，mgcl20.2g/l，nacl50g/l，na2co310g/l，琼脂15～20g/l，ph9.0。(3)本文使用其中一株菌株作为研究，利用通用引物(27f和1492r)pcr扩增该菌株的16srdna序列，到genbank上进行比对，比对结果显示，该菌株的16srdna序列与其它多株芽孢杆菌的16srdna序列有99％的相似性，初步确定为芽孢杆菌(bacillussp.)，将其命名为bacillussp.wmn1。所述的bacillussp.wmn1菌株的16srdna序列如seqidno：1所示，其长度为1456bp。2、bacillussp.wmn1基因组dna的提取使用genray细菌基因组dna提取试剂盒进行bacillussp.wmn1基因组的提取，步骤如下：柱子准备：在gdnarecoverycolumn中加入200μlbuffercbs，10000rpm离心1min，弃透过液，备用。(1)取1ml过夜培养菌液，8000rpm，离心1min，彻底弃净培养基。(2)加入150μlte(ph8.0)悬浮细菌，加入lysozyme溶液8μl，用吸头混匀，室温酶解5～10min。(3)加入300μldigestionsolution，混匀；加入4μlrnasea混匀，55℃保温10min；再加入4μlproteinasek，55℃保温10～30min。将混合液全部转移到套放2ml收集管内的gdnarecoverycolumn柱中(如获得的裂解液粘稠度较低，则直接添加300μlpbsolution，充分摇动混匀，12000rpm室温离心5min，将上清全部转移到套放2ml收集管内的gdnarecoverycolumn柱中。如获得的裂解液过于粘稠，则依次添加300μlextsolution以及300μlpbsolution充分摇匀，12000rpm室温离心5min，上层溶液为蓝色，基因组dna存在于下层溶液中，用1mltip头伸到下层，将下层溶液全部转移到套放于2ml收集管内的gdnarecoverycolumn柱中。)(4)8000rpm室温离心1min。取下gdnarecoverycolumn柱，弃去收集管中的废液。(5)将gdnarecoverycolumn柱放回收集管中，加入500μlwashsolution，8000rpm，室温离心1min。取下gdnarecoverycolumn柱，弃去收集管中的废液。(6)重复步骤5一次。(7)将gdnarecoverycolumn柱放回收集管中，12000rpm，室温离心1min，以去除残留的washsolution。(8)将gdnarecoverycolumn柱放入新的洁净的1.5ml离心管中，在gdnarecoverycolumn柱中央加入50～100μlelutionbuffer，室温或37℃放置2min。(9)12000rpm，室温离心1min。离心管中的液体即为基因组dna，-20℃保存。3、bacillussp.wmn1木聚糖酶基因的保守序列及其侧翼序列3.1、touchdownpcr克隆木聚糖酶基因保守序列(1)使用primerpremier5.0软件设计上下游引物。根据已知的10家族木聚糖酶保守序列设计上游简并引物(5′-ctctggaagccnayncmrtsna-3′)和下游简并引物(5′-gactgggaygtngtnaayga-3′)，送去合成。(2)使用takara的pcramplificationkit试剂盒，以基因组dna为模板，按照如下反应体系配制pcr反应液：然后按照以下条件进行touchdownpcr反应：采用1％琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行检测。3.2、touchdownpcr产物回收pcr产物回收使用的是omega公司生产的gelextractionkit(100)d2500-01，主要步骤如下：(1)在紫外灯下切出含有目的dna的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，此时应注意尽量切除不含目的dna部分的凝胶，减小凝胶体积，提高dna回收率，之后放入ep管中。(注意切胶时不要将dna长时间暴露于紫外灯下，以防止dna损伤)(2)切碎胶块。胶块切碎后可以加快胶块融化时间，提高dna的回收率。称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg＝1μl进行计算，向胶块中加入等量的胶块融化液bindingbuffer。(3)50℃溶解7～15分钟，保证溶胶要完全，否则会影响后续回收。(4)将溶胶放入层析柱中(不超过700μl)，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。(5)加入300μl的bindingbuffer，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。(6)加入700μl的spw，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。(7)重复步骤(6)。(8)将空柱13000rpm离心2min，以去掉残存的乙醇，否则会严重影响后续dna的回收。(9)弃掉收集管，换成干净的ep管，往吸附柱正中间的吸附膜小心加入15μlelutionbuffer，室温静置3min，13000rpm离心2min，保存于-20℃冰箱中。3.3、e.colidh5α感受态细胞的制备(1)蘸取菌种dh5α，在lb平板上划线，待长出单菌落将其接种于10mllb液体培养基中，37℃，200rpm摇床过夜培养；(2)取过夜摇床的菌液0.5ml，加入50mllb液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养，待od600nm在0.3～0.6时，将菌液收集起来，放置在冰上；(3)4℃，5600rpm离心10min，去掉上清液，加入冰预冷的0.1mol/lcacl210ml轻轻悬浮菌体，冰浴；(4)重复步骤3；(5)加入1.5ml0.1mol/lcacl2和0.5ml60％甘油轻轻悬浮菌体，分装在1.5ml离心管中，每管100μl，于-80℃保存备用。3.4、touchdownpcr产物的连接、转化和测序(1)将4μl回收的pcr产物、1μlpmd-19tsimplevector和5μlsolutioni(takara公司生产)混匀，16℃水浴连接3h。(2)从-80℃冰箱中取100μl感受态细胞悬液，冰中使其解冻。(3)将连接好的产物加入感受态细胞中轻轻摇匀，冰上放置30min。(4)42℃水浴中放置90s，之后迅速置于冰上冷却15min。(5)向管中加入1mllb液体培养基，混匀后37℃、250rpm振荡培养1h。(6)培养后的菌液于6000rpm离心5min，去除部分上清，剩下的混匀。取100μl涂布于含氨苄青霉素的筛选平板上，37℃培养16～24h。(7)用接种环挑选长出的单菌落放于1mllb培养基(含氨苄青霉素)中，37℃、250rpm过夜摇菌，每组选取1个送去测序。3.5、tail-pcr克隆木聚糖酶基因保守序列的上下游基因(1)tail-pcr是为了得到wmn1木聚糖酶基因保守序列上游和下游的基因，使用primerpremier5.0软件设计特异性引物和随机引物。根据touchdownpcr产物测序所得到的保守序列，分别设计2组20bp左右的上下游特异性引物，每组上游特异性引物(upstreamprimer，简称usp)和下游特异性引物(downstreamprimer，简称dsp)各有3个嵌套的引物用于tail-pcr的三轮反应。同时设计出7对随机引物(arbitrarydegenerateprimer，简称ad)。保守序列和引物序列见表1。引物送去合成后，即可进行下一步实验。表1bacillussp.wmn1保守序列及用于tail-pcr的引物名称序列(5′-3′)保守序列如seqidno：2所示(243bp)usp1tccagtccgttgagtagtcgusp2gtcagcggcacgggcagcausp3accaagcacccgctggaagadsp1gccagtctgtcttccagcgggtdsp2aggctttccgtgctgcccgtgdsp3tgcccgtgccgctgacccad1agtgnwgwancaacgad2wgtgnagawncagasaad3tncsagtwtggwsttad4ctwsntactnctntgcad5tcwgncttantangtad6tgagnagwanstnagaad7ngwcsagwganatgaa(2)tail-pcr克隆上游基因使用takara的pcramplificationkit试剂盒，以基因组dna为模板，按照如下反应体系配制pcr反应液：然后按照以下条件进行第一轮tail-pcr反应：第二轮tail-pcr反应体系同第一轮，但是将第一轮反应的pcr产物用ddh2o稀释100倍后作为模板dna，usp1换为usp2，反应条件如下：第三轮tail-pcr反应体系同第一轮，但是将第二轮反应的pcr产物用ddh2o稀释100倍后作为模板dna，usp2换为usp3，反应条件同第二轮反应的一样。反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳对第三轮pcr产物进行检测。(3)tail-pcr克隆下游基因反应体系、反应条件同上游基因的克隆，相应的上游特异性引物换为下游特异性引物。反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳对第三轮pcr产物进行检测。3.6、tail-pcr产物回收方法同touchdownpcr产物回收。3.7、tail-pcr产物的连接、转化和测序方法同touchdownpcr产物的连接、转化和测序。4、bacillussp.wmn1木聚糖酶基因全长序列根据tail-pcr克隆得到的保守序列上下游基因的测序结果进行拼接，得到bacillussp.wmn1木聚糖酶基因全长序列。以bacillussp.wmn1的基因组为模板，使用上游引物f1：5′-atggggcacattcatcccct-3′和下游引物r1：5′-ttacgccaagtttgcacgc-3′进行常规pcr，回收pcr产物，与pmd19-t连接，得到pmd19-t-wmn1，并转化e.colidh5α感受态细胞中，得到含bacillussp.wmn1木聚糖酶基因全长的克隆菌株。(三)实验结果1、bacillussp.wmn1的基因组提取使用genray公司的细菌基因组提取试剂盒提取bacillussp.wmn1的基因组，之后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。由图1a可看出基因组的大小在10kb以上，可进行下一步实验。2、touchdownpcr克隆木聚糖酶基因保守序列结果2.1、touchdownpcr克隆保守序列的产物根据已知保守序列设计本次pcr上下游引物，使用touchdownpcr克隆wmn1木聚糖酶基因的保守序列，采用1％琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行检测，结果如图1b所示。在泳道1中，大小约为240bp的条带符合已知的10家族木聚糖酶基因保守序列大小，所以对该条带进行回收。2.2、木聚糖酶基因保守序列测序结果通过pcr产物回收、连接、转化、测序等步骤，得到wmn1木聚糖酶基因保守序列的测序结果，其序列如下：(1)基因序列(243bp)，如seqidno：2所示。(2)编码的氨基酸(81个)，如seqidno：3所示。2.3、ncbi氨基酸序列比对结果将该氨基酸序列在ncbi数据库上进行比对(blast)，发现该保守序列与同为10家族的木聚糖酶jonesiadenitrificans具有83％的相似性，可推断克隆的保守序列所在的基因属于10家族木聚糖酶基因。3、tail-pcr克隆木聚糖酶基因保守序列上游基因结果3.1、tail-pcr克隆保守序列上游基因的产物通过3个嵌套的上游特异性引物和随机引物ad进行tail-pcr，克隆出wmn1木聚糖酶基因保守序列的上游基因，其pcr产物电泳图如图1c所示。从图中可以看出，经过3轮pcr，此时出现的明显条带只有一条，大小约为750bp，符合目标基因大小要求，初步确定为保守序列上游基因，将其回收用于测序。3.2、保守序列上游基因测序结果经过测序，wmn1木聚糖酶基因保守序列上游基因测序结果如seqidno：4所示(711bp)，其中，1～20bp为usp3。4、tail-pcr克隆木聚糖酶基因保守序列下游基因结果4.1、tail-pcr克隆保守序列下游基因的产物通过3个嵌套的下游特异性引物和随机引物ad进行tail-pcr，克隆出wmn1木聚糖酶基因保守序列的下游基因，其pcr产物电泳图如图1d所示。从图中可以看出，经过3轮pcr，此时出现的明显条带只有一条，大小约为600bp，符合目标基因大小要求，初步确定为保守序列下游基因，将其回收用于测序。4.2、保守序列下游基因测序结果经过测序，wmn1木聚糖酶基因保守序列下游基因测序结果如seqidno：5所示(637bp)，其中，1～18bp为dsp3。5、完整的酶基因序列及其编码的氨基酸序列5.1、完整的酶基因序列将上下游tail-pcr的产物测序结果参照保守序列进行拼接，得到wmn1木聚糖酶基因一个以atg开始、以taa结束的完整开放阅读框(orf)，长度为1308bp。其核苷酸序列如seqidno：6所示。5.2、编码的氨基酸序列该基因编码的氨基酸个数为435个，氨基酸序列如seqidno：7所示。5.3、ncbi氨基酸序列比对结果将该氨基酸序列在ncbi数据库进行比对(blast)，发现该氨基酸序列与同为10家族的木聚糖酶jonesiaquinghaiensis具有83％的相似性，可初步推断编码该氨基酸序列的基因为新的木聚糖酶基因。实施例2(一)材料1、菌种：嗜碱芽孢杆菌bacillussp.wmn1(cctccno：m2020007)。宿主菌e.colidh5α，表达宿主菌e.colibl21star(de3)均购自invitrogen公司。2、载体：大肠杆菌克隆载体pmd19-tvector，具有ampr抗性标志。大肠杆菌表达载体pet-28a( )含有kanr抗性标记，均购自takara(大连)宝生物公司。3、培养基及缓冲液lb培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，固体培养基中加入15-20g琼脂，定容至1l，121℃高压灭菌20min。1％琼脂糖凝胶：1g琼脂糖溶解于100ml1×tae缓冲液中，再加入5μlgoldview。100mmiptg：2.4giptg溶解在100mlddh2o中，0.45μm滤膜除菌，分装，-20℃保存。amp：溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。过滤除菌后分装成小份于-20℃贮存。以50μg/ml的终浓度添加于培养基中。kan：溶解0.5g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。过滤除菌后分装成小份于-20℃贮存。以50μg/ml的终浓度添加于培养基中。蛋白分离纯化缓冲液：tris-hcl缓冲液a(平衡缓冲液)：20mmtris，用hcl调节ph至8.0。tris-hcl缓冲液b(洗脱缓冲液)：20mmtris，1mnacl,用hcl调节ph至8.0。1％木聚糖溶液:1g木聚糖溶解于ph9.0的0.05mgly-naoh缓冲液中，定容至100ml，用前充分摇匀。gly-naoh缓冲液(0.05m)：甘氨酸3.8g，氢氧化钠0.35g，溶于1lddh2o，ph9.0。3,5-二硝基水杨酸(dns)溶液：准确称取dns7.5g、氢氧化钠14.0g(缓慢加入)、酒石酸钾钠216g、偏重亚硫酸钠6.0g，搅拌均匀，加入5.6ml预先在60℃水浴中融化的苯酚(有毒，带口罩)，充分溶解，加去离子水定容至1l，贮于棕色瓶中，室温下避光放置一周后使用。4、主要试剂：细菌基因组提取试剂盒、pcr产物纯化试剂盒均购于generay公司；gelextractionkit为omega公司生产；m5plasmidminipreppluskit为聚合美公司生产；所用的简并引物、特异性引物和随机引物均为广州invitrogen公司合成。核酸染料goldenview为bioteke公司生产，lataq酶、extaq酶、限制性内切酶购于takara公司，dnamarker、蛋白marker、iptg均购于生工生物工程(上海)有限公司。木聚糖生产于megazyme。阴离子交换层析介质deaesepharosefastflow为ge公司生产。10kda蛋白超滤管购于millipore公司。其他试剂均为国产分析纯。5、仪器：thermo高速冷冻离心机、bio-rad电泳仪、gehealthcare快速蛋白层析系统、thermo超微量紫外分光光度计、thermo低温培养箱、eppendorf大容量高速冷冻离心机、bio-radpcr仪、振荡摇床、压力蒸汽灭菌锅、millipore超纯水机、凝胶成像系统、分光光度计、电子天平、水浴锅、电热恒温培养箱、搅拌器、微波炉、鼓风干燥箱、eppendorf移液器、biotek酶标仪。(二)实验方法1、bacillussp.wmn1木聚糖酶基因在大肠杆菌里的表达1.1.重组质粒pet-28a-wmn1的构建提取pmd19-t-wmn1质粒，以此为模板，使用上游引物f2：(5′-catatggggcacattcatcccct-3′，其中，下划线的序列表示的是ndei酶切位点)和下游引物r2：(5′-ctcgagttacgccaagtttgcacgc-3′，其中，下划线的序列表示的是xhoi酶切位点)进行常规pcr，回收pcr产物，得到wmn1木聚糖酶基因全长。使用ndei、xhoi进行双酶切，与此同时将表达载体pet-28a( )也进行ndei、xhoi双酶切。酶切反应体系如下：酶切反应在37℃进行，酶切时间为30min。酶切完成后使用pcr产物纯化试剂盒分别对酶切产物进行回收，之后将wmn1与表达载体pet-28a( )连接起来，得到重组质粒pet-28a-wmn1。连接体系如下：在22℃水浴4h，之后转化大肠杆菌e.colibl21star(de3)感受态细胞中。1.2.e.colibl21star(de3)感受态细胞的制备e.colibl21star(de3)感受态细胞的制备与e.colidh5α感受态细胞的制备相同。1.3.转化e.colibl21star(de3)感受态细胞和培养(1)1μl重组质粒pet-28a-wmn1与100μl感受态细胞混匀，冰浴30min；(2)42℃热激90秒，冰浴10min；(3)加入1mllb液体培养基，37℃150r/min培养1h；(4)6000r/min离心1min，去掉部分上清，将剩下的菌液吹打混匀，吸取200μl在含kan的平板上涂布均匀，37℃培养过夜。(5)对照组以同体积的无菌水代替dna溶液，其它操作与上面相同。(6)挑取平板的阳性单克隆于含kan的液体培养基过夜摇床培养，用于质粒的提取，并进行甘油保种。1.4.使用m5plasmidminipreppluskit进行重组质粒的小量提取(1)柱平衡：向离心吸附柱中加入400μlbufferbl，静止1min，室温下12000rpm离心1min，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新放回收集管中。(2)取2ml过夜培养的菌液，室温12000rpm离心1min，尽量将上清去除干净。(3)加入250μlsolutioni，旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀。(4)加入250μlsolutionii，温和颠倒混匀6-8次，直到溶液变得清亮粘稠。(5)加入350μlsolutioniii，立即温和颠倒混匀6-8次，可见白色沉淀物产生，室温静置2min，然后12000rpm离心5min。(6)小心将上清液转移到离心吸附柱中，静置2min，让质粒dna与吸附柱中的硅胶膜充分结合。12000rpm离心30sec，弃收集管中滤液。(7)向吸附柱中加入500μlbufferwb1，12000rpm离心30sec，弃收集管中滤液。(8)加入500μlbufferwb2，室温12000rpm离心30sec，弃收集管中滤液。(9)重复步骤8一次。(10)室温12000rpm离心2min，甩干残留液体。(11)将离心吸附柱置于一个新的1.5ml离心管中，加入50-100μl的洗脱液buffereb(60℃预热)，室温放置2min。12000rpm离心1min，离心管底溶液即质粒dna。1.5.酶切鉴定。按下面体系配制酶切体系，分别进行双酶切鉴定和单酶切鉴定：1.6.重组大肠杆菌e.colibl21star(de3)-wmn1的诱导表达(1)将筛选得到的菌株e.colibl21star(de3)-wmn1接种到含有kan的20mllb液体培养基的摇瓶中培养过夜。(2)从上述菌液中取500μl接种到含kan抗性的50mllb培养基中37℃摇床培养。(3)待od值达到0.6时加入终浓度为1mm的iptg进行诱导。(4)分别在37℃诱导1h、3h、6h、12h、24h后取样，并分别对样品进行超声破碎，12000rpm高速离心，测上清液中酶活。1.7.sds-page蛋白电泳分析将37℃诱导1h、3h、6h、12h、24h后取样的菌液进行超声破碎，12000rpm高速离心，对破碎沉淀进行蛋白电泳。2、重组碱性木聚糖酶蛋白诱导表达条件的研究诱导温度对酶活的影响：在装有50mllb培养基的250ml摇瓶中加入500μl过夜培养的菌液，培养至od600为0.6时加入终浓度为1mm的iptg，置于不同温度(28℃、33℃、37℃)培养，定时取样并用液氮反复冻融法破碎细胞后测其上清酶活力。3、重组碱性木聚糖酶蛋白wmn1的分离纯化和酶学性质的研究3.1.重组碱性木聚糖酶蛋白wmn1的阴离子交换层析分离纯化使用的离子交换层析介质为deaesepharosefastflow。缓冲液体系为ph8.0的tris-hcl缓冲液，平衡液为ph8.0的tris-hcl缓冲液，洗脱液为含naclph8.0的tris-hcl缓冲液。取约60ml介质小心灌入规格为φ1.6cm×40cm的层析柱中，使得凝胶均匀且无气泡。用3～5倍柱体积的平衡液进行平衡，待a280稳定后将经液氮反复冻融的破碎上清液上样，穿透峰出现之后进行盐浓度梯度洗脱，分别收集不同盐浓度梯度洗脱出来的峰，检测各个峰的木聚糖酶酶活。具有酶活性的峰即为重组的碱性木聚糖酶的纯酶液。后进行sds-page蛋白电泳分析，剩下的纯酶液放4℃保存，用于后续的酶学性质研究。3.2嗜碱芽孢杆菌bacillussp.wmn1产生的碱性木聚糖酶的分离纯化1、粗酶液的制备将菌株bacillussp.wmn1在发酵培养基中进行液体发酵，在37℃，200rpm的培养条件下发酵5d，于4℃，12000rpm高速冷冻离心25min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，即得粗酶液。测定其内切木聚糖酶活性后，用于离子交换层析。2、碱性木聚糖酶的阴离子交换层析分离纯化使用的离子交换层析介质为deaesepharosefastflow。缓冲液体系为ph8.0的tris-hcl缓冲液，平衡液为ph8.0的tris-hcl缓冲液，洗脱液为含naclph8.0的tris-hcl缓冲液。取约60ml介质小心灌入规格为φ1.6cm×40cm的层析柱中，使得凝胶均匀且无气泡。用3～5倍柱体积的平衡液进行平衡，待a280稳定后上样(粗酶液)，穿透峰出现之后进行盐浓度梯度洗脱，分别收集不同盐浓度梯度洗脱出来的峰，检测各个峰的木聚糖酶酶活。使用10kda的超滤管将洗脱的具有酶活性峰进行浓缩脱盐，得到碱性木聚糖酶的酶液，即浓缩酶液。后进行sds-page蛋白电泳分析，剩下的浓缩酶液放4℃保存，用于后续的凝胶过滤。3、碱性木聚糖酶的凝胶过滤使用预装柱superdex75将进行过阴离子交换层析的浓缩酶液再次进行分离。缓冲液体系为ph8.0的tris-hcl缓冲液，用3～5倍体积缓冲液将a280基线冲洗至稳定状态后，取适量浓缩酶液上样，再用1个体积将样品进行洗脱，并收集洗脱峰液，即纯酶液，记为wmn1，进行酶活检测和蛋白电泳分析之后，用于酶学性质的研究。3.3.sds-page蛋白电泳分析(1)试剂的准备与配制10％过硫酸铵(w/v)：0.1g过硫酸铵溶解于1ml去离子水中，现配现用。30％丙烯酰胺、10％sds、ph8.8的分离胶缓冲液、ph6.8的浓缩胶缓冲液、10xtris-glycinesds电泳缓冲液(ph8.3)、5×蛋白质加样缓冲液；染色液：将2.5g考马斯亮兰r-250溶解于500ml甲醇，加入100ml冰醋酸，混匀，去离子水补至1l。脱色液：乙醇50ml，乙酸100ml，去离子水定容至1l。(2)sds-page凝胶的配制：a.按照下表配制10％的分离胶：表2sds-page凝胶分离胶配制b.按照下表配制5％的浓缩胶：表3sds-page凝胶浓缩胶配制c.待分离胶聚合之后，倒掉上层的水，加入浓缩胶，并插好梳子，直至完全聚合后开始sds-page凝胶电泳。(3)电泳的步骤：a.样品准备：在适量样品中加入5×loadingbuffer，沸水浴5min，然后12000rpm离心10min，取上清备用。b.向电泳槽的内外槽中加入现配的电泳缓冲液。c.上样：取30μl上述样品上清加入到孔道中，后加入5μl的预染蛋白marker。d.电泳：接通电源，并正确连接正负极，电压为120v，约50min，即待溴酚兰指示剂下行至凝胶底部停止电泳。e.染色：小心将凝胶从玻璃板上取下，加入适量考马斯亮兰染色液，在振荡摇床上染色20～30min。f.脱色：将染色液倒掉，用去离子水漂洗一两遍，然后加入脱色液，多次更换脱色液直至蛋白条带清晰可见。3.4.重组碱性木聚糖酶蛋白wmn1的酶学性质研究木聚糖酶酶活测定方法：以ph＝9.0的gly-naoh缓冲液制备的1％木聚糖溶液为底物，取其1ml，加入100μl经适当稀释的上述酶液，混匀，于45℃下振荡反应20min后，迅速加入1mldns(3,5-二硝基水杨酸)溶液，沸水浴10min，冷却后于540nm测定还原糖，并扣除空白试验测定值。将上述条件下每分钟由底物产生1μmol木糖所需的酶量定义为一个酶活力单位，用u/ml表示。(1)最适反应温度与温度的稳定性取适量稀释的纯酶液，分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下反应20min，dns法测定其酶活力，以此确定最适反应温度。研究温度的稳定性时，将适量稀释的纯酶液放置在不同的温度下保温1h，随后在45℃下反应20min测定其酶活力。(2)最适反应ph与ph的稳定性取适量稀释的纯酶液，分别在ph2、ph3、ph4、ph5、ph6、ph7、ph8、ph9、ph10、ph11、ph12下反应20min，dns法测定其酶活力，以此确定最适反应ph。研究ph的稳定性时，将适量稀释的纯酶液放置在不同的ph下保温1h，随后在ph9.0下反应20min测定其酶活力。(3)金属阳离子和表面活性剂对酶活力的影响在适量纯酶液中分别加入一定体积的金属阳离子溶液，使其终浓度为10mm；加入的edta的浓度为0.1％；加入的sds的浓度为0.05％和0.1％。均放置在37℃下保温30min后测定其酶活力。(4)洗衣粉对酶活力的影响在适量纯酶液中加入一定量的立白洗衣粉使其终浓度为0.5％、1％、1.5％、2％、5％，37℃保温30min，然后测定其酶活力。(三)实验结果1、重组质粒pet-28a-wmn1的构建提取质粒pmd19-t-wmn1，并以此为模板，使用上游引物f2和下游引物r2进行常规pcr，回收pcr产物，得到wmn1木聚糖酶基因全长。使用ndei、xhoi进行双酶切，与此同时将表达载体pet-28a( )也进行ndei、xhoi双酶切。酶切完成后对酶切产物进行回收，之后将wmn1与表达载体pet-28a( )连接起来，得到重组质粒pet-28a-wmn1。将重组质粒pet-28a-wmn1转化e.colibl21star(de3)感受态细胞，在含50μg/ml的卡那霉素平板上涂布培养。挑取阳性单克隆过夜摇床培养之后提取重组质粒进行质粒提取。将提取的质粒进行ndei、xhoi双酶切鉴定，ndei单酶切和xhoi单酶切鉴定。如图2，酶切鉴定分析初步确定重组质粒pet-28a-wmn1构建成功。2、碱性木聚糖酶在大肠杆菌中的诱导表达将含重组质粒pet-28a-wmn1的e.colibl21star(de3)菌株涂布在含卡那霉素的平板上培养后，挑取转化子过夜摇床培养。接种1％过夜培养的菌液于50ml含kan的液体培养基中，待od600nm在0.6左右加入终浓度为1mm的iptg，于常用培养条件37℃诱导培养，于1、3、6、12、24小时定时取样，并分别对样品进行超声破碎，12000rpm高速离心，发现各样品在上清液中几乎检测不到酶活，推测产物以无活性的包涵体存在。通过对其细胞破碎沉淀进行sds-page蛋白电泳分析(结果如图3)，发现随着诱导时间的增加，沉淀中包涵体的量也在增加，表明图3中42kda左右条带为表达的目的蛋白条带。鉴于在常用培养温度37℃下诱导表达培养的产物多以无活性包涵体形式存在，我们尝试在不同温度(28℃、33℃、37℃)诱导培养，定时取样并用液氮反复冻融法破碎细胞后测其酶活力。结果如图4，在37℃诱导培养时其酶活较低，但随着诱导培养温度的降低，重组酶活力逐渐升高。这可能由于低温诱导时表达速度较慢，不易形成包涵体，而高温诱导时表达速度过快,酶蛋白没有足够时间进行折叠以形成成熟的有活性的酶蛋白，易导致无活性包涵体的形成。考虑到诱导温度太低会影响到菌体的生长，因此，选择诱导温度以28℃为宜。3、重组碱性木聚糖酶蛋白的分离纯化和酶学性质的研究3.1、重组碱性木聚糖酶蛋白的分离纯化在28℃下诱导表达24h后，将诱导表达的菌液收集起来，12000rpm离心20min，去上清。ph8.0的tris-hcl缓冲液重悬菌体，液氮反复冻融进行细胞破碎，12000rpm离心20min，收集破碎上清液进行阴离子交换层析。将测得的酶活峰进行蛋白电泳。由图5泳道2中看出纯化的重组酶蛋白分子量大小约为42kda，与理论值基本一致。利用分离纯化的重组酶进行后续酶学性质研究。3.2、嗜碱芽孢杆菌bacillussp.wmn1产生的碱性木聚糖酶的分离纯化(1)阴离子交换层析ph8.0的tris-hcl缓冲液平衡deaesepharosefastflow柱子后，基线走平，取适量经0.45μm过滤的粗酶液上样。ph8.0的tris-hcl缓冲液继续冲洗柱子，收集穿透峰；待基线再次走平，使用含nacl的ph8.0的tris-hcl缓冲液进行梯度洗脱，收集各个洗脱峰，并将收集到的所有峰液各自进行木聚糖酶活检测。离子交换图谱如图6。使用10kda超滤管将检测到有酶活的峰液进行浓缩和脱盐，得到浓缩酶液。取适量浓缩酶液进行sds-page蛋白电泳分析，结果如图7，在泳道2能清楚地看到一条约为36kda的条带。(2)凝胶过滤层析使用预装柱superdex75将进行过阴离子交换层析的浓缩酶液再次进行分离。缓冲液体系为ph8.0的tris-hcl缓冲液，用3～5倍体积缓冲液将a280基线冲洗至稳定状态后，取适量浓缩酶液上样，再用1个体积将样品进行洗脱，并收集洗脱峰液，即纯酶液，进行酶活检测和蛋白电泳分析。凝胶过滤的蛋白电泳结果如图7的泳道3所示，可见一条明显的目的蛋白条带(分子量约为36kda)，基本达到分离纯化的目的。之后用于酶学性质的研究。3.3、重组碱性木聚糖酶蛋白的酶学性质(1)最适反应温度取适量稀释的纯酶液，分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下反应20min，dns法测定其酶活力。由图8可见，重组酶的最适反应温度为50℃，与野生酶基本一致。(2)温度的稳定性研究温度的稳定性时，将适量稀释的纯酶液放置在不同的温度下保温1h，随后在45℃下反应20min测定其酶活力。图9可见，重组酶当温度在40℃以下时，此酶具有较好稳定性，与野生酶大致相似。(3)最适反应ph取适量稀释的纯酶液，分别在ph2、ph3、ph4、ph5、ph6、ph7、ph8、ph8.5、ph9、ph9.5、ph10、ph11、ph12下反应20min，dns法测定其酶活力，得到图10的结果。重组酶的最适反应ph为8.5，在偏酸和偏碱范围内酶活均得到了较大的提高。(4)ph稳定性研究ph的稳定性时，将适量稀释的纯酶液放置在不同的ph下保温1h，随后在ph9.0下反应20min测定其酶活力，结果如图11所示。由图11可见，与野生酶类似，重组酶在ph5-11范围内稳定，具有宽ph适应性，即具有既耐酸又耐碱的强抗逆特性。(5)金属阳离子和表面活性剂对酶活力的影响在适量纯酶液中分别加入一定体积的金属阳离子溶液，使其终浓度为10mm；加入的edta的浓度为0.1％；加入的sds的浓度为0.05％和0.1％。均放置在37℃下保温30min后测定其酶活力。由图12可见，co2 、mn2 、zn2 和cu2 对重组酶有一定的抑制作用，其他金属离子和edta对酶活的影响甚微。与sds对野生酶活性有部分抑制作用不同，重组碱性木聚糖酶对sds具有非常良好的耐受性。(6)洗衣粉对酶活力的影响在适量纯酶液中加入一定量的立白洗衣粉使其终浓度为0.5％、1％、1.5％、2％、5％，37℃保温30min，然后测定其酶活力。图13可见，重组酶wmn1在以上浓度中，残余酶活显著优于野生酶，显示重组酶制剂在洗涤剂等工业中的更好的应用价值。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>深圳大学<120>一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用<160>26<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1456<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>bacillussp.wmn1菌株的16srdna序列<400>1cggcagtggcggcgtgctatacatgcaagtcgagcggacagaagggagcttgctcccgga60tgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactc120cgggaaaccggagctaataccggatagttccttgaaccgcatggttcaaggatgaaagac180ggtttcggctgtcacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtggggtaatgg240ctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgag300acacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtc360tgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagg420gaagaacaagtgcgagagtaactgctcgcaccttgacggtacctaaccagaaagccacgg480ctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattg540ggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccgg600ggagggtcattggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgt660agcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctg720taactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtcc780acgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaa840cgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacg900ggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacc960aggtcttgacatcctctgacaaccctagagatagggctttcccttcggggacagagtgac1020aggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacga1080gcgcaacccttgatcttagttgccagcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtg1140acaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctac1200acacgtgctacaatggacagaacaaagggctgcgagaccgcaaggtttagccaatcccat1260aaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgcta1320gtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgt1380cacaccacgagagtttgcaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgc1440cgaagtgacagaggtg1456<211>243<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>wmn1木聚糖酶基因保守序列的核苷酸序列<400>2tgggacgtcgtaaacgaagctttcgagggcgacgggactcgccgccagtctgtcttccag60cgggtgcttggtgacggatacatcgaagaggctttccgtgctgcccgtgccgctgacccg120tcagctcagctatgcattaacgactactcaacggactggatcaacgcgaagtccacggcc180atctacaacttggtgaaggacttcaaggaacgcggtgtccccatgcactgtatcggcttc240cag243<211>81<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>wmn1木聚糖酶基因保守序列编码的氨基酸序列<400>3trpaspvalvalasnglualaphegluglyaspglythrargarggln151015servalpheglnargvalleuglyaspglytyrilegluglualaphe202530argalaalaargalaalaaspproseralaglnleucysileasnasp354045tyrserthrasptrpileasnalalysserthralailetyrasnleu505560vallysaspphelysgluargglyvalpromethiscysileglyphe65707580gln<211>711<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>wmn1木聚糖酶基因保守序列上游基因的核苷酸序列<400>4accaagcacccgctggaagacagactggcggcgagtcccgtcgccctcgaaagcttcatt60cacaacatcccatgctgcaatgtcacctgcgtagcgtccggcaacactgttgatgtggtc120aaccatgacggtccgcaattcagctgggtcagtgattgacgccgcccactggggaagctg180agagtgccacaccagtgtgtggccgtacacctcagcgtcattgtccttggcgaactgaac240gaccgaatcagcccctgcccacgtgaactgcccacgttgtggctgggttgcatcccattt300catagcgttttctgcagtgatcatggaaaattctcgttcaacgatttgcttgtattgact360gtcgctgtccgctaaatgtggtgcataagccaccccaaaggtacggccagagcgctccgc420agcgtcgcgcagcggctcaaaatcatgcccaataccgggcgaagcttgtggtgtggcatc480ttgcgcagcgccgggggcgccaaaagccaacattgcaggggtgcacagcgccgcagaaag540agctagcgcgcccgtcgcaaggaacttcttcatcacagatttatccgttctggcaggttg600tgccgttgagggtgaaggaggtaggggatgaatgtgccccattgtgggtcccgttgaacc660cgatcgtgacgctggccccgggggccaccgtccccattccacgcagcattc711<211>637<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>wmn1木聚糖酶基因保守序列下游基因的核苷酸序列<400>5tgcccgtgccgctgacccgtcagctcagctgtgcattaacgactactcaacggactggat60caacgcgaagtccacggccatctacaacttggtgaaggacttcaaggaacgcggtgtccc120catcgactgtgttggtttccagtcgcacttaatcgttggacaggtcccaactaatttcca180acaaaacttgcaacggtttgtggatctcggggttgatgttcgcattaccgaactagatat240tcgtatggcgacaccaccaactgccgcgaaccttgcaacgcaggctgaggactaccgcaa300ggtattccaggcctgctggaacgttgatggctgcaccggggtaactatatggggcatcac360agatgcctactcttggataccgcaggtgttcgcaggtgagggtgctgctttgccctggaa420cgatgactattccacaaaagcggctctcactgaacttgcgacagtgatgggggcgcaacc480agcgtccacaactgacccaacagatccgaccgatccaaccgacccaacagatccgaccga540tccaactgatccaccaagcgatgcggtatgcaccgttgtaccgcgggtcagcggcacggg600caaatcgtcgaacggcaggcgtgcaaacttggcgtaa637<211>1308<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>wmn1木聚糖酶基因的核苷酸序列<400>6atggggcacattcatcccctacctccttcaccctcaacggcacaacctgccagaacggat60aaatctgtgatgaagaagttccttgcgacgggcgcgctagctctttctgcggcgctgtgc120acccctgcaatgttggcttttggcgcccccggcgctgcgcaagatgccacaccacaagct180tcgcccggtattgggcatgattttgagccgctgcgcgacgctgcggagcgctctggccgt240acctttggggtggcttatgcaccacatttagcggacagcgacagtcaatacaagcaaatc300gttgaacgagaattttccatgatcactgcagaaaacgctatgaaatgggatgcaacccag360ccacaacgtgggcagttcacgtgggcaggggctgattcggtcgttcagttcgccaaggac420aatgacgctgaggtgtacggccacacactggtgtggcactctcagcttccccagtgggcg480gcgtcaatcactgacccagctgaattgcggaccgtcatggttgaccacatcaacagtgtt540gccggacgctacgcaggtgacattgcagcatgggatgttgtgaatgaagctttcgagggc600g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技术特征：1.一种碱性木聚糖酶wmn1，其特征在于：其氨基酸序列如seqidno：7所示。
2.编码权利要求1所述的碱性木聚糖酶wmn1的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述的基因的核苷酸序列如seqidno：6所示。
4.一种含有权利要求2或3所述的基因的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体为适于在大肠杆菌中表达的载体。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：权利要求2或3所述的基因被插入至pet-28a( )载体中。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于：权利要求2或3所述的基因被插入至pet-28a( )载体中的ndei和xhoi酶切位点之间。
8.一种表达碱性木聚糖酶wmn1的菌株，其特征在于：是将权利要求2或3所述的基因的核苷酸序列构建成载体后转染至大肠杆菌e.colibl21star(de3)得到。
9.根据权利要求9所述的表达碱性木聚糖酶wmn1的菌株，其特征在于：所述的载体为权利要求4～7任一项所述的表达载体。
10.权利要求1所述的碱性木聚糖酶wmn1在造纸、洗涤工业中的应用。
技术总结本发明公开一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用，属于生物技术领域。该碱性木聚糖酶WMN1基因序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TAA结束，共包括1308个核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID No：6所示。上述碱性木聚糖酶WMN1基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No：7所示。本发明还公开了上述碱性木聚糖酶WMN1在造纸、洗涤等工业中的应用。
技术研发人员：刘森林;钟雅芳;陈伟钊
受保护的技术使用者：深圳大学
技术研发日：2020.01.21
技术公布日：2020.06.09
