本发明属于生物
技术领域：
：，涉及一种无rna污染的植物基因组dna高效提取方法。
背景技术：
：：在分子生物学和遗传学领域，基因组是指生物体所有遗传物质的总和。这些遗传物质包括dna或rna(病毒rna)。基因组包括编码dna和非编码dna、线粒体dna和叶绿体dna。研究基因组dna，要求提取的dna具有较高的纯度和得率，以便于pcr、基因组测序以及基因探测等后续研究。在dna提取过程中，影响其纯度和得率的原因很多。现有技术中，急需一种无rna污染的植物基因组dna高效提取方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种无rna污染的植物基因组dna高效提取方法。其具体技术方案为：一种无rna污染的植物基因组dna高效提取方法，包括以下步骤：(1)2％ctab抽提缓冲液在65℃水浴中预热。(2)取少量叶片(约1g)置于研钵中，用液氮磨至粉状，将300mg左右的粉末转移到2.0ml离心管中。(3)加入800μl2％ctab抽提缓冲液和20μl1％β-巯基乙醇，轻轻搅动混匀。(4)置于65℃的水浴槽或恒温箱中温浴，每隔10min轻轻摇动，30min后取出。(5)加入800μl酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)，在摇床(90rpm/min)上充分混匀10min后，12000rpm离心5min。(6)离心结束后，吸取500μl上清液，转入另一新的2.0ml离心管中。(7)在500μl上清液中加入10μlrnasea溶液(10mg/ml)，在摇床上充分混匀，去除rna。(8)混匀15min后，加入500μl酚/氯仿/异戊醇，摇床上充分混匀；(9)混匀10min后，12000rpm离心5min，取上清液至另一新的2.0ml离心管中，在离心管中加等体积已在-20℃冰箱中预冷的异丙醇，置-20℃冰箱冷冻20min。(10)冷冻20min后，12000rpm离心2min，立即倒掉液体，注意勿将白色dna沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上。(11)2min后，直立离心管，加入800μl75％乙醇，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀于管底的dna块状物浮游于液体中，漂洗5min。(12)12000rpm离心1min，倒掉液体，再加入800μl75％乙醇，将dna漂洗5min。(13)12000rpm离心1min，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥dna。(14)加入100μl灭菌水溶解。(15)置于-20℃保存、备用。进一步，步骤6中，在第一次抽提的上清液中加入rnasea溶液消解rna。与现有技术相比，本发明的有益效果：在提取过程消解rna，提取的dna中无rna污染。目前，关于植物基因组dna的提取常规方法有sds法、ctab法，到后续发展起来的碱处理法、高温水煮法，以及生物公司开发出的一些基因组dna提取试剂盒。采用传统方法提取dna质量、浓度较高，但是操作过程复杂，降低试验效率，难以适应分子标记和基因定位是需要大批量提取dna的要求。而且dna提取中混有提取过程中残留的杂质。而在构建基因组文库过程中，如果dna纯度不够，例如混有酚、酒精等杂质，对酶切、连接均有抑制作用，导致文库滴度大大降低。因此，本发明以水稻叶片为材料，通过改进基因组dna提取方法，在提取时间、dna提取量、rna残留等方面具有较大优势。附图说明图1是dna的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道“1～3”分别是方法1、2、3提取的dna电泳效果图；泳道“m”为trans生物技术有限公司生产的5kbdnamarker，8条带的大小依次为5kb、3kb、2kb、1.5kb、1kb、800bp、500bp、300bp。图2是3种方法提取dna的pcr扩增结果。其中，泳道“1～3”分别是方法1、2、3提取dna的pcr产物；泳道“m”为trans生物技术有限公司生产的dnamarkerⅰ，8条带的大小依次为700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。图3是3种方法提取dna酶切电泳图。其中，泳道“1”、“3”、“5”分别是方法1、2、3提取dna的酶切产物；泳道“2”、“4”、“6”分别是方法1、2、3提取的dna；泳道“m”为trans生物技术有限公司生产的dnamarkerⅰ，8条带的大小依次为700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。具体实施方式下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。1材料与方法1.1材料以水稻叶片为试验材料。1.2水稻的培育与取样水稻育苗采用湿润育秧。播种前待浸种催芽两天，破胸露白后播在育苗床上。水稻幼苗长至4叶1心，取水稻幼叶，锡箔纸包裹于液氮中速冻，置-80℃保存备用。1.3水稻基因组dna提取的方法方法1为改进后方法，具体步骤如下：(1)2％ctab抽提缓冲液在65℃水浴中预热。(2)取少量叶片(约1g)置于研钵中，用液氮磨至粉状，将300mg左右的粉末转移到2.0ml离心管中。(3)加入800μl2％ctab抽提缓冲液和20μl1％β-巯基乙醇，轻轻搅动混匀。(4)置于65℃的水浴槽或恒温箱中温浴，每隔10min轻轻摇动，30min后取出。(5)加入800μl酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)，在摇床上(90rpm/min)充分混匀10min后，12000rpm离心5min。(6)离心结束后，吸取500μl上清液，转入另一新的2.0ml离心管中。(7)在500μl上清液中加入10μlrnasea溶液(10mg/ml)，在摇床上充分混匀10min，以去除rna。(8)混匀15min后，加入500μl酚/氯仿/异戊醇，摇床上充分混匀；(9)混匀10min后，12000rpm离心5min，取上清液至另一新的2.0ml离心管中，在离心管中加等体积已在-20℃冰箱中预冷的异丙醇，置-20℃冰箱冷冻20min。(10)冷冻20min后，12000rpm离心2min，立即倒掉液体，注意勿将白色dna沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上。(11)2min后，直立离心管，加入800μl75％乙醇，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀于管底的dna块状物浮游于液体中，漂洗5min。(12)12000rpm离心1min，倒掉液体，再加入800μl75％乙醇，将dna漂洗5min。(13)12000rpm离心1min，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥dna。(14)加入100μl灭菌水溶解。(15)置于-20℃保存、备用。方法2参照卢扬江等简易的dna提取方法，操作步骤稍作修改。具体操作步骤如下：(1)2.0ml离心管中加入800μlctab抽提液，在60℃水浴预热。(2)将稻叶片剪小，放入研钵内，倒入液氮，磨成细粉，在2.0ml离心管中加入300mg粉状叶片，迅速转入经预热的抽提液中，上下颠倒搅匀；在60℃水浴保温30min，保温期间搅动几次。(3)在摇床上缓慢振荡(60rpm/min)10～20min。(4)加入800μl酚/氯仿/异戊醇，混匀，继续在摇床缓慢振荡20min。(5)室温下12000rpm，离心10min。(6)仔细地将上清液倒入干净离心管，加入0.8至1倍体积的异丙醇，混匀，在室温下放置片刻，出现纤维状沉淀。(7)弃去上清液，加入1mlte。(8)所得dna的te溶液在12000rpm离心5min，去除不溶解物质，将上清液转入干净试管中。(9)在-20℃放置0.5h左右，dna形成纤维状沉淀。(10)在75％乙醇中漂洗，用吸水纸吸干。(11)将沉淀转入100μl灭菌水，溶解后贮藏在4℃。方法3参照程宝山的方法，操作步骤稍作修改。具体步骤如下：(1)叶片在预冷的研钵中磨成粉末，将300mg粉末转移到2.0ml离心管中；(2)加入800μlctab提取液，摇匀，65℃温浴30min，期间振荡4次；(3)加入700μl酚/氯仿/异戊醇混合液，120rpm/min振荡30min；12000rpm/min离心10min；(4)上清液至另一离心管中，加入800μl酚/氯仿/异戊醇混合液，90rpm/min振荡30min，充分摇匀；12000rpm/min室温下离心10min；(5)取上清液至另一离心管中，加入700μl-20℃预冷的无水乙醇，摇匀，-20℃中自由沉降10min；12000rpm/min离心6min；(6)弃上清，用等体积(400μl左右)70％乙醇洗涤沉淀10min，弃上清，风干dna；(7)于100μl灭菌水溶解，4℃保存备用。1.4dna质量的检测1.4.1紫外分光光度计检测dna的浓度与纯度取少量已纯化的dna，稀释100～200倍，于紫外分光光度计分别测定波长为260nm和280nm处的od值。dna浓度(mg/ml)＝od(260nm)×50×稀释倍数/1000；dna提取率(μg/g)＝浓度×体积/取材量(g)；dna的纯度通过od260nm/od280nm比值表示。1.4.2琼脂糖凝胶电泳检测取5.0μl的基因组dna，加上0.5μl的10×loadingbuffer，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测dna。1.5pcr反应与酶切反应检测1.5.1pcr反应检测用前引物5′-aatccctccttgcgttggaa-3′和后引物5′-gtcgtgttcgtgtgacgttg-3′进行pcr反应。反应体系为10μl，包括2.0μldna模板，上、下游引物各1.0μl，2.0μl灭菌水，5μl2×taqmix(天根，中国)。反应程序为：94℃3min后，按94℃45s，54℃45s，72℃30s，26个循环后，72℃再延伸3min。扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。1.5.2酶切反应检测采用限制性内切酶hindⅲ(promega，美国)进行基因组酶切反应。反应体系为10.0μl，包括5.0μldna，灭菌水2.0μl，1.0μl10×buffer和2.0μlhindⅲ。酶切反应条件为：37℃2h，4℃过夜。2结果与分析2.1dna检测结果2.1.1紫外分光光度计检测结果从od260nm/od280nm检测值可以看出(表1)，3种方法提取dna的吸光度比值od260nm/od280nm均大于1.8，表明dna提取质量均较好。但是从提取率与dna浓度方面看(表1)，方法1明显优于其他2种方法。综合od260nm/od280nm、dna提取率和dna浓度看，方法1提取的dna质量最好，提取率和dna浓度也最高。表13种dna提取方法提取的dna质量和提取率table1thednaqualityandextractionrateoffivednaextractionmethods2.1.2琼脂糖凝胶电泳检测结果从图1中可以看出，方法1提取的dna亮度最亮；而其他2种方法dna条带亮度比方法1要暗，且从图1中可以看出这3种方法的dna降解比方法1和方法3要少。另外，方法2、方法3中均有残留的rna，而方法1中没有rna污染。2.2pcr与酶切反应结果2.2.1pcr反应检测结果图2实线箭头指示扩增片段，大小在500bp左右。以3种方法提取的dna为模板进行pcr反应的琼脂糖凝胶电泳条带明亮清晰，亮度没有明显差异，说明这3种方法提取的dna均满足pcr等常规试验操作要求。2.2.2酶切反应检测结果从水稻基因组dna酶切产物与dna电泳图可以看出(图3)：方法1(泳道1、2)酶切效果较好；其他2种方法酶切产物条带也靠近总dna条带，仍存在rna污染。3讨论与结论本发明讨论了3种水稻基因组dna的提取方法，3种方法在实际应用中各有优缺点。若从dna提取率、浓度、纯度和酶切效果等方面综合考虑，方法1的提取效果要较其他2种方法要好，且方法3的2次抽提时间太长。在提取时间方面，强碱提取法和叶片煮沸法等dna快速提取方法展现着很大的优势，但是dna提取质量较差。在本发明中，方法1提取dna比其他2种方法快，省时省力，该方法虽需抽提2次，但是2次时间均较短，每次只需10min，大大加快了dna的提取效率；而耗时最长的方法3，仅抽提两次就花费1个小时，与方法1相比耗时太长。在dna提取量上，方法1的提取率最高，达到473.33μg/g，显著高于其他2种方法，且从dna电泳图可以看出dna降解比其他几种方法要少。从抽提时间上看，不是时间越长越好，如方法3抽提时间长达1h，提取率却低于抽提20min的方法1(表1)。通过dna电泳检测图(图1)可以看到方法2、方法3中有rna的污染，而方法1中没有rna污染，这与该发明中在步骤6中加入rnasea溶液降解rna有关。在前人的研究中，均是提取溶解完dna后加入rna酶降解rna，这样操作会影响到后续有些试验，比如在基因组重测序中，均是在获得dna溶液前消解rna。相比试剂盒，该发明方法所需费用要低，更节省试验成本。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本
技术领域：
：的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种无rna污染的植物基因组dna高效提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)2％ctab抽提缓冲液在65℃水浴中预热；
(2)取1g叶片置于研钵中，用液氮磨至粉状，将300mg的粉末转移到2.0ml离心管中；
(3)加入800μl2％ctab抽提缓冲液和20μl1％β-巯基乙醇，轻轻搅动混匀；
(4)置于65℃的水浴槽或恒温箱中温浴，每隔10min轻轻摇动，30min后取出；
(5)加入800μl酚/氯仿/异戊醇，在摇床上以90rpm/min的速度充分混匀10min后，12000rpm离心5min；
(6)离心结束后，吸取500μl上清液，转入另一新的2.0ml离心管中；
(7)在500μl上清液中加入10μl浓度为10mg/ml的rnasea溶液，在摇床上充分混匀，以去除rna；
(8)15min后，加入500μl酚/氯仿/异戊醇，摇床上充分混匀；
(9)混匀10min后，12000rpm离心5min，取上清液至另一新的2.0ml离心管中，在离心管中加等体积已在-20℃冰箱中预冷的异丙醇，置-20℃冰箱冷冻20min；
(10)冷冻20min后，12000rpm离心2min，立即倒掉液体，注意勿将白色dna沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；
(11)2min后，直立离心管，加入800μl75％乙醇，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀于管底的dna块状物浮游于液体中，漂洗5min；
(12)12000rpm离心1min，倒掉液体，再加入800μl75％乙醇，将dna漂洗5min；
(13)12000rpm离心1min，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥dna；
(14)加入100μl灭菌水溶解；
(15)置于-20℃保存、备用。
2.根据权利要求1所述的无rna污染的植物基因组dna高效提取方法，其特征在于，步骤6中，在第一次抽提的上清液中加入rnasea溶液消解rna。
技术总结本发明公开了一种无RNA污染的植物基因组DNA高效提取方法，CTAB抽提缓冲液水浴中预热；叶片置于研钵中，研磨；加入抽提缓冲液和β‑巯基乙醇；温浴；加入酚/氯仿/异戊醇，在摇床上充分混匀后离心；轻轻地吸取上清液，在上清液中加入RNaseA溶液，去除RNA；加入酚/氯仿/异戊醇；离心取上清液，在离心管中加等体积已预冷的异丙醇，冷冻；离心，立即倒掉液体；直立离心管，加入乙醇；倒掉液体，再加入乙醇，将DNA漂洗；离心，立即倒掉液体，干燥DNA；灭菌水溶解；置于‑20℃保存、备用。本发明以水稻叶片为材料，通过改进基因组DNA提取方法，在提取时间、DNA提取量、RNA残留等方面具有较大优势。
技术研发人员：周会汶;吴兰花;宋英培;王春娥;王瑞凯;周海霞;周筱玲
受保护的技术使用者：九江学院
技术研发日：2020.04.08
技术公布日：2020.06.09
