本发明涉及作物分子标记辅助育种
技术领域：
，特别是涉及玉米籽粒镉低积累控制基因zmcd1的分子标记和应用。
背景技术：
：镉是一种生物毒性显著的重金属，其会随着食物链进入人体，严重危害人们的身体健康。镉被世界卫生组织(who)列为重点研究的食品污染物，被我国列为实施排放总量控制的重点监控指标。玉米是我国重要的粮食和饲料作物，其种植面积和产量列居各农作物之首。土壤中的镉经玉米根系吸收最终在可食部位中积累，严重影响玉米的品质安全，对人和动物的健康造成威胁。因此，提升玉米对镉毒害的耐受性，降低玉米中镉积累量，对保障社会和经济的持续健康发展具有重要意义。植物对镉的耐性是一个复杂的性状，受到一系列基因的调控。部分镉积累调控基因在拟南芥、水稻中已经被克隆，但是植物中对镉耐受的分子机制仍不清晰，而且玉米中控制籽粒镉积累性状的关键基因还未被克隆。因此，鉴定玉米籽粒镉含量关键调控基因，开发其功能分子标记应用于镉低积累玉米种质的筛选和鉴定，是保障玉米安全生产的迫切需要。由于玉米镉低积累关键调控基因的功能分子标记尚未被开发，限制了其在分子标记辅助选育镉低积累玉米品种中的应用。有必要开发与玉米镉低积累相关的调控基因及其分子标记，以推动镉低积累玉米品种的选育和推广工作。技术实现要素：本发明的第一个目的在于提供一种玉米籽粒镉低积累控制基因及其应用。本发明的第二个目的在于提供与玉米籽粒镉低积累控制基因相关的分子标记，及扩增该分子标记的特异性引物组合。本发明的第三个目的是提供上述分子标记的应用。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：以含有436份玉米自交系构成的关联群体为基础材料，对玉米籽粒镉含量性状进行遗传分析，发现有1006个显著的snp位点集中分布在2号染色体。根据基因功能注释在显著snp位点侧翼序列100kb范围内筛选调控玉米籽粒镉含量的候选基因。锁定到一个候选基因，命名为zmcd1。对zmcd1基因进行测序，序列比对分析发现镉高积累玉米自交系较低积累玉米自交系在zmcd1基因的启动子位置存在7520bp缺失和604bp的gypsy类ltr反转座子插入突变，基因显隐性分析发现该插入突变为隐性突变。zmcd1突变体等位测验进一步证实zmcd1的突变导致玉米籽粒镉高积累性状。根据该启动子位置的差异序列开发基于pcr的功能分子标记pcr-zmcd1。本发明提供的玉米籽粒镉低积累控制基因zmcd1位于玉米基因组第2染色体，其具有seqidno.9所示的核苷酸序列。上述玉米镉低积累控制基因zmcd1编码的蛋白属于本发明的保护范围。本发明提供了上述玉米镉低积累控制基因zmcd1或其编码的蛋白在作物分子辅助育种中的应用。本发明提供了上述玉米籽粒镉低积累控制基因zmcd1、或其编码的蛋白、或含有所述zmcd1基因的生物材料在调控玉米籽粒镉积累中的应用，所述的生物材料为表达盒、表达载体、工程菌或宿主细胞。本发明提供了上述玉米籽粒镉低积累控制基因zmcd1或其编码的蛋白在制备镉低积累玉米品种中的应用。本发明提供了上述玉米籽粒镉低积累控制基因zmcd1或其编码的蛋白在预测玉米籽粒镉积累能力中的应用。本发明进一步提供了玉米籽粒镉低积累控制基因zmcd1的启动子，其具有seqidno.1所示的核苷酸序列，或与其有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性的具有相同功能的特异性序列。本发明还提供了玉米籽粒镉低积累控制基因zmcd1的另一种启动子，其具有seqidno.8所示的核苷酸序列，或与其有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性的具有相同功能的特异性序列。该启动子序列能够使玉米籽粒镉低积累控制基因zmcd1表达沉默。本发明提供了上述两种启动子在调控玉米籽粒镉积累、或制备镉低积累玉米品种、或预测玉米籽粒镉积累能力中的应用。其中seqidno.1所示的启动子序列能够调控下游基因zmcd1，使其表达，从而降低玉米籽粒镉积累，而seqidno.2所示启动子序列调控下游基因zmcd1沉默，从而增加了玉米籽粒镉积累。本发明提供了玉米籽粒镉低积累控制基因zmcd1的功能分子标记，命名为pcr-zmcd1，该分子标记与zmcd1基因共分离，其为seqidno.1所示启动子序列第56bp位置起缺失一段seqidno.2所示的序列，即在zmcd1基因起始密码子上游300bp位置缺失一段seqidno.2所示的序列、同时在该位置插入一段seqidno.3所示的序列。反转录pcr检测结果显示启动子区域的这段改变导致zmcd1基因不表达。优选地，本发明所述分子标记含有seqidno.7所示的序列。优选地，本发明所述的分子标记可通过seqidno.4-6所示的引物序列pcr扩增得到。本发明还提供了一种引物组合，含有三条引物，其核苷酸序列分别如seqidno.4-6所示。本发明提供了上述的分子标记或上述的引物组合在镉低积累玉米品种鉴定或选育中的应用。本发明提供了上述的分子标记或上述的引物组合在玉米分子辅助育种中的应用。上述的应用中，具体而言是用seqidno.4-6所示的引物对待测玉米品种dna进行pcr扩增，若扩增产物电泳检测仅出现大小为574bp的片段，则待测玉米为籽粒镉高积累玉米品种；若扩增产物电泳检测仅出现大小为776bp的片段，或同时出现574bp和776bp两个片段，则待测玉米为籽粒镉低积累玉米品种。本发明还提供了一种制备镉低积累转基因玉米的方法，通过基因工程的方法使玉米籽粒镉低积累控制基因zmcd1过表达，从而获得镉低积累转基因玉米。本发明的有益效果在于：本发明以含有436份玉米自交系构成的关联群体为基础材料，对玉米籽粒镉含量性状进行遗传分析，在显著snp位点侧翼序列100kb范围内筛选调控玉米籽粒镉含量的候选基因，锁定到一个候选基因命名为zmcd1，序列比对分析发现镉高积累玉米自交系较低积累玉米自交系在zmcd1基因的启动子位置存在7520bp缺失和604bp的gypsy类ltr反转座子插入突变，根据该启动子位置的差异序列开发基于pcr的功能分子标记pcr-zmcd1。该分子标记可用于镉低积累玉米的早期预测、筛选，以及选育，可用于高通量、快速、准确鉴定及筛选镉低积累能力的玉米种质资源，可通过分子标记辅助育种手段加速玉米品种的遗传改良。附图说明图1为玉米籽粒中镉积累量关联分析结果图。a:曼哈顿图；b:qqplot图。箭头指的是最显著的snp位点。图2与镉低积累玉米自交系b73(籽粒镉含量为0.008mg/kg)相比，镉高积累玉米自交系mo17(籽粒镉含量为0.14mg/kg)在zmcd1基因的启动子区域存在gypsy类ltr反转座子插入突变(灰色)。图3功能分子标记pcr-zmcd1对镉高积累(mo17)，镉低积累(b73)玉米自交系和b73×mo17玉米杂交种的基因分型检测结果。pcr产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。b×m：b73×mo17。m：dnamarker2000。图4功能分子标记pcr-zmcd1对3个镉高积累玉米自交系(郑58，ye478，p178)和3个镉低积累玉米自交系(黄早四，京92和京724)的基因分型检测结果。pcr产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。泳道1-7分别为郑58，ye478，p178，黄早四，京92，京724和对照组(拟南芥dna为模板)。m:dnamarker2000。图5功能分子标记pcr-zmcd1对自然群体中12个玉米自交系的基因分型检测结果。pcr产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。33，35，36，37，39，4，40，41，42，43，44和45分别为玉米自交系gems33，gems35，gems36，gems37，gems39，gems4，gems40，gems41，gems42，gems43，gems44和gems45。m：dnamarker2000。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。本发明实施例中所用的玉米种质资源均来自北京市农林科学院玉米研究中心玉米种质资源库。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1利用全基因组关联分析定位籽粒镉低积累关键调控基因由436份玉米自交系构成的关联群体，在镉污染农田(镉含量为1.8±0.3mg/kg)种植，试验采用随机区组设计，进行两次独立性重复。对于每个重复，每个玉米自交系种植一排，每排种植10株。每排长3m，排间距为60cm。玉米收获后测定籽粒镉含量。以两个重复对应自交系籽粒镉含量的平均值作为该自交系表型值。关联群体的基因型是结合简化基因组测序(gbs)、高密度阵列技术，和来自368个不同玉米自交系的深度rna测序数据，鉴别出等位基因频率(maf)大于0.05的1.25msnps(liu等,2017,molecularplant,10:414-426)。结合基因型和表型，利用tassel3.0软件的混合线性模型(mlm)，把群体结构和亲缘关系(q k)作为协变量进行全基因组关联分析。关联分析结果设定阈值为p<7.97e-7。在该阈值下，发现有1006个显著的snp位点集中分布在2号染色体，最显著的snp位点(chr2.s_158408660)的显著性p值达到2.6961e-21，能够解释24.2％的表型变异，见图1。土壤镉含量测定方法为：采用5点取样法，用取土器采集0-20cm深度土样，参考gb/t17141-1997标准检测土壤镉含量。玉米籽粒镉含量测定方法为：玉米果穗成熟后晒干脱粒，对于每个自交系的每个独立性重复，取1kg籽粒烘干粉碎，过100目筛，用硝酸-高氯酸消解样品后，利用zeenit700p原子吸收光谱仪石墨炉法测定消化液中镉含量(mg/kg)(吴家梅，2019，journalofagro-environmentscience，38：502-509)。实施例2候选基因筛选根据实施例1群体的ld衰减距离(liu等,2017,molecularplant,10:414-426)，在显著snp位点侧翼序列100kb范围内筛选调控玉米籽粒镉含量的候选基因。根据基因功能注释，锁定到一个候选基因，命名为zmcd1。该基因位于最显著snp位点(chr2.s_158408660)侧翼序列100kb范围内。对4个镉高积累玉米自交系郑58(0.26mg/kg)，ye478(0.21mg/kg)，p178(0.44mg/kg)和mo17(0.14mg/kg)和4个镉低积累玉米自交系b73(0.008mg/kg)，黄早四(0.009mg/kg)，京92(0.014mg/kg)和京724(0.008mg/kg)的zmcd1基因进行测序，序列进行比对分析后发现，4个镉高积累玉米自交系郑58，ye478，p178和mo17均在zmcd1基因的启动子区域，即翻译起始密码子(5′-atgggcagtgtcgaggagaggctgctgcca-3′)上游300bp位置存在7520bp缺失(seqidno.2)和604bp(seqidno.3)的插入突变(以玉米b73为参考基因组)，censor软件(https://www.girinst.org/censor/index.php)分析发现该604bp插入序列为gypsy类ltr反转座子(图2)。表1为扩增zmcd1的cdna的引物信息。表1zmcd1cdna扩增引物信息引物5′-3′序列472fgatgggcagtgtcgaggag(seqidno.10)3618ragcttttggtcttgttgcatga(seqidno.11)初步表明zmcd1启动子区域的插入突变与玉米籽粒中镉高积累性状相关。镉高积累玉米自交系mo17、qi319与镉低积累玉米自交系b73、hzs杂交，所获得的b73×mo17，mo17×b73，hzs×qi319,qi319×hzs杂交种在镉污染农田种植后，其籽粒镉含量均较低，分别为0.02±0.00，0.02±0.007，0.01±0.00，0.02±0.01(mg/kg)。表明在zmcd1基因启动子位置的gypsy类ltr反转座子插入突变为隐性突变。实施例3候选基因zmcd1功能验证从玉米突变体库memd(http://www.elabcaas.cn/memd/)中索取在zmcd1(zm00001d005190)基因编码区发生终止突变(ems4-038f45)和错误剪接(ems4-038f36)的ems突变体，在镉污染农田各种植5排，每排种植10株。玉米成熟后，混合脱粒测定籽粒镉含量，测定3个生物学重复。测量结果显示，同一突变体籽粒间镉含量差异不显著，突变体籽粒镉含量分别为0.26±0.16mg/kg和0.24±0.07mg/kg，显著高于野生型材料b73(籽粒镉含量为0.008mg/kg)。用ems4-038f45、ems4-038f36分别与镉高积累玉米自交系mo17(启动子位置存在ltr反转座子插入)杂交进行等位测验。ems4-038f45、ems4-038f36两个突变体各种植5排，每排种植10株。分别与mo17杂交，f1玉米种子在镉污染农田种植收获后，混合脱粒测定玉米籽粒镉含量，测定3个生物学重复。测定结果显示，每种f1玉米种子之间镉含量差异不显著，其籽粒镉含量均高(分别为0.24±0.05mg/kg和0.22±0.06mg/kg)，显著高于野生型材料b73(籽粒镉含量为0.008mg/kg)。突变体等位测验实验结果进一步证实zmcd1基因为玉米籽粒镉积累关键调控基因，zmcd1的突变导致玉米籽粒镉高积累。实施例4zmcd1基因功能分子标记开发及其应用基于镉高积累玉米自交系mo17和镉低积累玉米自交系b73在zmcd1基因启动子区域的序列差异(另外3个高镉积累玉米自交系郑58、ye478、p178与另外3个低镉积累玉米自交系黄早四、京92、京724均存在类似的前述这种差异)，本实施例开发pcr功能分子标记pcr-zmcd1，其引物信息见表2。表2功能分子标记pcr-zmcd1引物信息引物5′-3′序列bhj-3ftggcaagctcaacactggta(seqidno.4)774rggccagaatcaaggactgca(seqidno.5)mz-201ftccgcgacatggatttggaa(seqidno.6)pcr扩增条件为：94℃5min，然后94℃30s,59℃30s,72℃1min进行34个循环，最后72℃延伸10min。pcr扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。利用该标记的bhj-3f，mz-201f和774r引物，在镉高积累玉米自交系mo17中的扩增片段大小为574bp，镉低积累玉米自交系b73中扩增片段大小为776bp，在b73×mo17杂交种中同时扩增出574bp和776bp(图3)。利用上述bhj-3f，mz-201f和774r引物对另外3个镉高积累玉米自交系(郑58，ye478，p178)和3个镉低积累玉米自交系(黄早四，京92和京724)分别进行pcr扩增，扩增结果显示：3个镉高积累玉米自交系(郑58，ye478，p178)均仅扩增出574bp的片段；另外3个镉低积累玉米自交系(黄早四，京92和京724)均仅扩增出776bp的片段(图4)，以拟南芥作为对照。用所开发的pcr-zmcd1功能标记对关联群体中12个玉米自交系做基因分型检测(图5)，发现5个镉高积累玉米自交系(gems33，gems35，gems36，gems37，gems43)(表3)中扩增片段大小均为574bp，而7个低积累玉米自交系(gems39，gems4，gems40，gems41，gems42，gems44，gems45)(表3)中扩增片段大小均为776bp，表明该pcr功能分子标记可以将镉高积累和镉低积累玉米自交系区分开。表3自然群体中12个玉米自交系籽粒镉含量测定结果虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>北京市农林科学院，湖南省作物研究所<120>玉米籽粒镉低积累控制基因zmcd1的分子标记和应用<130>khp191117004.4<160>11<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>7874<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1caattcaaccaccaaaatcatttaggaaaaaggtttgaccctatttccctttcaacgcag60ccgcttccctaagctagcgacagtcaatccgaagactagatcaccacccatgcacccagg120aaaaaaagactgtggtcgttcgcaccaagagtcgcgaaccctccacaaccaacggccgca180actcctcttgttgaaggatggcccaacttgagagcttctatgacgccaaatggataacct240gcaaaggagaacacaagagttttttctcaaaaactaagtcatttctacagatccagagcg300cccaacacaacaccgccgctccaagtagaagcattggttttagcacactattaaaacctt360aaagccaatccccaaacatatggtccacattttgtgattggttgattccagtggccacca420gaaacacggtccagactgaccgggtaagccggcattcgaagaagaggtgttgaatggtct480cttccttgtgacaagaggtgcatgttaaactaccttgccagttttgtttagccaaattat540attttgtgaggattacaccctttcgcaaataccataggaaaatgttaaatttgagggagg600cctttagcttcgaaagctctttattaacattagagatattattgagcatcaaggcagcgt660agtgcgatttaaccaagaatctaccagtcgtggaaaggttccagaagaaggtatcctgat720catgggacagctccacaccttgtatacgtgacaatatggaaagccaatcgaccaaattgg780ctccaaataactgtctccgtcaggaaaaggttggaggcgaatcgctcaaggcttctgata840ttaaaatgaatttgtccctcgcaatgttatacagggctggatattggtctgttaaagagg900acccatccaaccaggcatcctcccagaacctcacttgagagccatcctttatgaggaatg960agccaaaacggaggaaggttgggtttactttcattaagcctgaccagaaatgggagtcac1020caagtttccactacacatgagccaaaggttttgagccaacatatttattacagagtaatt1080gttggcacaatccatctgaggtgagtagcttgtacagccatttgctaagaagggcaatat1140tcatcatatttagatctaagataccaagtccccttgatacttattcttaataatcacttg1200attaacagatatgtaatctatacatctctactacttattaagtaagcaatagtagtctgc1260ctttgactgttctgcctctgacccgttctgccatctacgtgcccccacagccgtacacat1320aggtctccagcaaaaattatcatgcctgcgcaagagttgaatctaaccaattcagccacc1380aacggagttcttactgttaagtccgcgccaacgcttataagccgctccatgtctccttta1440gtagccagtatggtactaagtttttgcaagacagcaggagagcggttcttcctcggccca1500tcatcccttggacccgcgcggcccatttgcttagtgtcgtgcggacggcccatttggtgc1560ggcgtcacgcgaccctcaggagagcggtcttcttcctcggccgtccgcacgacggagcgc1620ccaaccgctcggtcagccactcagccccactctcgcatcctccctccccacgacctccac1680ttccttgacttcaatgcgtgcgctggatgatgtcgctatatggtgccgcgtccgagtcag1740ttcctctctcgctcacttcctgcaat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技术特征：1.玉米籽粒镉低积累控制基因zmcd1的启动子，其特征在于，其具有seqidno.1所示的核苷酸序列，或与其有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性的具有相同功能的特异性序列。
2.玉米籽粒镉低积累控制基因zmcd1的启动子，其特征在于，其具有seqidno.8所示的核苷酸序列，或与其有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性的具有相同功能的特异性序列。
3.权利要求1或2所述的启动子在调控玉米籽粒镉积累、或制备镉低积累玉米品种、或预测玉米籽粒镉积累能力中的应用。
4.玉米籽粒镉低积累控制基因zmcd1的分子标记，其特征在于，其为seqidno.1所示启动子序列第56bp位置起缺失一段seqidno.2所示的序列、同时插入一段seqidno.3所示的序列。
5.权利要求4所述的分子标记，其特征在于，所述分子标记含有seqidno.7所示的序列。
6.权利要求4所述的分子标记，其特征在于，可通过seqidno.4-6所示的引物序列pcr扩增得到。
7.一种引物组合，其特征在于，含有seqidno.4-6所示的引物。
8.权利要求3-5任一所述的分子标记或权利要求6所述的引物组合在镉低积累玉米品种鉴定、选育或玉米分子辅助育种中的应用。
9.权利要求8所述的应用，其特征在于，用seqidno.4-6所示的引物对待测玉米品种dna进行pcr扩增，若扩增产物电泳检测仅出现大小为574bp的片段，则待测玉米为籽粒镉高积累玉米品种；
若扩增产物电泳检测仅出现大小为776bp的片段，或同时出现574bp和776bp两个片段，则待测玉米为籽粒镉低积累玉米品种。
10.一种制备镉低积累转基因玉米的方法，其特征在于，通过基因工程的方法使玉米籽粒镉低积累控制基因zmcd1过表达，从而获得镉低积累转基因玉米。
技术总结本发明提供了玉米籽粒镉低积累控制基因ZmCd1的分子标记和应用。本发明以含有436份玉米自交系构成的关联群体为基础材料，对玉米籽粒镉含量性状进行遗传分析，在显著SNP位点侧翼序列100kb范围内筛选调控玉米籽粒镉含量的候选基因，锁定到一个候选基因命名为ZmCd1，序列比对分析发现镉高积累玉米自交系较低积累玉米自交系在ZmCd1基因的启动子位置存在7520bp缺失和604bp的Gypsy类LTR反转座子插入突变，根据该启动子位置的差异序列开发基于PCR的功能分子标记PCR‑ZmCd1。该分子标记可用于镉低积累玉米的早期预测、筛选，以及选育。
技术研发人员：骆美洁;赵久然;汤彬;赵衍鑫;郭欢乐;陈志辉;张云霞;孔梦思;冯震;宋伟;张如养
受保护的技术使用者：北京市农林科学院;湖南省作物研究所
技术研发日：2019.12.19
技术公布日：2020.06.09
