本发明属于代谢工程和微生物转化技术领域，尤其是一种具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法、菌株及其应用。
背景技术：
甾体激素类药物是目前临床上用量仅次于抗生素的第二大类药物，具有抗炎症、抗过敏、抗休克、抗变态反应等功效，此外，甾体激素还具有改善蛋白代谢、恢复和增强体力、利尿降压等作用。甾体化合物的c1,2位脱氢反应是工业上采用微生物转化法生产甾体药物的典型代表，也是生产氢化泼尼松及其同系物最有价值的一种反应。简单节杆菌(arthrobactersimplex)是目前国内工业上常用的甾体c1,2脱氢反应菌株，具有专一性高、反应速率快等优点。如它对醋酸可的松(ca)表现出高活性，生成的产物醋酸泼尼松(pa)的抗炎活性增大了3～4倍。然而，甾体类化合物较差的水溶性(溶解度一般为10-5-10-6mol/l)限制了底物与胞内生物酶的有效接触，进而限制了催化反应效率。目前为止，添加有机溶剂是工业上甾体生物合成工艺中普遍用来改善底物溶解性的方法。但有机溶剂的用量却因为其对微生物的不利影响受到严格控制，这大大限制了转化体系中底物的投料量，最终影响产率。此外，转化体系中高浓度的底物和产物也会对菌株的活力产生抑制作用，进而影响其转化产率。因此，提高菌株的胁迫耐受性，尤其是有机溶剂耐受性，是创建高效菌株的有效策略。
irre是来源于耐辐射异常球菌(deinococcusradiodurans)r1的一个全局转录因子。研究者发现，该基因导入宿主菌后能对胞内的整个代谢网络产生重要的调控作用，进而改善生物体的各种胁迫耐受性。但大量的研究表明，基因表达水平与复杂目标表型之间存在着非线性的关系。为了获得理想表型，需要对该基因在宿主生物中的表达水平进行精细调控。
启动子是一段能够被rna聚合酶特异性识别并结合从而起始转录的dna序列，它的结构组成显著影响基因的转录水平。大多数原核生物中，启动子核心区域主要由-10区和-35区组成，这两个保守区域是rna聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力。因此，启动子和σ因子之间序列相似性越高，启动子的强度越高。此外，核糖体结合位点与起始密码子之间的距离也是影响基因表达水平的重要因素。目前，研究者主要采取易错pcr或定点突变技术构建启动子文库，从中筛选得到能对基因表达水平进行精细调控的有效表达元件。
全局转录机制工程是一种全新的改进细胞表型的定向进化方法，通过易错pcr、dnashuffling等技术对细胞中的转录元件进行突变修饰，进而改变rna聚合酶的转录效率和对启动子的亲和能力，使细胞的转录在整体水平上发生改变。因此，该方法在改善由多个基因控制的复杂表型上具有显著的优势。
目前尚未发现采用启动子工程、全局转录机制工程或者二者相结合的方法，对irre基因的表达水平进行精细调控及其定向进化去构建具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株，以及利用该工程菌株进行甾体c1,2脱氢反应的报道。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的公开专利文献。
技术实现要素：
本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法、菌株及其应用，本发明通过启动子工程、全局转录机制工程或者二者相结合的方法，对全局转录因子irre的表达水平进行精细调控和定向进化，创建具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株，为高效简单节杆菌的构建提供一种新策略。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种可适用于简单节杆菌的目标启动子文库，所述目标启动子文库是在表达载体part2野生型启动子hdnop的(序列表中的seqidno.2)基础之上，通过随机突变和定点突变技术获得的启动子突变体，其序列为：seqidno.3，和/或为seqidno.4，和/或为seqidno.5，和/或为seqidno.6，和/或为seqidno.7，和/或为seqidno.8，和/或为seqidno.9，和/或为seqidno.10，和/或为seqidno.11，和/或为seqidno.12，和/或为seqidno.13，和/或为seqidno.14，和/或为seqidno.15，和/或为seqidno.16。
如上所述的可适用于简单节杆菌的目标启动子文库的构建方法，步骤如下：
⑴在质粒part2上野生型启动子hdnop5’端引入限制性酶切位点ecorv，获得重组质粒part2a，便于后续启动子突变体替换质粒上的野生型启动子；
⑵将绿色荧光蛋白egfp编码基因与part2a连接构建重组质粒part2a-egfp；
⑶根据步骤⑴中野生型启动子的序列，设计随机突变引物和定点突变引物；随机突变引物设计的目的是在全启动子区域通过易错pcr引入随机突变，定点突变引物设计的目的是删除原始启动子序列-10区(tatcaat)的碱基c，或增加核糖体结合位点(sd)到起始密码子(atg)之间的碱基个数；
⑷以步骤⑵中重组质粒part2a-egfp为模板，使用步骤⑶中的突变引物pcr扩增得到含有突变位点的启动子核苷酸序列，将其替换质粒part2a-egfp上的野生型启动子；或含有突变位点的全质粒，共同组成表达egfp的启动子突变体质粒库；
⑸将步骤⑷中得到的启动子突变体质粒分别转入大肠杆菌e.colidh5α中，利用流式细胞仪进行流式分选，获得荧光强度前0.1～1％的细胞；将上述获得的细胞涂布在含有卡那霉素的lb固体培养基上培养；
⑹挑取步骤⑸中的单菌落于液体lb试管中过夜培养，利用酶标仪检测荧光强度，获得在大肠杆菌中相对于野生型启动子hdnop具有不同表达强度的启动子突变体；
⑺从步骤⑹获得的在大肠杆菌中具有不同表达强度的启动子突变体中，按表达强度筛选出梯度差异的启动子突变体电转入简单节杆菌中，培养至稳定期，利用酶标仪检测荧光强度，获得在简单节杆菌中具有不同表达强度的目标启动子文库。
包含如上所述的目标启动子文库的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株。
而且，所述简单节杆菌工程菌株还包含野生型irre(w)或irre(w)突变基因irre(m2)，所述野生型irre(w)基因编码的氨基酸序列为：seqidno.1；所述irre(w)突变基因irre(m2)编码的氨基酸序列为：seqidno.17。
而且，所述irre(w)突变基因irre(m2)能够显著提高简单节杆菌的有机溶剂耐受性；
或者，所述irre(w)突变基因irre(m2)携带四个突变位点，分别为arg111his，asp130asn，glu182gly和ser230gly。
而且，所述irre(w)突变基因irre(m2)的构建方法为：
⑴以part2a-irre(w)质粒为模板，分别在不同浓度的mg2 、mn2 、不同模板加入量和不均衡浓度dntps的条件下进行反应，建立易错pcr条件；
⑵以携带野生型irre(w)基因的part2a-irre(w)质粒为模板进行突变，结合步骤⑴中建立的易错pcr条件，获得irre(w)突变基因，连接到质粒part2a上，构建irre基因突变文库；
⑶电转入简单节杆菌后涂布于含有卡那霉素的lb平板上，长出来的单菌落分别接种到含有梯度浓度乙醇的培养基中，初步筛选出生长速率高于对照菌株i的菌株，对照菌株i为含有野生型启动子和野生型irre(w)的菌株，然后在此基础上复筛，筛选出生长速率和最大od600均高于对照菌株i的菌株，最终获得最优耐性菌株pwt-irre(m2)，将优良耐性菌株pwt-irre(m2)培养后重提质粒part2a-irre(m2)，即可获得irre(w)突变基因irre(m2)。
而且，所述简单节杆菌工程菌株具有如下特征：
该菌株表现出优良的胁迫耐受性，压力胁迫条件为乙醇浓度0％-6％，甲醇浓度为0％～8％。其中，与对照菌株i相比，在6％乙醇和8％甲醇压力的生长条件下，工程菌株的最大od600分别提高了10％～125％和1.9％～128.1％；高压力的冲击条件为16％乙醇、20％甲醇和2.5mol/l盐。其中，与对照菌株i相比，在16％乙醇、20％甲醇和2.5mol/l盐的冲击下的最大活菌数分别提高了338.7％～524.2％、103.7％～117.3％和278.0％～380.7％；在45g/l醋酸可的松，8％乙醇的转化体系下，发酵12h和60h时pm1210-irre(m2)工程菌株的活菌数分别是对照菌株ii的4倍和25倍；
其中，对照菌株i为含有野生型启动子和野生型irre(w)的菌株，对照菌株ii为含有空质粒的菌株，上述百分比均为体积百分数。
如上所述的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法，步骤如下：
⑴构建含有不同表达强度启动子突变体和irre(w)或irre(m2)的重组质粒
使用bamhi和xbai两个限制性内切酶处理质粒part2a-irre(w)或part2a-irre(m2)分别获得irre(w)或irre(m2)核苷酸片段，将其替换含有不同表达强度启动子突变体和egfp重组质粒上的egfp片段，获得的重组质粒转入大肠杆菌dh5α，在含有50ug/ml卡那霉素的抗性平板上，37℃过夜培养，对平板上长出的阳性转化子重提质粒后通过pcr、酶切和测序验证，获得含有不同表达强度启动子突变体和irre(w)或irre(m2)的重组质粒；
⑵构建含有不同表达强度启动子突变体和irre(w)或irre(m2)重组质粒的工程菌株
将上述验证正确的重组质粒电转至简单节杆菌感受态中，加入无菌复苏培养基混匀后，32℃缓慢振荡培养11h后，涂布到含有50ug/ml卡那霉素的抗性平板上，32℃倒置培养3～4天，对平板上长出的阳性转化子重提质粒后通过pcr、酶切和测序验证，获得含有不同表达强度启动子突变体和irre(w)或irre(m2)重组质粒的工程菌株，即为具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株。
如上所述的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株在甾体类化合物生物转化方面中的应用。
而且，所述转化的转化体系中乙醇的添加量为8％，底物醋酸可的松(ca)的投料浓度提高为15-45g/l，其c1,2脱氢反应产率较对照菌株i提高了1.1-2.2倍。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明通过启动子工程、全局转录机制工程或者二者相结合的方法，对全局转录因子irre的表达水平进行精细调控和定向进化，创建具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株，为高效简单节杆菌的构建提供一种新策略。
2.本发明提供了一种获得强度分布广泛且梯度差异显著的启动子文库的构建方法，主要包括启动子全区域的随机突变，启动子核心区域的定点突变，以及核糖体结合位点(sd)到起始密码子(atg)距离的优化。三种思路共同作用最终获得了适用于简单节杆菌的目标启动子文库，为后续全局转录因子表达水平的精细调控提供了重要的调控元件。其中，本发明目标启动子文库表达强度较高，启动子序列为序列表中的seqidno.12～seqidno.16效果较好。
3.本发明获得了优良的全局转录因子突变体，全局转录因子突变体的氨基酸序列为序列表中的seqidno.17效果较好。
4、本发明简单节杆菌工程菌株含有不同表达强度启动子调控元件和irre(w)或irre(m2)的重组质粒。其中，不同表达强度启动子调控元件的序列为：seqidno.2、seqidno.12～seqidno.16。其中，irre野生型和突变型的氨基酸序列为seqidno.1和seqidno.17。本发明菌株表现出优良的胁迫耐受性。与对照菌株i相比，在6％乙醇和8％甲醇适当压力的生长条件下，工程菌株的最大od600分别提高了10％～125％和1.9％～128.1％；高压力的冲击条件为16％乙醇、20％甲醇和2.5mol/l盐。其中，与对照菌株i相比，在16％乙醇、20％甲醇和2.5mol/l盐的冲击下的最大活菌数分别提高了338.7％～524.2％、103.7％～117.3％和278.0％～380.7％。在45g/l醋酸可的松，8％乙醇的转化体系下，发酵12h和60h时pm1210-irre(m2)工程菌株的活菌数分别是对照菌株ii(含有空质粒的菌株)的4倍和25倍；
5、本发明简单节杆菌工程菌株可以应用在在甾体类化合物生物转化方面中，转化体系中乙醇的添加量为8％，底物醋酸可的松(ca)的投料浓度提高为15-45g/l。其c1,2脱氢反应产率较对照菌株i(含野生型启动子和野生型irre(w))提高了1.1-2.2倍。
附图说明
图1为本发明中33个启动子突变体在大肠杆菌中相对野生型启动子的egfp荧光强度图；
图2为本发明中目标启动子文库在大肠杆菌和简单节杆菌中分别表达egfp的相对荧光强度图(a)和表达强度的相关性分析图(b)；
图3为本发明中irre差异表达菌株中irre的相对表达水平图；
图4为本发明中irre差异表达菌株的胁迫耐受性图；其中，(a)：6％乙醇下的生长曲线；(b)8％甲醇下的生长曲线；(c)16％(v/v)乙醇、20％(v/v)甲醇或2.5mol/lnacl冲击1h后的存活情况；
图5为本发明中pwt-irre(m2)工程菌株的胁迫耐受性图；其中，(a)：6％乙醇下的生长曲线；(b)8％甲醇下的生长曲线；(c)16％(v/v)乙醇、20％(v/v)甲醇或2.5mol/lnacl冲击1h后的存活情况；
图6为本发明中含有不同强度启动子突变体和irre(w)或irre(m2)重组质粒的系列简单节杆菌工程菌株的甾体c1,2脱氢反应性能图；其中，i：15g/lca，8％乙醇；ii：35g/lca，8％乙醇；iii：45g/lca，8％乙醇。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种可适用于简单节杆菌的目标启动子文库，所述目标启动子文库是在表达载体part2野生型启动子hdnop的(序列表中的seqidno.2)基础之上，通过随机突变和定点突变技术获得的启动子突变体，其序列为：seqidno.3，和/或为seqidno.4，和/或为seqidno.5，和/或为seqidno.6，和/或为seqidno.7，和/或为seqidno.8，和/或为seqidno.9，和/或为seqidno.10，和/或为seqidno.11，和/或为seqidno.12，和/或为seqidno.13，和/或为seqidno.14，和/或为seqidno.15，和/或为seqidno.16。
如上所述的可适用于简单节杆菌的目标启动子文库的构建方法，步骤如下：
⑴在质粒part2上野生型启动子hdnop5’端引入限制性酶切位点ecorv，获得重组质粒part2a，便于后续启动子突变体替换质粒上的野生型启动子；
⑵将绿色荧光蛋白egfp编码基因与part2a连接构建重组质粒part2a-egfp；
⑶根据步骤⑴中野生型启动子的序列，设计随机突变引物和定点突变引物；随机突变引物设计的目的是在全启动子区域通过易错pcr引入随机突变，定点突变引物设计的目的是删除原始启动子序列-10区(tatcaat)的碱基c，或增加核糖体结合位点(sd)到起始密码子(atg)之间的碱基个数；
⑷以步骤⑵中重组质粒part2a-egfp为模板，使用步骤⑶中的突变引物pcr扩增得到含有突变位点的启动子核苷酸序列，将其替换质粒part2a-egfp上的野生型启动子；或含有突变位点的全质粒，共同组成表达egfp的启动子突变体质粒库；
⑸将步骤⑷中得到的启动子突变体质粒分别转入大肠杆菌e.colidh5α中，利用流式细胞仪进行流式分选，获得荧光强度前0.1～1％的细胞；将上述获得的细胞涂布在含有卡那霉素的lb固体培养基上培养；
⑹挑取步骤⑸中的单菌落于液体lb试管中过夜培养，利用酶标仪检测荧光强度，获得在大肠杆菌中相对于野生型启动子hdnop具有不同表达强度的启动子突变体；
⑺从步骤⑹获得的在大肠杆菌中具有不同表达强度的启动子突变体中，按表达强度筛选出梯度差异的启动子突变体电转入简单节杆菌中，培养至稳定期，利用酶标仪检测荧光强度，获得在简单节杆菌中具有不同表达强度的目标启动子文库。
包含如上所述的目标启动子文库的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株。
而且，所述简单节杆菌工程菌株还包含野生型irre(w)或irre(w)突变基因irre(m2)，所述野生型irre(w)基因编码的氨基酸序列为：seqidno.1；所述irre(w)突变基因irre(m2)编码的氨基酸序列为：seqidno.17。
而且，所述irre(w)突变基因irre(m2)能够显著提高简单节杆菌的有机溶剂耐受性；
或者，所述irre(w)突变基因irre(m2)携带四个突变位点，分别为arg111his，asp130asn，glu182gly和ser230gly。
而且，所述irre(w)突变基因irre(m2)的构建方法为：
⑴以part2a-irre(w)质粒为模板，分别在不同浓度的mg2 、mn2 、不同模板加入量和不均衡浓度dntps的条件下进行反应，建立易错pcr条件；
⑵以携带野生型irre(w)基因的part2a-irre(w)质粒为模板进行突变，结合步骤⑴中建立的易错pcr条件，获得irre(w)突变基因，连接到质粒part2a上，构建irre基因突变文库；
⑶电转入简单节杆菌后涂布于含有卡那霉素的lb平板上，长出来的单菌落分别接种到含有梯度浓度乙醇的培养基中，初步筛选出生长速率高于对照菌株i的菌株，对照菌株i为含有野生型启动子和野生型irre(w)的菌株，然后在此基础上复筛，筛选出生长速率和最大od600均高于对照菌株i的菌株，最终获得最优耐性菌株pwt-irre(m2)，将优良耐性菌株pwt-irre(m2)培养后重提质粒part2a-irre(m2)，即可获得irre(w)突变基因irre(m2)。
而且，所述简单节杆菌工程菌株具有如下特征：
该菌株表现出优良的胁迫耐受性，压力胁迫条件为乙醇浓度0％-6％，甲醇浓度为0％～8％。其中，与对照菌株i相比，在6％乙醇和8％甲醇压力的生长条件下，工程菌株的最大od600分别提高了10％～125％和1.9％～128.1％；高压力的冲击条件为16％乙醇、20％甲醇和2.5mol/l盐。其中，与对照菌株i相比，在16％乙醇、20％甲醇和2.5mol/l盐的冲击下的最大活菌数分别提高了338.7％～524.2％、103.7％～117.3％和278.0％～380.7％；在45g/l醋酸可的松，8％乙醇的转化体系下，发酵12h和60h时pm1210-irre(m2)工程菌株的活菌数分别是对照菌株ii的4倍和25倍；
其中，对照菌株i为含有野生型启动子和野生型irre(w)的菌株，对照菌株ii为含有空质粒的菌株，上述百分比均为体积百分数。
如上所述的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法，步骤如下：
⑴构建含有不同表达强度启动子突变体和irre(w)或irre(m2)的重组质粒
使用bamhi和xbai两个限制性内切酶处理质粒part2a-irre(w)或part2a-irre(m2)分别获得irre(w)或irre(m2)核苷酸片段，将其替换含有不同表达强度启动子突变体和egfp重组质粒上的egfp片段，获得的重组质粒转入大肠杆菌dh5α，在含有50ug/ml卡那霉素的抗性平板上，37℃过夜培养，对平板上长出的阳性转化子重提质粒后通过pcr、酶切和测序验证，获得含有不同表达强度启动子突变体和irre(w)或irre(m2)的重组质粒；
⑵构建含有不同表达强度启动子突变体和irre(w)或irre(m2)重组质粒的工程菌株
将上述验证正确的重组质粒电转至简单节杆菌感受态中，加入无菌复苏培养基混匀后，32℃缓慢振荡培养11h后，涂布到含有50ug/ml卡那霉素的抗性平板上，32℃倒置培养3～4天，对平板上长出的阳性转化子重提质粒后通过pcr、酶切和测序验证，获得含有不同表达强度启动子突变体和irre(w)或irre(m2)重组质粒的工程菌株，即为具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株。
如上所述的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株在甾体类化合物生物转化方面中的应用。
而且，所述转化的转化体系中乙醇的添加量为8％，底物醋酸可的松(ca)的投料浓度提高为15-45g/l，其c1,2脱氢反应产率较对照菌株i提高了1.1-2.2倍。
一、重组质粒part2a-egfp的构建。
本发明利用绿色荧光蛋白(egfp)作为报告基因以描述和表征调控其表达的启动子强度。为了便于对野生型启动子的替换，首先需要在启动子hdnop5’端引入了一个ecorv酶切位点。
具体方法如下：
(1)以part2载体为模板，用引物part2-f和part2-r扩增part2质粒上在启动子hdnop5’端引入了一个ecorv酶切位点的核苷酸序列。
part2-f：cccatggtcttgacaa
part2-r：cccatggagcgtcagaccc
表1：pcr反应体系
pcr反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸2min，30循环后72℃延伸10min。
将上述获得的核苷酸序列和part2质粒分别用限制性内切酶ncoi处理(37℃，2h)，利用pcr产物纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)分别回收目的片段，将酶切后的质粒和核苷酸序列按1:3(物质的量之比)的比例进行连接反应(16℃，12h)，连接产物转入大肠杆菌dh5α，在含有50ug/ml卡那霉素的抗性平板上，37℃过夜培养，对平板上长出的阳性转化子重提质粒后通过pcr、酶切和测序验证，经筛选获得重组质粒part2a。
(2)将绿色荧光蛋白连接于质粒part2a上，就构建成功了part2a-egfp。
二、大肠杆菌中启动子文库的构建和高通量筛选
(1)在重组质粒part2a-egfp上野生型启动子hdnop的全区域引入随机突变。具体方法如下：以重组质粒part2a-egfp为模板，以hdnop-f和hdnop-r为易错pcr引物，在mn2 浓度为0.5mm，mg2 浓度分别为4，5，6mm的条件下对质粒part2a-egfp上的野生型启动子hdnop进行随机突变。pcr扩增突变的反应体系如表2，扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。
hdnop-f：aggatatctcttgacaaggacaagtgtcc；
hdnop-r：cgggatccatttccaactcctttgtctg；
表2：易错pcr反应体系
采用omegae.z.n.a.tmcycle-pure试剂盒将经过琼脂糖凝胶电泳验证条带大小。将大小正确的pcr产物进行纯化，然后充分混匀，并以其为模板进行第二轮易错pcr，获得的pcr产物连接到使用相同限制性内切酶(ecorv，bamhi)处理的质粒part2a-egfp上，转入大肠杆菌dh5α，平板涂布过夜培养。
(2)在重组质粒part2a-egfp上野生型启动子hdnopsd到atg之间引入定点突变。具体方法如下：设计用来改变重组质粒part2a-egfp上野生型启动子hdnop中sd到atg之间的碱基个数的突变引物(表3)。以重组质粒part2a-egfp为模板，pcr扩增突变的反应体系如表1，扩增条件为95℃预变性5分钟，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。
表3：改变野生型启动子hdnop中sd到atg之间碱基个数的突变引物
获得的pcr产物连接到使用相同限制性内切酶(ecori，bamhi)处理的质粒part2a-egfp上，转入大肠杆菌dh5α，平板涂布过夜培养。
(3)在重组质粒part2a-egfp上野生型启动子hdnop核心区域-10区引入定点突变。具体方法如下：以重组质粒part2a-egfp为模板，以-10△c-f和-10△c-r为引物，利用诺唯赞快速定点突变试剂盒mutexpressiifastmutagenesiskitv2，扩增出删除hdnop启动子-10区(tatcaat)碱基c的全质粒，转入大肠杆菌dh5α，平板涂布过夜培养。
-10△c-f：tataatagggtgatcactctctcgaag；
-10△c-r：gatcaccctattatacatggacagctg；
(4)取5ml经过灭菌处理的pbs溶液加入上述步骤(1)、(2)、(3)中获得的长出菌落的平板内，用灭菌的大吸头刮取菌落，制备菌悬液。将上述全部菌悬液转接到装有50mllb培养基(含有50μg/ml的卡那霉素)的250ml的三角瓶中，37℃，200r/min过夜培养。取1ml培养液于1.5ml离心管中，4℃，3000r/min，离心5min收集菌体并利用pbs缓冲液洗涤两遍并重悬。将菌液稀释至od600＝0.1～0.5。将获得的菌体利用流式细胞仪mofloxdpflowcytometrysorter(beckmancoulter,usa)进行流式分选。选择荧光通道为激发波488nm，发射波长为530/40通道。选择流式细胞仪纯化模式提高筛选文库中阳性克隆的比例。分选荧光强度前0.1～1％的细胞。将分选后的菌株培养液全部转接于5ml的lb液体培养基试管，37℃，200r/min复苏培养8h。从上述培养液中取出200μl菌液在含有50μg/ml的卡那霉素的lb平板上进行涂布分离，37℃过夜培养。
(5)将平板上长出的单菌落分别接种到装有5ml含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基的试管中，37℃、200r/min振荡培养14h。将培养液转接到新鲜的lb液体培养基中并使培养液初始od600＝0.1，5000rpm/min离心2min收集菌体，加入1ml无菌水洗涤2次后，重悬于1ml无菌水中制备成菌悬液。取200μl菌悬液分别加入透明96孔板(costar96flatwhite)和黑色96孔板(costar96flatblack)中，利用微孔板检测仪(biotek,synergy4)检测其od600和荧光强度，检测时激发波长为488nm，发射波长为520nm。
利用上述方法，一共获得约500株启动子突变体，结合其在大肠杆菌中的相对荧光强度分布，选出33株具有不同(低、中、高)相对荧光强度的样本组成启动子文库(如图1所示)。
三、目标启动子文库在大肠杆菌和简单节杆菌中的表征
根据图1的相对荧光强度，从上述包含33株不同强度样本的启动子文库中选出13株梯度差异的启动子组成目标启动子文库。提取质粒后用电击转化法转入简单节杆菌中，检测相对荧光强度(rfu/od600)并进行相关性分析。由图2a可知，这些启动子突变体的相对荧光强度的水平从最低的247(pm226，seqidno.3)到最高的3002(pm798,seqidno.16)，跨度适中。以野生型启动子的表达水平为1，启动子突变体的相对表达强度变化范围为26％～316％，满足了对目的基因的不同强度的控制。由图2b可知，这些启动子突变体在简单节杆菌和大肠杆菌中的表达强度具有良好的相关性(图r2＝0.9889)。这说明上述启动子元件在调控基因在不同宿主中表达时，具有良好的稳定性。
四、irre差异表达菌株的构建和验证
为了获得得到胁迫耐受性能更好的简单节杆菌工程菌株，本实施例中选择pm680，pm470，pm588，pm1210，pm798这5个表达强度存在梯度差异的启动子突变体，其序列分别为序列表中的seqidno.9、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.15、seqidno.16，分别调控野生型全局转录因子irre在简单节杆菌中的表达。主要实验过程如下：
(1)构建含有不同表达强度启动子和irre(w)的重组质粒
以耐辐射异常球菌(deinococcusradiodurans)r1基因组为模板，以irre-f(cgggatcccagtgccaacgtcagccc)和irre-r(tgctctagactgtgcagcgtcctgcg)为引物，利用pcr扩增得到irre(w)基因的核苷酸片段，并连接到使用相同限制性内切酶(优选bamhi，xbai)处理的part2a质粒上，得到重组质粒part2a-irre(w)。
pcr扩增反应体系如表4，扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。
表4：pcr反应体系
用获得的pcr产物替换含有不同表达强度启动子突变体和egfp重组质粒上的egfp片段，化转入大肠杆菌dh5α，在含有50ug/ml卡那霉素的抗性平板上，37℃过夜培养，对平板上长出的阳性转化子重提质粒后通过pcr、酶切和测序验证，经筛选获得含有不同表达强度启动子突变体和irre(w)的重组质粒。
(2)构建含有不同表达强度启动子和irre(w)的简单节杆菌工程菌株
将上述获得的重组质粒电转至简单节杆菌感受态中，加入无菌复苏培养基混匀后，32℃缓慢振荡培养11h后，涂布到含有50ug/ml卡那霉素的抗性平板上，32℃倒置培养3～4天，对平板上长出的阳性转化子重提质粒后通过pcr、酶切和测序验证，获得含有不同表达强度启动子和野生型irre(w)的工程菌株，分别命名为pm680-irre(w)，pm470-irre(w)，pm588-irre(w)，pm1210-irre(w)，pm798-irre(w)。
(3)简单节杆菌工程菌株中irre的表达水平
分别从斜面挑取irre差异表达工程菌株接种于添加终浓度为50ug/ml的卡那霉素lb液体培养基中，32℃，160r/min振荡培养40h。以4％(v/v)的接种量转接入新鲜的lb液体培养基(蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l)中，32℃，160r/min振荡培养至菌液od600约为4.0。
将上述培养液置于冰上至少10min，然后5000r/min，4℃离心15min，收集菌体。用冷却的pbs缓冲液洗涤两次，加入10ml菌体破碎液涡旋振荡重悬菌体。将重悬后的菌体在冰浴条件下超声破碎，直至菌液变至透亮。4℃，6000r/min离心10min后收集上清，制备蛋白样品，-80℃保存；然后，经过sds-page电泳、转膜、封闭、抗体结合免疫反应；最后，利用odyssey红外激光成像系统对pvdf膜进行扫描成像，具体参数为：700nm扫描通道，扫描4s。利用imagej软件对目的条带进行灰度扫描，计算其积分光密度值(iod)，实验中，以gapdh(3-磷酸甘油醛脱氢酶)作为内参，irre蛋白的表达水平等于irre条带和内参条带iod的比值。如图3所示，将野生型启动子介导的irre表达的简单节杆菌(pwt-irre(w))中irre蛋白表达量设置为1，简单节杆菌irre差异表达菌株pm470-irre(w)、pm588-irre(w)、pm680-irre(w)、pm798-irre(w)和pm1210-irre(w)中的irre蛋白表达量分别为1.09、1.44、1.18、2.10和1.70，这说明简单节杆菌irre差异表达菌株构建成功。
五、irre差异表达工程菌株的胁迫耐受性分析
(1)irre差异表达工程菌株在不同浓度乙醇和甲醇压力下的生长情况
分别从斜面挑取irre差异表达工程菌株pm680-irre(w)，pm470-irre(w)，pm588-irre(w)，pm1210-irre(w)，pm798-irre(w)、对照菌株i(含有野生型启动子和野生型irre(w))，pwt-irre(w))和对照菌株ii(含有空质粒，part2a)接种于含有终浓度为50ug/ml的卡那霉素液体lb培养基中，32℃，160r/min下振荡培养40h，以一定的接种量转接入含有6％(v/v)乙醇或8％(v/v)甲醇的新鲜液体培养基中，并将初始od600调成一致(0.2)，32℃，160r/min振荡培养，每隔一定时间取样测定od600，绘制菌株在适当压力下的生长曲线。实验中含质粒菌株培养基中还需添加终浓度为50ug/ml的卡那霉素。由图4(a)可知，添加6％乙醇的生长体系下，6个简单节杆菌irre差异表达菌株均表现出良好的生长能力，最大od600在2.0～2.9之间。其中，pm798-irre(w)菌株的生长性能最好，培养72h时od600值达到2.9，对照菌株i最大od600为2.0；对照菌株ii未见明显生长。图4(b)可知，添加8％甲醇的生长体系下，简单节杆菌irre差异表达菌株的生长性能(最大od600在3.2～7.3之间)。其中，pm798-irre(w)菌株的生长性能最好，培养72h后od600值达到最大为7.3，对照菌株i的最大od600为3.2；对照菌株ii最大od600值为2.1。
(2)irre差异表达工程菌株在高浓度压力冲击下的存活情况
分别从斜面挑取irre差异表达工程菌株pm680-irre(w)，pm470-irre(w)，pm588-irre(w)，pm1210-irre(w)，pm798-irre(w)、对照菌株i(含有野生型启动子和野生型irre，pwt-irre(w))和对照菌株ii(含有空质粒，part2a)接种于含有终浓度为50ug/ml的卡那霉素液体lb培养基中，32℃，160r/min，下振荡培养40h，以一定的接种量转接入新鲜的lb液体培养基中，并将初始od600值均调节至1.0。取1ml培养液加入到4ml分别含有16％乙醇、18％甲醇、2.5mol/lnacl的添加终浓度为50ug/ml的卡那霉素lb液体培养基中，32℃，160r/min振荡1h。将上述培养液采用10倍逐级稀释法在lb平板上进行培养，32℃培养一定时间后观察平板菌株的存活情况，计算存活率。
由图4(c)可知，16％(v/v)乙醇冲击1h后，简单节杆菌irre差异表达菌株的存活率在10.7％～66.8％之间。其中，pm798-irre菌株表现出最高的存活率，达到66.8％，对照菌株i的存活率为10.7％，对照菌株ii的存活率仅为6.3％；在20％(v/v)甲醇冲击1h后，简单节杆菌irre差异表达菌株的存活率在29.7％～82.4％之间。其中，pm798-irre(w)具有最高的存活率，达到82.4％，对照菌株i的存活率为29.7％，对照菌株ii的存活率为23.4％。进一步考察了菌株在对2.5mol/lnacl冲击1h下的存活率，结果发现，简单节杆菌irre差异表达菌株的存活率在17.2％～82.7％之间。其中，pm798-irre(w)具有最高的存活率，达到82.7％，对照菌株i的存活率为17.2％，对照菌株ii的存活率为13.4％；上述结果说明，irre在宿主生物中表达水平的提高显著增强了菌株的胁迫耐受性。
六、irre突变文库的构建
(1)易错pcr条件的建立
利用一轮易错pcr对野生型irre(w)基因进行随机突变。易错pcr反应体系中以irre-f和irre-r作为引物，以part2a-irre(w)质粒为模板，分别在不同浓度的mg2 (2、3、4、5、6和7mmol/l)、mn2 (0.1、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4和0.45mmol/l)、不同模板加入量(5、3、1和0.5ng)和不均衡浓度dntps(摩尔比为a:t:c:g＝1:5:1:5)的条件下进行反应。
irre-f：cgggatcccagtgccaacgtcagccc
irre-r：tgctctagactgtgcagcgtcctgcg
pcr扩增突变的反应体系如表6，扩增条件为95℃预变性5分钟，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。
表6：pcr反应体系
优化得到易错pcr的条件：mg2 浓度为3mmol/l，mn2 浓度为0.3mmol/l，模板加入量为0.5ng。
(2)irre突变文库的获得
采用上述(1)中易错pcr的条件进行pcr扩增，将pcr产物连接于用相同限制性内切酶处理的质粒part2a-irre(w)上，将连接产物电转入到简单节杆菌感受态细胞中，在含有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基上32℃倒置过夜培养，将平板上长出的菌落刮取下来制备成一个细胞数为105的液体文库。
七、irre优良突变体的筛选
(1)将液体突变文库全部接种到含有终浓度50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，32℃培养到对数期后转接到相同培养基中进行二级培养，连续转接2-3次，每次转接按2％(v/v)增加的梯度提高培养基中乙醇的浓度，直到乙醇浓度为8％，并将8％条件下的培养液涂布在含有50μg/ml卡那霉素的lb固体平板上，32℃培养过夜。
(2)挑取平板上长出的若干单菌落，分别接种于50ml含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，32℃，160r/min，振荡培养48h，吸取部分菌液接种到250ml三角瓶装有50ml添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素和0％、4％、6％不同浓度乙醇的液体lb培养基中，用lb液体培养基将上述菌株培养液的初始od600值均调为0.2，32℃，160r/min，振荡培养，间隔一段取样测定od600值。将生长性能明显高于野生型irre(w)重组菌株的的菌株认定是有机溶剂耐受性提高的候选突变株。
(3)初步筛选出生长速率高于对照菌株i(含有野生型启动子和野生型irre(w))的菌株，然后在此基础上复筛，筛选出生长速率和最大od600均高于对照菌株i的菌株。经过梯度浓度的乙醇的初筛和复筛，初步筛选出生长速率高于对照菌株i的菌株，对照菌株i为含有野生型启动子和野生型irre(w)的菌株，然后在此基础上复筛，筛选出生长速率和最大od600均高于对照菌株i的菌株，最终获得最优耐性菌株pwt-irre(m2)，获得了1株乙醇耐受性能提高的菌株pwt-irre(m2)。将优良耐性菌株pwt-irre(m2)培养后重提质粒part2a-irre(m2)，交由苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。其测序结果见列表中的：seqidno.17。该突变型irre(w)与野生型相比，核苷酸序列上发生了6处突变，分别是332位g突变为a；388位g突变为a；489位a突变为g；545位a突变为g；663位c突变为t；688位a突变为g。相应的氨基酸有4处突变位点，分别为arg111his，asp130asn，glu182gly和ser230gly。
八、简单节杆菌pwt-irre(m2)的胁迫耐受性分析
分别从斜面挑取pwt-irre(m2)工程菌株、对照菌株i(pwt-irre)和对照菌株ii(part2a)接种于终浓度为50ug/ml的卡那霉素液体lb培养基中，32℃，160r/min下振荡培养40h，以一定的接种量转接入含有6％(v/v)乙醇或8％(v/v)甲醇、终浓度为50ug/ml的卡那霉素新鲜的液体lb培养基中，并将初始od600调成一致(0.2)，32℃，160r/min振荡培养，每隔一定时间取样测定od600，绘制菌株在适当压力下的生长曲线。如图5(a)所示，添加6％乙醇的生长体系下，菌株pwt-irre(m2)比其他菌株表现出更好的生长性能，最大od600达到4.5，而对照菌株i菌株和对照菌株ii的od600分别为2.0和0.5。由5(b)可知，添加8％甲醇的生长体系下，pwt-irre(m2)菌株在培养60h时od600达到最大，为5.1，而此时对照菌株i菌株和对照菌株ii的od600分别为3.2和2.1。
(2)pwt-irre(m2)菌株在高浓度压力冲击下的存活情况
分别从斜面挑取irre优良突变体表达菌株pwt-irre(m2)、对照菌株i(pwt-irre(w))、和对照菌株ii(part2a)接种于添加含有终浓度为50ug/ml的卡那霉素液体lb培养基中，32℃，160r/min下振荡培养40h，以一定的接种量转接入含有终浓度为50ug/ml的卡那霉素新鲜的lb液体培养基中，并将初始od600值均调节至1.0。取1ml培养液加入到4ml分别含有16％乙醇、20％甲醇、2.5mol/lnacl的lb液体培养基中，32℃，160r/min振荡1h。将上述培养液采用10倍逐级稀释法在lb平板上进行培养，32℃培养一定时间后观察平板菌株的存活情况，计算存活率。
由5(c)可知，在16％(v/v)乙醇冲击1h后，pwt-irre(m2)菌株的存活率为15.4％，对照菌株i的存活率为10.7％，对照菌株ii的存活率仅为6.3％；在20％(v/v)甲醇冲击1h后，pwt-irre(m2)菌株的存活率为34.4％，对照菌株ii和对照菌株i的存活率分别为29.7％和23.4％；在2.5mol/lnacl冲击1h后，pwt-irre(m2)菌株的存活率为24.1％，对照菌株i和对照菌株ii的存活率分别为17.2％和13.4％。
上述结果表明，pwt-irre(m2)菌株表现出更好胁迫耐受性。
九、含有不同强度启动子突变体和irre(m2)的简单节杆菌工程菌株的构建
本实施例选择pm1210和pm798这2个具有较高表达强度的启动子突变体和野生hdnop启动子介导irre(m2)在简单节杆菌中的表达。工程菌株的构建过程如下：
(1)构建含有不同强度启动子突变体和irre(m2)的重组质粒
使用bamhi和xbai两个限制性内切酶处理质粒part2a-irre(m2)，获得irre(m2)核苷酸片段，将其替换质粒part2a-egfp上的egfp片段。获得的重组质粒转入大肠杆菌dh5α，在含有50ug/ml卡那霉素的抗性平板上，37℃过夜培养，对平板上长出的阳性转化子重提质粒后通过pcr、酶切和测序验证，获得含有不同表达强度启动子突变体和irre(m2)的重组质粒。
(2)构建含有不同强度启动子突变体和irre(m2)的重组质粒的工程菌株
将上述获得的重组质粒电转至简单节杆菌感受态中，加入无菌复苏培养基混匀后，32℃缓慢振荡培养11h后，涂布到含有50ug/ml卡那霉素的抗性平板上，34℃倒置培养3～4天，对平板上长出的阳性转化子重提质粒后通过pcr、酶切和测序验证，获得含有不同表达强度启动子突变体调控的irre(m2)重组质粒的工程菌株，即pm1210-irre(m2)，pm798-irre(m2)工程菌株。
十、简单节杆菌工程菌株的甾体c1,2脱氢反应性能
(1)静息细胞的制备
分别从斜面挑取pwt-irre(m2)、pm798-irre(w)、pm1210-irre(w)、pm1210-irre(m2)、pm798-irre(m2)，对照菌株i(pwt-irre(w))和对照菌株ii(part2a)、接种于含有终浓度为50ug/ml卡那霉素抗性液体lb培养基中，32℃，160r/min下振荡培养40h，以一定的接种量转接入有终浓度为50ug/ml卡那霉素抗性的液体lb培养基中，并将初始od600调成一致(0.2)，32℃，160r/min振荡培养至对数期生长期，加入终浓度为0.5g/l的底物醋酸可的松(ca)诱导c1,2位脱氢酶产生，32℃，160r/min继续振荡培养18h后，7000r/min，4℃离心10min，收集的菌体用预冷的ph7.2的0.1m的kh2po4-naoh溶液(pbs缓冲溶液)洗涤2次，将菌体悬浮于适量的pbs缓冲液中制备得到静息细胞。
(2)甾体底物转化
转化体系包括以下三种：
转化体系i–菌体od600为2.0，底物ca浓度为15g/l，8％乙醇助溶；
转化体系ii–菌体od600为2.0，底物ca浓度为35g/l，8％乙醇助溶；
转化体系iii–菌体od600为2.0，底物ca浓度为45g/l，8％乙醇助溶。
在34℃，180r/min分别震荡转化一段时间后，分别从三个体系中取样测定产物醋酸泼尼松(pa)的浓度。每次取样0.2ml加入1.6ml乙酸乙酯终止反应，超声萃取10min以上，12000r/min离心10min，通过hplc法测定产物的生成量。
hplc检测条件为：
高效液相色谱仪：agilent1100serieslc(g1314pump，g1322adegasserg1314vwd检测器，10ul，an进样器，hpchemstation)；
色谱柱：agelavenusilxbpsilica：250mm×4.6mm×5μm；
流动相：二氯甲烷：乙醚：甲醇(86：12：2)；
柱温：30℃；
进样量：10μl；
流速：1.0ml/min；
检测器：uvdetetor，波长：240nm。
如图6所示，在不同转化体系下，与对照菌株i相比，工程菌株转化醋酸可的松生成醋酸泼尼松pa的产量均有不同程度地提高。工程菌株在高浓度有机溶剂(8％)和底物(15-45g/l)的转化体系下仍保持良好的活性，其c1,2脱氢反应产率较对照菌株提高了1.1-2.2倍。其中，在体系ii下，优良耐受菌株pwt-irre(m2)、pm798-irre(w)、pm1210-irre(w)、pm1210-irre(m2)、pm798-irre(m2)的醋酸泼尼松的最大生成量分别为：24.5、20.3、23.3、26.8、29.5g/l，比对照菌株i(13.7g/l)分别提高了1.8、1.5、1.7、2.0、2.2倍。
十一、最优工程菌株和对照菌株ii在甾体c1,2脱氢反应体系中的存活情况
分别从斜面挑取最优工程菌株pm1210-irre(m2)和对照菌株ii(含有空质粒，part2a)接种于含有终浓度为50ug/ml的卡那霉素液体lb培养基中，32℃，160r/min下振荡培养40h，以一定的接种量转接入有终浓度为50ug/ml卡那霉素抗性的新鲜液体培养基中，并将初始od600调成一致(0.2)，32℃，160r/min振荡培养至对数期生长期，加入终浓度为0.5g/l的底物醋酸可的松(ca)诱导c1,2位脱氢酶产生，32℃，160r/min继续振荡培养18h后，加入45g/lca和8％乙醇，进行发酵实验。发酵12h、60h过程取出发酵液100ul，将上述培养液采用10倍逐级稀释法在lb平板(添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素)上进行培养，32℃培养一定时间后平板计数。
实验结果表明，在45g/l醋酸可的松和8％乙醇的转化体系下，发酵12h，最优工程菌株的活菌数为6.0×106(cfu/ml)，是对照菌株ii(1.5×106(cfu/ml))的4倍；发酵60h后，最优工程菌株的活菌数5.0×104(cfu/ml)，是对照菌株ii(2.0×103(cfu/ml))的25倍。
序列表
seqidno.1
野生型irre基因编码的氨基酸序列
valproseralaasnvalserproprocysproserglyvalargglyglyglymetglyprolysalalysalaglualaserlysprohisproglnileprovallysleuprophevalthralaproaspalaleualaalaalalysalaargmetargaspleualaalaalatyrvalalaalaleuproglyargaspthrhisserleumetalaglyvalproglyvalaspleulysphemetproleuglytrpargaspglyalapheaspprogluhisasnvalileleuileasnseralaalaargprogluargglnargphethrleualahisgluileglyhisalaileleuleuglyaspaspaspleuleuseraspilehisaspalatyrgluglygluargleugluglnvalilegluthrleucysasnvalalaalaalaalaileleumetprogluprovalilealaglumetleugluargpheglyprothrglyargalaleualagluleualalysargalagluvalseralaserseralaleutyralaleuthrgluglnthrprovalprovaliletyralavalcysalaproglylysproproarggluglnalaalaseraspgluaspalaglyproserthrglulysvalleuthrvalargalaserserserthrargglyvallystyrthrleualaserglythrprovalproalaasphisproalaalaleualaleualathrglymetgluvalarggluglusertyrvalpropheargserglyarglysmetlysalagluvalaspalatyrproserargglyilevalalavalserpheglupheaspproalaargleuglyarglysaspsergluglnalaaspargaspgluproglnaspalaalagln
野生型启动子核苷酸序列
seqidno.2
gtcttgacaaggacaagtgtccatgtcagggacaaagagcgatgtgttccggcctcccctagtcccgcaaaaataacccccattgacatggacagctgtccatgtatcaatagggtgatcactctctcgaagacgagaatgctgattgtcagcagacaaaggagttggaaat
启动子突变体核苷酸序列
seqidno.3
gtcttgacaagcacaagtgtccttgtcagggacaaagagcgatgtgttccggcctcccctagtcccgcaaaaataacccccattgacatggacagctgtccatgtatcaatagggtgatcactctctcgaagacgagaatgctgattgacagcagacaaaggagttggaaat
seqidno.4
gtcttgacaagcacaagtgtccttgtcagggacaaagagcgatgtgttccggcctcccctagtcccgcaaaaataacccccattgacatggacagctgtccatgtatcaatagggtgatcactctctcgaagacgagaatgctgattgacagcagacaaaggagttggaaat
seqidno.5
gtcttgacaagcacaagtgtccttgtcagggacaaagagcgatgtgttccggcctcccctagtcccgcaaaaataacccccattgacatggacagctgtccatgtatcaatagggtgatcactctctcgaagacgagaatgctgattgacagcagacaaaggagttggaaat
seqidno.6
gtcttgacaaggacaagtgtccttgtcagggacaaagagcgatgtgttccggccccccctagtcccgcaaaagtatcccccattgacatggacagctgtccatgtttcaatagggtgatcactctcttgaagacgagaatgcagattgtcagcagacaaaggagttggaaat
seqidno.7
gtcttgacaaggacaagtgtccatgtcagggacaaagagcgatgtgttccggcctcccctagtcccgcaaaaataacccccattgacatggacagctgtccatgtatcaatagggtgatcactctctcgaagacgagaatgctgattgtcagcagacaaaggagttggaattat
seqidno.8
gtcttgacaaggacaagtgtccatgtcagggacaaagagcgatgtgttccggcctcccctagtcccgcaaaaataacccccattgacatggacagctgtccatgtatcaatagggtgatcactctctcgaagacgagaatgctgattgtcagcagacaaaggagttggaaaat
seqidno.9
gtcttgacaaggacaagtgtccttgtcagggacaaagagcgaagtgttccggcctcccctagtcccgcaaaaataacccccattgacatgggcagctgtccatgtatcaatagggtgatcactctctcgaagacgagaatgctgattgtctgcagacaaaggagttggaaat
seqidno.10
gtcttgacaaggacaagtgtccatgtcagggacaaagagcgatgtgttccggcctcccctagtcccgcaaaaataacccccattgacatggacagctgtccatgtatcaatagggtgatcactctctcgaagacgagaatgctgattgtcagcagacaaaggagttggtaaattat
seqidno.11
gtcttgacaaggacaagtgtccatgtcagggacaaagagcgatgtgttccggcctcccctagtcccgcaaaaataacccccattgacatggacagctgtccatgtatcaatagggtgatcactctctcgaagacgagaatgctgattgtcagcagacaaaggagttggaaattat
seqidno.12
gtcttgacaaggacaagtgtccttgtcagggacaaagagcgatgtgttccggcctcccctagtcccgcaaaaataacccccattgacttggacagctgtccatgtatcaatagggtgatcactctctcgaagacgagaatgctgattgtcagcagacaaaggagttggaaat
seqidno.13
gtctcgacaaggacaagtgtccttgtcagggacaaagagcgatgtgttccggcctcccctagtcccgcaaaagtaacccccattgacatggacagctgtccatgtatcaatagggtgatcactctcttgaatacgagaatgctgattgtcagcagacaaaggagttggaaat
seqidno.14
gtcttgacaaggacaagtgtccatgtcagggacaaagagcgatgtgttccggcctcccctagtcccgcaaaaataacccccattgacatggacagctgtccatgtat.aatagggtgatcactctctcgaagacgagaatgctgattgtcagcagacaaaggagttggaaat
seqidno.15
gtcttgacaaggacaagtgtccttgtcagggacaaagagcgatgtgttccggccccccctagtcccgcaaaagtatcccccattgacatggacagctgtccatgtttcaatagggtgatcactctcttgaagacgagaatgcagattgtcagcagacaaaggagttggaaat
seqidno.16
gtcttgacaaggacaagtgtccatgtcagggacaaagagcgatgtatcccggcctcccctagtcccgcaaaagtaacccccattgacatggacagctgtccatgtttcaatagggtgatcactctcttgaagacgagaatgctgattgtcggcagacaaaggagttggaaat
seqidno.17
突变型irre(m2)基因编码的氨基酸序列
valproseralaasnvalserproprocysproserglyvalargglyglyglymetglyprolysalalysalaglualaserlysprohisproglnileprovallysleuprophevalthralaproaspalaleualaalaalalysalaargmetargaspleualaalaalatyrvalalaalaleuproglyargaspthrhisserleumetalaglyvalproglyvalaspleulysphemetproleuglytrpargaspglyalapheaspprogluhisasnvalileleuileasnseralaalaargprogluhisglnargphethrleualahisgluileglyhisalaileleuleuglyaspaspasnleuleuseraspilehisaspalatyrgluglygluargleugluglnvalilegluthrleucysasnvalalaalaalaalaileleumetprogluprovalilealaglumetleugluargpheglyprothrglyargalaleualaglyleualalysargalagluvalseralaserseralaleutyralaleuthrgluglnthrprovalprovaliletyralavalcysalaproglylysproproarggluglnalaalaseraspgluaspalaglyproglythrglulysvalleuthrvalargalaserserserthrargglyvallystyrthrleualaserglythrprovalproalaasphisproalaalaleualaleualathrglymetgluvalarggluglusertyrvalpropheargserglyarglysmetlysalagluvalaspalatyrproserargglyilevalalavalserpheglupheaspproalaargleuglyarglysaspsergluglnalaaspargaspgluproglnaspalaalagln
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110>天津科技大学
<120>具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法、菌株及其应用
<160>30
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>328
<212>prt
<213>野生型irre基因编码的氨基酸序列(unknown)
<400>1
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202530
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alaalaleualaalametalaalaleualaalaalathrvalalaala
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65707580
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proalaalahisproalaalaleualaleualathrglymetglyval
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alaglyproglyalaalaalagly
325
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1.一种可适用于简单节杆菌的目标启动子文库，其特征在于：所述目标启动子文库是在表达载体part2野生型启动子hdnop的基础之上，通过随机突变和定点突变技术获得的启动子突变体，其序列为：seqidno.3，和/或为seqidno.4，和/或为seqidno.5，和/或为seqidno.6，和/或为seqidno.7，和/或为seqidno.8，和/或为seqidno.9，和/或为seqidno.10，和/或为seqidno.11，和/或为seqidno.12，和/或为seqidno.13，和/或为seqidno.14，和/或为seqidno.15，和/或为seqidno.16。
2.如权利要求1所述的可适用于简单节杆菌的目标启动子文库的构建方法，其特征在于：步骤如下：
⑴在质粒part2上野生型启动子hdnop5’端引入限制性酶切位点ecorv，获得重组质粒part2a，便于后续启动子突变体替换质粒上的野生型启动子；
⑵将绿色荧光蛋白egfp编码基因与part2a连接构建重组质粒part2a-egfp；
⑶根据步骤⑴中野生型启动子的序列，设计随机突变引物和定点突变引物；随机突变引物设计的目的是在全启动子区域通过易错pcr引入随机突变，定点突变引物设计的目的是删除原始启动子序列-10区的碱基c，或增加核糖体结合位点到起始密码子之间的碱基个数；
⑷以步骤⑵中重组质粒part2a-egfp为模板，使用步骤⑶中的突变引物pcr扩增得到含有突变位点的启动子核苷酸序列，将其替换质粒part2a-egfp上的野生型启动子；或含有突变位点的全质粒，共同组成表达egfp的启动子突变体质粒库；
⑸将步骤⑷中得到的启动子突变体质粒分别转入大肠杆菌e.colidh5α中，利用流式细胞仪进行流式分选，获得荧光强度前0.1～1％的细胞；将上述获得的细胞涂布在含有卡那霉素的lb固体培养基上培养；
⑹挑取步骤⑸中的单菌落于液体lb试管中过夜培养，利用酶标仪检测荧光强度，获得在大肠杆菌中相对于野生型启动子hdnop具有不同表达强度的启动子突变体；
⑺从步骤⑹获得的在大肠杆菌中具有不同表达强度的启动子突变体中，按表达强度筛选出梯度差异的启动子突变体电转入简单节杆菌中，培养至稳定期，利用酶标仪检测荧光强度，获得在简单节杆菌中具有不同表达强度的目标启动子文库。
3.包含如权利要求1所述的目标启动子文库的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株。
4.根据权利要求3所述的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株，其特征在于：所述简单节杆菌工程菌株还包含野生型irre(w)或irre(w)突变基因irre(m2)，所述野生型irre(w)基因编码的氨基酸序列为：seqidno.1；所述irre(w)突变基因irre(m2)编码的氨基酸序列为：seqidno.17。
5.根据权利要求3所述的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株，其特征在于：所述irre(w)突变基因irre(m2)能够显著提高简单节杆菌的有机溶剂耐受性；
或者，所述irre(w)突变基因irre(m2)携带四个突变位点，分别为arg111his，asp130asn，glu182gly和ser230gly。
6.根据权利要求3所述的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株，其特征在于：所述irre(w)突变基因irre(m2)的构建方法为：
⑴以part2a-irre(w)质粒为模板，分别在不同浓度的mg2 、mn2 、不同模板加入量和不均衡浓度dntps的条件下进行反应，建立易错pcr条件；
⑵以携带野生型irre(w)基因的part2a-irre(w)质粒为模板进行突变，结合步骤⑴中建立的易错pcr条件，获得irre(w)突变基因，连接到质粒part2a上，构建irre基因突变文库；
⑶电转入简单节杆菌后涂布于含有卡那霉素的lb平板上，长出来的单菌落分别接种到含有梯度浓度乙醇的培养基中，初步筛选出生长速率高于对照菌株i的菌株，对照菌株i为含有野生型启动子和野生型irre(w)的菌株，然后在此基础上复筛，筛选出生长速率和最大od600均高于对照菌株i的菌株，最终获得最优耐性菌株pwt-irre(m2)，将优良耐性菌株pwt-irre(m2)培养后重提质粒part2a-irre(m2)，即可获得irre(w)突变基因irre(m2)。
7.根据权利要求3至6任一项所述的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株，其特征在于：所述简单节杆菌工程菌株具有如下特征：
该菌株表现出优良的胁迫耐受性，压力胁迫条件为乙醇浓度0％-6％，甲醇浓度为0％～8％。其中，与对照菌株i相比，在6％乙醇和8％甲醇压力的生长条件下，工程菌株的最大od600分别提高了10％～125％和1.9％～128.1％；高压力的冲击条件为16％乙醇、20％甲醇和2.5mol/l盐。其中，与对照菌株i相比，在16％乙醇、20％甲醇和2.5mol/l盐的冲击下的最大活菌数分别提高了338.7％～524.2％、103.7％～117.3％和278.0％～380.7％；在45g/l醋酸可的松，8％乙醇的转化体系下，发酵12h和60h时pm1210-irre(m2)工程菌株的活菌数分别是对照菌株ii的4倍和25倍；
其中，对照菌株i为含有野生型启动子和野生型irre(w)的菌株，对照菌株ii为含有空质粒的菌株，上述百分比均为体积百分数。
8.如权利要求3至6任一项所述的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于：步骤如下：
⑴构建含有不同表达强度启动子突变体和irre(w)或irre(m2)的重组质粒
使用bamhi和xbai两个限制性内切酶处理质粒part2a-irre(w)或part2a-irre(m2)分别获得irre(w)或irre(m2)核苷酸片段，将其替换含有不同表达强度启动子突变体和egfp重组质粒上的egfp片段，获得的重组质粒转入大肠杆菌dh5α，在含有50ug/ml卡那霉素的抗性平板上，37℃过夜培养，对平板上长出的阳性转化子重提质粒后通过pcr、酶切和测序验证，获得含有不同表达强度启动子突变体和irre(w)或irre(m2)的重组质粒；
⑵构建含有不同表达强度启动子突变体和irre(w)或irre(m2)重组质粒的工程菌株
将上述验证正确的重组质粒电转至简单节杆菌感受态中，加入无菌复苏培养基混匀后，32℃缓慢振荡培养11h后，涂布到含有50ug/ml卡那霉素的抗性平板上，32℃倒置培养3～4天，对平板上长出的阳性转化子重提质粒后通过pcr、酶切和测序验证，获得含有不同表达强度启动子突变体和irre(w)或irre(m2)重组质粒的工程菌株，即为具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株。
9.如权利要求3至6任一项所述的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株在甾体类化合物生物转化方面中的应用。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述转化的转化体系中乙醇的添加量为8％，底物醋酸可的松的投料浓度提高为15-45g/l，其c1,2脱氢反应产率较对照菌株i提高了1.1-2.2倍。
技术总结