本发明属于生物医学
技术领域：
，尤其涉及linc01331基因抑制剂在制备治疗肺癌药物中的用途。
背景技术：
：在世界范围内，肺癌的死亡率居于所有恶性肿瘤的首位，严重威胁着人类的健康和生命。目前，在中国，肺癌的发病率和死亡率呈现出逐年上升的趋势。按照临床病例类型的不同，肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。其中，非小细胞肺癌约占肺癌的85%，小细胞肺癌约占15%。非小细胞肺癌又分为肺腺癌、肺鳞癌和肺大细胞癌。由于目前缺乏有效的筛选手段，大部分肺癌患者被诊断时多已处于肺癌晚期，因此患者的生存期仅有15%。当前，对于肺癌的研究重点主要在于寻找更高效的癌症编码及调控基因，通过对基因作用机制的研究，进而调控和控制基因的表达来有效的抑制肺癌的发展。长链非编码rna是指转录本长度超过200nt，位于细胞核或细胞质内，由rna聚合酶ⅱ转录生成的分子。由于长链非编码rna缺少有意义的开放阅读框，因此长链非编码rna一般不能编码蛋白质。过去，人们通常认为长链非编码rna是不具有任何生物学功能的暗物质，是转录过程的副产物。然而，随着研究的不断深入，科学家发现长链非编码rna作为人类基因组重要的调控分子在生物体内起到调节作用，其功能紊乱与胃癌、肺癌、肝癌等疾病的发生发展密不可分。一些异常表达的长链非编码rna能够作为癌症的基因诊断靶标，并且可以作为癌症患者早期诊断以及为判断癌症类型提供新的依据。因此，进一步阐明长链非编码rna在肺癌中的分子基础来寻找新的治疗靶点和开发新的药物，是提高肺癌有效预防和治疗的关键。目前，linc01331在肺癌中的作用还未见报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种能够用于制备治疗肺癌的linc01331基因抑制剂。为实现上述目的本发明提供了一种长链非编码rna，所述长链非编码rna为linc01331，所述linc01331的序列如seqidno.1所示，其在genebank中的基因id为104310351，基因的转录本号为nr_126354.1。优选地，所述linc01331在肺癌中高表达。此外，本发明提供了linc01331基因抑制剂在制备治疗肺癌药物中的用途，所述linc01331基因抑制剂是指以linc01331为作用靶标得到的对linc01331具有抑制作用的分子。优选地，所述linc01331基因抑制剂为核酸分子。优选地，所述linc01331基因抑制剂为sirna；优选地，所述sirna的正义链序列如seqidno.10所示，所述sirna的反义链如seqidno.11所示。此外，本发明提供了一种sirna，所述sirna为linc01331基因抑制剂；所述sirna抑制肺癌中linc01331的表达；所述sirna的正义链序列如seqidno.10所示，所述sirna的反义链如seqidno.11所示。除此之外，本发明提供了一种抑制治疗肺癌的药物组合物，其特征在于，所述药物包括权利要求3所述的linc01331基因抑制剂，所述linc01331基因抑制剂为治疗肺癌药物组合物的唯一有效成分或有效成分之一。优选地，所述药物组合物还包括其他药学上可接受的载体和/或敷料。优选地，所述载体和/或敷料包括粘合剂、稀释剂、表面活性剂、填充剂中的一种或几种。优选地，所述治疗肺癌药物组合物的形式无限制，可以为液体、固体、凝胶、气雾。优选地，所述药物的剂型为临床上可接受的任一剂型，可以为注射液、粉剂、胶囊、喷剂。优选地，所述治疗肺癌药物组合物的给药形式无限制，可以为静脉内给药、口服给药、肌肉内给药和皮下给药。本发明的有益效果在于：本发明首次发现，linc01331在肺癌组织中高表达，证明其可以作为肺癌治疗的作用靶点。同时，本发明将linc01331的基因抑制剂用于制备治疗肺癌药物组合物，并证明linc01331的基因抑制剂能够抑制肺癌细胞的增殖，以及侵袭和迁移，因此，具有重要的临床价值和应用前景。附图说明图1linc01331在癌旁组织和肺癌组织中的差异表达情况。图2实时荧光定量pcr检测si-rna对linc01331的敲减效率。图3转染si-linc01331-3对于增殖相关蛋白c-myc和cyclin-d1的影响。图4转染si-linc01331-3对于a549细胞细胞增殖的影响。图5转染si-linc01331-3对于a549细胞细胞迁移和细胞增殖的影响。具体实施方式实施例1下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品。实施例1选取20例肺腺癌组织以及相应的癌旁组织进行实验，组织来源于青岛市中心医院，所有组织标本均通过医院伦理委员会审查和批准，所有组织标本来源患者均签署知情同意书。肺腺癌组织经病理检测证实（肺腺癌组织切除时，患者未进行化疗，放疗等治疗）。具体标本如下：样本编号肿瘤类型诊断年龄性别m分期n分期1肺腺癌67男m0n02肺腺癌78女m0n13肺腺癌65男m0n04肺腺癌70男m0n25肺腺癌58男m0n06肺腺癌75女m0n27肺腺癌66男m0n18肺腺癌76女m0n09肺腺癌48女m0n310肺腺癌74女m0n011肺腺癌60男m0n012肺腺癌51女m0n013肺腺癌57男m0n214肺腺癌68男m0n215肺腺癌40男m0n016肺腺癌43男m0n017肺腺癌72男m0n118肺腺癌59女m0n019肺腺癌83男m0n020肺腺癌50男m0n22.组织rna提取（1）从-80℃冰箱中取出肺腺癌组织和癌旁组织，取50mg组织放入到研钵中，加入液氮，进行研磨；（2）加入1mltrizol，充分混匀，转移至离心管中，室温放置5min；（3）置于离心机中，12000rpm离心5min，去除沉淀，保留上清；（4）加入200μl氯仿，混匀后，室温静置15min；（5）置于离心机中，12000rpm，离心5min；（6）将上清转移至新的离心管中，加入等体积的预冷异丙醇混匀，冰上静置10min；（7）置于离心机中，12000rpm，离心10min，去除上清，保留沉淀；（8）在沉淀中加入1ml75%乙醇，振荡器混匀，置于离心机中，4℃，7500rpm，5min；（9）去除上清，静置10分钟，干燥rna沉淀；（10）加入50μldepc水溶解沉淀，测定总rna纯度和浓度。3.逆转录获取cdna（1）去除基因组dna配置10μl反应体系：5×gdnaeraserbuffer2.0μl，gdnaeraser1μl，totalrna1μg，rnasefreedh2oupto10μl。反应条件：42℃2分钟，4℃。（2）逆转录反应配置20μl反应体系：步骤（1）的反应液10μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl。pcr仪的反应条件：37℃15分钟，85℃5秒，4℃。4.荧光pcr检测按照takara荧光定量pcr试剂盒进行操作配置反应试剂:sybrgreenpremixextaq（2×）10μl，引物10.4μl，引物20.4μl，cdna模板2μl，ddh2o7.2μl。反应条件：95℃10min；95℃15s，59℃60s35个循环；60℃5min。采用2-△△ct方法处理实时定量pcr数据，计算linc01331的表达变化。引物序列linc01331引物为正向引物5’-aagtgaaggcagcgctctaa‐3’（seqidno.2）反向引物5’-ccagtcatgtgtgggaaacttg‐3’（seqidno.3）gapdh引物为正向引物5’-aatgggcagccgttaggaaa‐3’(seqidno.4)反向引物5’-atctaggaaaagcatcacccgg‐3’(seqidno.5)结果荧光定量pcr的结果如图1所示，从图1可以看出，相较于癌旁组织，linc01331在肺腺癌中的相对表达量为5.028±0.517，显著高于癌旁组织，且差异具有统计学差异（p＜0.05），说明linc01331可以作为制备治疗肺腺癌药物的靶点。实施例2linc01331基因sirna验证1.sirna序列设计si-linc01331-1正义链aauaagguguuaauuggucuc（seqidno.6）反义链gaccaauuaacaccuuauuuu（seqidno.7）si-linc01331-2正义链uuaaaagcggucuuuugugag（seqidno.8）反义链cacaaaagaccgcuuuuaaag（seqidno.9）si-linc01331-3正义链ucaaguuugguuaaagcucca（seqidno.10）反义链gagcuuuaaccaaacuugagu（seqidno.11）2.细胞培养人非小细胞肺癌细胞a549,高糖dmem培养液培养（10%胎牛血清），细胞恒温培养箱37℃，5%co2。3.sirna转染（1）转染前一天将2×105的a549细胞接种到6孔板上，培养24h，之后，参照lipofectamine2000说明书对细胞进行转染；（2）实验分组为对照组（空转），si-nc组，si-linc01331-1组，si-linc01331-2组，si-linc01331-3组。4.荧光定量pcr检测干扰后linc01331基因表达情况（1）细胞总rna提取在6孔细胞培养板每孔中，加入500μltrizol，室温放置5分钟，充分裂解后，转移至离心管中；剩余步骤与实施例1组织rna提取步骤相同（相应添加量按比例修改）。结果结果如图2所示，通过图2可以看出，与对照组相比，si-nc的linc01331的mrna表达量无显著变化。而si-linc01331-1组，si-linc01331-2组，si-linc01331-3组的linc01331的mrna表达量显著降低（p<0.05），其中si-linc01331-3的抑制效果最好（抑制率71.7%），因此，本发明选择si-linc01331-3去进行后续的实验。实施例3westernblot检测si-linc01331-3对于增殖相关蛋白表达的影响1.蛋白提取（1）转染前一天将2×105的a549细胞接种到6孔板上，培养24h后，参照lipofectamine2000说明书将si-nc和si-linc01331-3转染到细胞中；（2）转染48h后，使用pbs洗涤细胞，每孔加入100µlripa细胞裂解液；（3）充分裂解之后，将裂解液转移至离心管中，10000g/min，4℃离心10分钟，将上清转移至新的离心管中；（4）吸取2µl，参照bca说明书测定蛋白浓度，加入5×上样缓冲液调整蛋白浓度为2µg/µl，沸水煮5分钟，得到制备好的蛋白样品；2.westernblot检测蛋白表达（1）将电泳槽组装好，配置5%上层胶和12%下层胶；（2）每孔加入20µg蛋白样品和蛋白marker指示剂；（3）在电泳槽成加入新配置的电泳缓冲液，上层胶电压80v，下层胶120v条件下进行电泳，待溴酚蓝指示剂完全跑出胶的时候，结束电泳；（4）按照“三明治模型”组装转膜夹，装入电转槽中，加入电转液，200ma，1h；（5）将pvdf膜取出，转移至5%的脱脂奶粉中，室温，摇床封闭1h；（6）tbst洗膜3次，每次5min，孵育c-myc，cyclin-d1一抗稀释液，4℃摇床孵育过夜；（7）tbst洗膜3次，每次5min，孵育二抗，室温，摇床孵育1h；（8）暗室中，快速将发光液滴加至pvdf膜上，进行显像。实验结果实验结果如图3所示，通过图3可以看出，相较于转染si-nc的细胞，转染si-linc01331-3的细胞中，细胞增殖相关蛋白cyclin-d1和c-myc的表达量显著下调，说明干扰si-linc01331-3能够抑制a549细胞增殖。实施例4cck-8检测si-linc01331-3对于a549细胞增殖的影响（1）将5×103个分别转染si-nc和si-linc01331-3的a549细胞接种于96孔板中，每孔90μl，每组设置3个复孔，置于培养箱中培养；（2）分别在0h，24h，48h，72h，96h对细胞进行检测，检测时，每孔加入10μlcck-8检测液，之后将细胞置于培养箱中孵育4小时；（3）将细胞培养板置于酶标仪中，450nm处检测吸光值，绘制生长曲线。实验结果实验结果如图4所示，可以看出，转染si-linc01331-3的细胞相较于转染si-nc的细胞，细胞增殖速率受到明显的抑制，说明通过si-linc01331-3能够抑制a549细胞增殖。实施例5si-linc01331-3对于a549细胞的细胞迁移的影响（1）将细胞培养试剂和transwell小室放在37℃温育；（2）将转染si-nc和si-linc01331-3的a549细胞消化，用pbs和无血清培养基洗涤之后，用无血清培养基悬浮细胞，计数；（3）在下室加入600μl含10%血清的培养基，上室中加入100μl2.5×104细胞悬液，继续于细胞培养箱中培养24h；（4）用镊子小心的取出小室，吸干上室液体，之后将小室转移到加入800μl甲醇的培养板中，室温固定30分钟；（5）取出小室，吸干上室固定液，转移到预先加入800μlgiemsa染液的孔中，室温染色20分钟；（6）取出小室，用清水冲洗浸泡3次，吸去上室液体，用棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞，置于显微镜下进行拍照。实验结果实验结果如图5细胞迁移所示，可以看出，转染si-linc01331-3之后，通过transwell小室的细胞数量明显减少，说明使用si-linc01331-3干扰linc01331能够抑制a549细胞的迁移。实施例6si-linc01331-3对于a549细胞的细胞侵袭的影响（1）将冻存于-80℃的bdmatrigel胶4℃过夜，变成液态；（2）取200μl无血清培养基，加入40μlmatrigel胶，冰上混匀，上室分别加入100μl混匀后的matrigel胶，放入培养箱中，孵育4小时，至matrigel胶变为固态；（3）将转染si-nc和si-linc01331-3的a549细胞消化，用pbs和无血清培养基洗涤之后，用无血清培养基悬浮细胞，计数；（4）在下室中加入600μl含10%血清的培养基，上室加入100μl2.5×104细胞悬液，继续在细胞培养箱中培养24小时；（5）用镊子小心的取出小室，吸干上室液体，之后将小室转移到加入800μl甲醇的培养板中，室温固定30分钟；（6）取出小室，吸干上室固定液，转移到预先加入800μlgiemsa染液的孔中，室温染色20分钟；（7）用清水冲洗浸泡3次，取出小室，吸去上室液体，用棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞，置于显微镜下进行拍照。实验结果实验结果如图5细胞侵袭所示，可以看出，相较于si-nc组，si-linc01331-3组穿过transwell小室的数目显著减少，说明使用si-linc01331-3干扰linc01331能够抑制a549细胞的侵袭。综上所述，linc01331基因抑制剂si-linc01331-3能够通过抑制肺癌细胞a549增殖，以及迁移和侵袭来抑制肺癌，因此，其可以用于制备治疗肺癌药物。序列表<110>青岛市中心医院<120>linc01331基因抑制剂在制备治疗肺癌药物中的用途<160>11<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>568<212>dna<213>人源(human)<400>1agtttattatgtttggggttggaatcaccaagagaccaattaacaccttatttttaggat60tagccattctggtatttgcagatagtttcttaaacaggactgtttggagttcacactgta120ggagtaagtgaagtgttgataaaagagattccagaacaaataaagatttctacagtaaaa180gctggggaggtgtgtagggctccagtctttgggttcacagcttggctctacattcattgc240tggaggaatccaagcctcacaaaagaccgcttttaaagaaaaactctatttttcttagaa300gaactagaatatgtaacaccattgtgagaaataaaaccccaaggtgaacaagattgaaag360tgaaggcagcgctctaaggaggaagccagctggcttgaatggtgatgtaaacagccttgg420agctttaaccaaacttgagtaagaactccctgacttggaaacactcaagtttcccacaca480tgactggatggccctggccacactgggaacggaatgggggcctcccattggaactcaggg540tggagggggaagctcgaccagctattgt568<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2aagtgaaggcagcgctctaa20<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ccagtcatgtgtgggaaacttg22<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4aatgggcagccgttaggaaa20<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5atctaggaaaagcatcacccgg22<210>6<211>21<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6aauaagguguuaauuggucuc21<210>7<211>21<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gaccaauuaacaccuuauuuu21<210>8<211>21<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8uuaaaagcggucuuuugugag21<210>9<211>21<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cacaaaagaccgcuuuuaaag21<210>10<211>21<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ucaaguuugguuaaagcucca21<210>11<211>21<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11gagcuuuaaccaaacuugagu21当前第1页1 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技术特征：1.一种长链非编码rna，其特征在于，所述长链非编码rna为linc01331，所述linc01331的序列如seqidno.1所示。
2.根据权利要求1所述的长链非编码rna，其特征在于，所述linc01331在肺癌中高表达。
3.linc01331基因抑制剂在制备治疗肺癌药物中的用途，其特征在于，所述linc01331基因抑制剂是指以linc01331为作用靶标得到的对linc01331具有抑制作用的分子。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述linc01331基因抑制剂为核酸分子。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述linc01331基因抑制剂为sirna。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述sirna的正义链序列如seqidno.10所示，所述sirna的反义链如seqidno.11所示。
7.一种sirna，其特征在于，所述sirna为linc01331基因抑制剂；所述sirna抑制肺癌中linc01331的表达；所述sirna正义链序列如seqidno.10，所述sirna反义链如seqidno.11所示。
8.一种治疗肺癌的药物组合物，其特征在于，所述药物包括权利要求3所述linc01331基因抑制剂，所述linc01331基因抑制剂为治疗肺癌药物组合物的有效成分之一。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括其他药学上可接受的载体和/或敷料。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述载体和/或敷料包括粘合剂、稀释剂、表面活性剂、填充剂中的一种或几种。
技术总结本发明提供了一种LINC01331基因抑制剂在制备治疗肺癌药物中的用途。本发明发现LINC01331基因在肺癌中高表达，因此可以作为肺癌治疗的作用靶点；LINC01331基因抑制剂可以抑制肺癌细胞增殖，抑制肺癌细胞迁移，抑制肺癌细胞侵袭。本发明的有益效果在于，本发明首次发现LINC01331基因可以作为肺癌的治疗靶点，并且设计了相应的LINC01331的基因抑制剂，为肺癌药物的开发开辟了新的方向。
技术研发人员：刘玉敏;刘改丽;刘卡花;于淼林
受保护的技术使用者：青岛市中心医院
技术研发日：2020.03.13
技术公布日：2020.06.09
