本发明属于生物技术领域，涉及一种快速有效的dna核酸适配体筛选方法、一种特异性识别水稻矮缩病毒p10蛋白的核酸适配体及其用途。
背景技术：
水稻黑条矮缩病毒(riceblackstreakeddwarfvirus，rbsdv)为呼肠孤病毒科斐济病毒属成员，由介体昆虫灰飞虱传播，广泛侵染水稻、玉米、小麦、大麦、高粱、燕麦等禾本科植物，在水稻中引起水稻黑条矮缩病，在玉米中引起玉米粗缩病。水稻在被rbsdv侵染后表现出矮缩、叶色加深、叶脉出现瘤状凸起等症状。rbsdv在水稻和玉米的整个生育期均可侵染，幼苗期侵染直接导致植株不能抽穗，水稻分蘖期感染rbsdv，虽能抽穗但往往形成包穗，难以结实。近年来rbsdv引起的病毒病对我国的粮食生产造成了严重威胁。
针对水稻黑条矮缩病毒的鉴定，目前主要的方法为蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定法、免疫荧光标记法、实时荧光定量pcr法和电镜观察法。前三种方法均基于水稻黑条矮缩病毒编码的蛋白的特异性抗体。然而抗体的制备步骤繁琐，需要使用单克隆杂交瘤细胞注射小鼠腹水，因此抗体不同的批次间存在差异，带来了检测质量的不稳定，存在检测准确度易变化等问题。此外，抗体的检测技术还存在对抗体的保存要求高，样品前处理步骤复杂，病毒检测依赖诸多实验室设备等不便利因素。实时荧光定量pcr和电镜观察法对设备的要求更高，样品前处理的步骤更为复杂。基于以上情况，水稻黑条矮缩病毒的检测目前无法实现在采样当地进行快速检测，而需要将样品运送至各省市的农业科学研究院或植物保护站进行，导致效率较低，且结果滞后，不利于病害的及时监测。
水稻黑条矮缩病毒粒子结构为正二十面体，由双层病毒衣壳构成。由病毒s10基因编码的p10蛋白为该病毒外壳蛋白的主要结构组份，是检测病毒粒子的最优靶分子。
核酸适配体作为一种合成的短单链寡核苷酸，主要分为dna核酸适配体和rna核酸适配体。核酸适配体通过自身折叠形成茎环、假结、g4链体等空间结构，经过指数富集的配体进化系统(selex)筛选后，可以高亲和力、高特异性地识别靶标分子，近年来成为抗体替代分子的首选。核酸适配体具有多种特性使它优于单克隆抗体。例如，核酸适配体通常分子质量较小(8-25kda)，具有较小的空间位阻，所以可以快速穿透阻碍并定位到靶物质。另外，核酸适配体绝大多数没有免疫原性，化学性质稳定，易于合成和修饰，可被开发成为廉价的快速检测试剂盒。当前核酸适配体作为新一类分子被广泛用于检测、诊断、药物开发和治疗中，具有极大的科研开发潜力和商业价值。
核酸适配体的筛选流程被称为指数富集的配体系统进化(selex)。在selex流程中，结合配体与不结和配体的分离、结合配体的有效扩增、筛选流程的有效监控及筛选条件的逐步严谨化对于最终能否得到高特异性高亲和力核酸适配体至关重要。目前，selex过程中主要的分离技术有硝酸纤维素膜过滤、磁性介质分离、亲和柱层析、凝胶阻滞法、免疫吸附法及毛细管电泳等。在selex过程中，对高复杂度核酸适配体文库进行均等扩增，对于有效构建次级筛选文库至关重要。对于结合配体的均等扩增，目前比较流行的方案是磁珠上扩增和不对称pcr。前者即通过将接头序列固定于磁珠上在水油乳浊液中对核酸适配体文库进行独立扩增，实现不同模板的均等扩增；后者即通过引物的不对称比例控制pcr反应中的杂带副产物产生。对于磁珠上扩增的方法，文库多样性程度受限于磁珠数量，而该方法本身也因为模板核酸被固定而存在反应效率较低的问题。对于不对称pcr，由于采用单链扩增策略，因此同样也存在反应效率低的问题。另外，在selex过程中，对高亲和力核酸适配体富集程度的快速检测能够为下一轮筛选条件的设定提供重要的参考，然而目前的筛选过程中对高亲和序列的富集情况的监控依赖于测序技术和实际实验验证结合的方法，增加了核酸适配体的筛选时间。对筛选过程监测手段的不足和滞后性，严重降低了筛选的效率和成功率。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种简便、快速、有效且低成本的高特异性dna核酸适配体亲和筛选方法，利用该方法筛选得到能够特异性结合水稻黑条矮缩病毒的核酸适配体，并基于该核酸适配体开发一套快速检测水稻黑条矮缩病毒的方法。
本发明的核心在于：(1)利用乳浊液dna聚合酶链式反应(epcr)实现对每轮筛选的洗脱文库分子进行无差别高效率的均等扩增以实现筛选的高通量和文库的高利用率。(2)每轮筛选后epcr反应产物总质量建立的对当前筛选结果的监测工序。(3)本发明的筛选方法得到的特异性结合水稻黑条矮缩病毒p10蛋白的核酸适配体。(4)该核酸适配体开发的水稻黑条矮缩病毒快速检测体系，包括但不限于酶联寡核苷酸吸附测定、荧光修饰的核酸适配体免疫荧光成像技术。
为实现上述目的，本发明提供了一种核酸适配体的筛选方法，该筛选方法包括以下步骤：
(1)将靶物质固定于固相载体；
(2)制备单链核酸文库；
(3)将变性后的单链核酸文库和固定于载体的靶物质在溶液中混合，分离未结合的单链核酸与载体-靶物质-单链核酸复合体；
(4)通过洗脱将载体-靶物质-单链核酸复合体中的单链核酸分离；
(5)将分离的单链核酸加入水油混合物，通过匀浆制成水油乳浊液，进行隔离式epcr扩增；
(6)采用有机溶剂破坏乳浊液，回收水相中的双链核酸分子；
(7)测定epcr回收产物的产量，依其判定执行下一轮筛选、重复本轮筛选或执行等比放大扩增。
任选地，以后筛选轮次中的单链核酸文库为上一轮epcr回收产物形成的单链核酸文库。
优选地，所述核酸适配体为dna。
在步骤(1)中，优选地，所述靶物质为肽；更优选地，所述肽具有连续六个组氨酸序列；优选地，所述肽为病毒外壳蛋白；优选地，所述病毒为水稻黑条矮缩病毒；优选地，所述病毒外壳蛋白为水稻黑条矮缩病毒p10蛋白。
在步骤(1)中，优选地，所述固相载体为镍离子包被的磁珠。
在步骤(3)中，优选地，所述分离采用离心管磁力架。
在步骤(5)中，优选地，所述匀浆为室温条件下30赫兹振荡10秒。
在步骤(6)中，优选地，所述有机溶剂为水饱和仲丁醇或无水仲丁醇。
在步骤(7)中，优选地，所述判定包括分别将epcr回收产物的产量与安全值和预警值进行比较；优选地，若epcr回收产物的产量大于等于安全值，则执行下一轮筛选；若epcr回收产物的产量大于等于预警值且小于安全值，则重复本轮筛选；若epcr回收产物的产量小于预警值，则执行等比放大扩增；优选地，所述安全值为3微克；优选地，所述预警值为1微克。
优选地，所述执行下一轮筛选是指所述筛选条件相对上一轮筛选条件改变的筛选；优选地，所述筛选条件的改变是指所述筛选条件中一个或多个的改变，所述筛选条件选自：本轮使用的核酸文库总质量、靶物质-载体复合物总量、结合静置时间、清洗次数、清洗所用体积和epcr循环数中的一个或多个；优选地，各轮筛选条件设置的如下表所示：
优选地，所述筛选方法还包括重复步骤(1)至(7)一次或多次，其中将上一轮筛选回收的部分双链核酸分子制备成单链核酸，作为下一轮筛选的单链核酸文库；优选地，所述重复为5-9次。
优选地，所述筛选方法还包括反向筛选；优选地，所述反向筛选采用无靶物质的载体分离去除文库中亲和结合固相载体的核酸分子；更优选地，反向筛选工序仅在第7轮和第9轮筛选之前进行。
本发明还提供了一种水稻黑条矮缩病毒的检测方法，所述检测方法包括使用所述的核酸适配体根据酶联寡核苷酸吸附法检测水稻黑条矮缩病毒，或根据免疫荧光标记法检测水稻黑条矮缩病毒。
本发明还提供了一种用于检测水稻黑条矮缩病毒的试剂盒，所述试剂盒包含所述的核酸适配体和任选的用于酶联寡核苷酸吸附法检测或免疫荧光标记法检测的试剂。
本发明的筛选方法利用了乳浊液pcr体系实现对筛选文库中每个核酸单链的高效率均一扩增，可以保证每轮筛选中从靶物质上洗脱下来的核酸适配体得到均等而且大量的扩增，从而实现筛选文库的充分利用，保证了每轮筛选中文库的多样性不受技术操作而下降。并且epcr反应得到的可测量的核酸质量为筛选过程提供了可靠且简便的监测标准。该方法提供了将每一轮筛选后洗脱下来的核酸适配体在油包水环境下彼此分离进行高效率的epcr扩增的方法，epcr反应后回收乳浊液中游离的核酸双链的方法，基于epcr产物质量变化的筛选条件设置方法。本发明通过对每轮筛选中epcr产物的监测，有效指导了下一轮筛选的条件设置，设计了每一轮筛选的条件，实现了高亲和力核酸适配体的富集。在6-10轮筛选后能够得到特异性高，灵敏度强的核酸适配体分子。采用本发明的方法能够减少筛选轮数，缩短筛选时间，能够去除结合到载体上的非特异性核酸适配体，能够筛选出高亲和力核酸适配体，特别是dna核酸适配体，能够调整多个参数逐步增加筛选过程的严格程度，能够监控核酸适配体的多样性程度和各链丰度。
本发明涉及以下序列：
随机ssdna文库(seqidno.:1)
tgacaccgtacctgctctnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnaagcacgccagggactat
5’引物1(seqidno.:2)：
5’-tgacaccgtacctgctct-3’
3’引物1(seqidno.:3)：
5’-atagtccctggcgtgctt-3’
生物素修饰的5’引物1(seqidno.:4)：
biotin-5’-tgacaccgtacctgctct-3’
texasred修饰的5’引物1(seqidno.:5)：
texasred-5’-tgacaccgtacctgctct-3’
f1(seqidno.:6)
tgacaccgtacctgctctagatgaagactgatgatgcctgtcaacgcgcggaaccactggatcaagacggaccggaaccgtgttcactgtcgacaagcacgccagggactat
f3(seqidno.:7)
tgacaccgtacctgctctagcggtctcgtgaatctgcagacgaatttgtgtaatatgagcgcatatgtataacattgcagacaaggtcgagagcgcgtaagcacgccagggactat
f4(seqidno.:8)
tgacaccgtacctgctctgggtgtggagattgtgaggggaggtgctagcatggatagaaagtaaagaggaggaaagtgcggagtaaggaggcggggaagcacgccagggactat
f5(seqidno.:9)
tgacaccgtacctgctctgacagtcctcgtacaaaggtcgagtcatcatacccgccgtaaccccttacgggtcgagccaagcacgccagggactat
f6(seqidno.:10)
tgacaccgtacctgctctcagggcaacactatgacatagggaactctcggaacacagggaggcctccagtacaattcggatgtgaactgcaagcacgccagggactat
f11(seqidno.:11)
tgacaccgtacctgctctagcacggcacccatgggcagtataccgtcccccgcgaaagacgggccgctgcggtaagcacgccagggactat
f13(seqidno.:12)
tgacaccgtacctgctctaccccgcattatccttataacccgatagaataaacgacgaggtcggcgaaagaccgaaggcggtgcagggccaagcatgcaagcacgccagggactat
f15(seqidno.:13)
tgacaccgtacctgctctagccaccttcgtagacaccatatcagaaagagatacccaggaggcgcccccgtgtgcgaacgaagggcgattgtaacgaagcacgccagggactat
f16(seqidno.:14)
tgacaccgtacctgctctgggccgttgattccaaccctttatggcggcgtgcgaaagacacgatcaacgcgcagccccaagcacgccagggactat
f17(seqidno.:15)
tgacaccgtacctgctctgccgtagtgatcctccttaacagtgacctatagatcgttcgtcgtatttgctttgacaatccttctcagatactctcccgaagcacgccagggactat
f20(seqidno.:16)
tgacaccgtacctgctctagtcgtggtcatgcagcacggaagcgtaagacttcccgctggacggtcggtaagacggtaaatgactccgcaagcacgccagggactat
f21(seqidno.:17)
tgacaccgtacctgctctctaccagctccgacgatccagtattgtgaaccccgcgcggtagcgttctcgtcttcgtggagtggaacgcaagcacgccagggactat
f22(seqidno.:18)
tgacaccgtacctgctctgcccgtagacaaagtccgccccgaaatcgcaagactgcaagcgaaagactaaagcgatcgaataagatccgattcaggggaaagcacgccagggactat
f24(seqidno.:19)
tgacaccgtacctgctctgccgtagtgatcctccttaacagtgacctatagatcgttcgccgtatttgctttgacaatccttctcagatactctcccgaagcacgccagggactat
f25(seqidno.:20)
tgacaccgtacctgctctgggccgttgattccaacccattatcgcggcgtgcgaaagacacgatcaacgcgcagccccaagcacgccagggactat
f26(seqidno.:21)
tgacaccgtacctgctctgggtcagcgaaagactacccccgtggcgcgcggaagacgcgcccagcaggaccagccgaacaccccaagcacgccagggactat
f27(seqidno.:22)
tgacaccgtacctgctctagggagtcgatgttccctgctcacgacatggtccgcggaagacggacaggacatcccgagaagcgagcgagcatctcgctaagcacgccagggactat
f28(seqidno.:23)
tgacaccgtacctgctctaagcccggctggcaggatagcgtgacgccgtaggggcttttcggatcgcagcggaggcaggcagtgccattgtacctgctctcccaagcacgccagggactat
f29(seqidno.:24)
tgacaccgtacctgctctacctggatgcgcgttagacgctgttgaataatcatcgcaaagagtccaggtacgcaaggttatggacagtgtgccaagcacgccagggactat
f32(seqidno.:25)
tgacaccgtacctgctctagaacgcagctcaaaagctcgcccagcacccgaaaagaggtgcggccgtctgagggaagcagcgcagaaccccgaagcacgccagggactat
f34(seqidno.:26)
tgacaccgtacctgctctggagacgaagagataaggcagaagttgagaagatgggatgagggccgggaagcacgccagggactat
f36(seqidno.:27)
tgacaccgtacctgctctaccccgcattatccttataacccgatagaataaatgacgaggtcggcgaaagaccgaaggcggtgcagggccaagcatgcaagcacgccagggactat
f38(seqidno.:28)
tgacaccgtacctgctctgggccgttgattccaaccctttatcgcggcgtgcgaaagacacgatcaacgcgcagccccaagcacgccagggactat
f45(seqidno.:29)
tgacaccgtacctgctctgggcggtgcgtcgctttgctgaagccagattggtctttgacagagatcagacagaactgttccagaaagcgagggaagcacgccagggactat
水稻黑条矮缩病毒p10蛋白氨基酸序列(seqidno.:30)：
madirldiapdlihngvpqrlsdtiilnnrptitllshfnnlfhelnivksphvassqttvnlyirkhlltrlhdrlqtvetstlpnitqlkdhirsffqnehqpifqtltnndlseefvgvttfglslfatskldaeqiervqietltegnitlkpfsadglevilddsyigivgkipglevhklldkccrevpaqmgiltdevkllmrtgklridggydfncpasttdvthyggydqfsrqmferlnlfynislsiipvsalktvhlfekelsvldadkslleqtwsavasfvetwqvkskvkaddpdeyeltslstlrtnydgtsasspftdkkfidwyiktfsktekgsslrrneleeksatststtvkkvkihfsvqyfdefkvngheksvvvqthkgemtldyyrkigevlsaiwkrgkslavpcfdyiklgvekafhlapvilkkynltiddiinfidkgpsylakldkiddwsliskliitsvlpniiqavyktdpsnnvmnsviisrannllksdrdrllkkalsanvsssntsshehvqkivlnkvtr
附图说明
图1为筛选核酸适配体的流程图。
图2为筛选核酸适配体第1-10轮的筛选参数。
图3为筛选特异性结合水稻黑条矮缩病毒p10蛋白的核酸适配体每一轮的筛选参数。
图4为筛选特异性结合水稻黑条矮缩病毒p10蛋白的核酸适配体第1-10轮筛选中文库dna使用量和epcr产物总量分析。
图5为筛选特异性结合水稻黑条矮缩病毒p10蛋白的核酸适配体第1-10轮epcr产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图6为基于酶联寡核苷酸吸附实验，对第6轮筛选后所得核酸适配体对水稻黑条矮缩病毒p10蛋白的亲和能力比较。
图7为酶联寡核苷酸吸附实验检测未知蛋白样品中水稻黑条矮缩病毒p10蛋白含量的快速检测结果图。
图8为f1、f17、f20、f26对带毒灰飞虱中肠的免疫荧光标记结果。
图9为基于第6轮筛选后外加一次反向筛选后所得最高丰度核酸适配体序列合成的荧光核酸适配体对感染水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱中肠组织的免疫荧光标记实验结果。
图10为基于第10轮筛选(含两次反向筛选，如图3所示)所得最高丰度核酸适配体序列合成的荧光核酸适配体对感染水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱中肠组织的免疫荧光标记实验结果。
图11为基于最优核酸适配体f20的二级结构预测图。
具体实施方式
下面，对本说明书中使用的一般的术语的定义进行说明。
本说明书中，所谓“核酸”指由核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的链状生物大分子。核苷酸包括核糖核苷酸或脱氧核苷酸，前者含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶的四种核糖核苷酸，后者含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶脱氧核苷酸。核糖核苷酸酯化形成rna，脱氧核苷酸酯化形成dna。对本发明而言，核酸优选指dna。
本说明书中，所谓“靶物质”即可以被固定于固相载体且可以被单链核酸结合的单一物质，包括：肽、离子、有机分子、活细胞等。对本发明而言，优选靶物质为带有6个连续组氨酸的可溶蛋白质。
本说明书中，所谓“固相载体”即可以特异性固定靶物质且具有和液体实现物理分离能力的物质，包括：镍离子包被的或链亲和素包被的无磁性树脂颗粒、有磁性树脂颗粒等。对本发明而言，优选固相载体为镍离子包被的有磁性树脂颗粒，直径为1μm。
本说明书中，所谓“核酸适配体”即可以通过单链化，利用自身氢键折叠出二级结构，并进一步折叠出三级结构，且特异性、高强度地结合靶物质的核酸分子。核酸适配体通常指单链dna分子或单链rna分子，被称为dna核酸适配体或rna核酸适配体，长度在50-200nt范围内。本说明书所述核酸适配体优选为dna核酸适配体，其长度优选为116nt。
本说明书中，所谓“乳浊液pcr”即通过将配置好的pcr水相体系通过匀浆的方法分散到有机相中，实现彼此隔离的pcr反应环境。乳浊液pcr可以有效地将高度多样的dna模板分散到隔离的水珠中，实现相互无干扰的无差别均等扩增。本发明书所述乳浊液pcr指按照特定配方，特定水油比例进行匀浆的乳浊液pcr体系。
本说明书中，所谓“酶联寡核苷酸吸附”法，即通过高亲和力酶标板将待测蛋白样品固定于皿底，添加生物素化的核酸适配体分子孵育，再添加hrp交联的链霉亲和素溶液进行标记，最后添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)进行反应。通过对显色程度的测量，实现对水稻黑条矮缩病毒p10蛋白含量的比较。另外，当本方法用于核酸适配体亲和能力的验证时，则将等量p10蛋白固定于酶标板皿底，在不同孔中添加不同的核酸适配体进行上述实验，通过比较不同孔中的显色程度，判定核酸适配体对p10蛋白的亲和能力。
本说明书中，所谓“核酸适配体序列的免疫荧光标记方法”，即通过对核酸适配体在其5’末端连接荧光基团，从而将修饰后的核酸适配体作为荧光探针，对携带水稻黑条矮缩病毒的生物组织进行免疫荧光标记的实验方法。
实施例1核酸适配体的筛选方法
本发明的核酸适配体的筛选流程如图1所示。
本发明的核酸适配体的筛选方法包括以下工序：
(1)靶物质固定工序
筛选缓冲液配方如下：
140mm氯化钠
2mm氯化钾
5mm氯化镁
2mm氯化钙
20mm三羟甲基氨基甲烷(tris)ph7.4
0.05％(v/v)吐温20
靶物质溶液：
选用氮端融合有6x组氨酸标签的p10蛋白作为靶物质，用筛选缓冲液将原核表达的氮端融合有6x组氨酸标签的p10蛋白(其氨基酸序列如seqidno.:30所示)溶解至1μg/μl，标记为p10蛋白储存液。
靶物质固定方法：
取10微升磁珠稀释于500微升筛选缓冲液，放置于磁力架上室温静置2分钟，用移液枪吸弃液体。
加入500微升筛选缓冲液重悬磁珠，操作同第一步，清洗两次，标记为清洗后的磁珠。
取10微升p10蛋白储存液于500微升筛选缓冲液，使用涡旋仪充分混匀，标记为p10蛋白稀释液。
将该500微升p10蛋白稀释液和清洗后的磁珠用移液枪混匀，室温静置1小时，期间颠倒混匀数次避免沉淀，标记为磁珠-蛋白混合液。
将磁珠-蛋白混合液放置在磁力架上，室温静置2分钟，分离磁珠和液体。
用移液枪吸弃液体后，加入500微升筛选缓冲液重悬磁珠，再次在磁力架上静置两分钟，用移液枪吸弃液体。重复本步骤3次。
所得磁珠标记为p10-磁珠，进行后续实验。
(2)单链核酸文库制备工序
对于第1轮筛选，稀释35.7微克的n80初级文库于500微升筛选缓冲液中，用涡旋仪最高速10秒混匀，得初级文库的核酸稀释液。该初级文库为长度为116nt的随机ssdna文库，由两端各18nt的引物区和中间80nt的随机区组成，即5’-tgacaccgtacctgctct(n80)aagcacgccagggactat-3’(具体序列如seqidno.:1所示)，其中n80代表80个随机核苷酸，上游引物：5’-tgacaccgtacctgctct-3’，下游引物：5’-atagtccctggcgtgctt-3’。
对于第2-10轮筛选，稀释1-3微克(每轮筛选具体用量如图2所述)上一轮的epcr回收产物(如“回收工序”所述)于500微升筛选缓冲液，用涡旋仪最高速10秒混匀，得第2-10轮筛选的核酸稀释液。
将上述所得核酸稀释液置于金属浴上95℃10分钟，开盖平衡气压后使用涡旋仪最高速5秒混匀，快速放置于冰水浴上降温折叠5分钟，标记为本轮使用的核酸文库。
(3)亲和结合工序
核酸适配体结合及清洗方法
将本轮使用的核酸文库500微升添加至靶物质固定工序所得的p10-磁珠中，在涡旋仪上最高速混匀10秒，充分重悬p10-磁珠，标记为p10-磁珠文库重悬液。
将所得的p10-磁珠文库重悬液在25℃条件下静置结合15-90分钟(每轮筛选中静置结合时间如图2所述)，期间可摇动混匀避免沉淀。
将p10-磁珠文库重悬液放置于磁力架上静置1分钟，用移液枪吸弃全部液体，即分离未结合单链dna，标记该磁珠为p10-磁珠-适配体复合物。
将500-1000微升(每轮筛选中清洗所用体积时间如图2所述)筛选缓冲液与磁珠混合，用移液枪温和重悬p10-磁珠-适配体复合物，然后将重悬的p10-磁珠-适配体复合物放置于磁力架上室温静置2分钟，用移液枪吸弃全部液体。该步骤重复1-3次。标记为清洗后的p10-磁珠-适配体复合物。
(4)洗脱工序
加入100微升纯水充分重悬亲和结合工序所得的清洗后的p10-磁珠-适配体复合物。使用涡旋仪最高速混匀10秒。
将重悬的清洗后的p10-磁珠-适配体复合物放置于金属浴在95℃处理5分钟，期间开盖平衡气压并在最高速涡旋一次，时间为5秒。
5分钟结束时再对重悬的清洗后的p10-磁珠-适配体复合物涡旋一次，条件为最高速10秒。
快速将重悬的清洗后的p10-磁珠-适配体复合物置于磁力架上分离磁珠和上清液，用移液枪转移上清液至1.5ml离心管中并快速放置于冰上。标记该上清液为洗脱的适配体，作为下一步扩增工序的dna模板。
(5)扩增工序
epcr通用配方如下：
水相配制，依次在冰浴条件下按如下顺序添加：
纯水:68微升
10xpcr缓冲液[100mmtris(ph8.8，25℃)，500mm氯化钾]:20微升
氯化镁(浓度25mm):32微升
正向引物(浓度100mm):8微升(seqidno.:2)
反向引物(浓度100mm):8微升(seqidno.:3)
dntp(浓度10mm):8微升
牛血清白蛋白(浓度1mg/ml):2微升
洗脱工序所得洗脱的适配体:50微升
taqdna聚合酶(浓度5μ/μl):4微升
标记为epcr水相。
有机相配制，依次在室温条件下按如下顺序添加：
邻苯二甲酸碳酸酯:880微升
矿物油:80微升
聚甘油-4异硬脂酸酯:240微升
标记为epcr有机相。
乳化方法：
室温配置有机相，将1200微升的epcr有机相用移液枪分装到4个2毫升axygen离心管，每管300微升。使用涡旋仪在最高速涡旋30秒，混匀后室温静置25分钟。
取200微升epcr水相在涡旋仪上最高速涡旋混匀10秒，放置于冰上待用。
用移液枪吸取50微升epcr水相加至装有300微升有机相的2毫升离心管中。一共四个含epcr有机相的2毫升axygen离心管均按此操作。
将该2毫升离心管在室温振荡乳化，振荡条件为30赫兹，10秒。
用移液枪分装振荡后所得乳浊液，将每50微升分装到每个200微升的薄壁pcr管中。标记为epcr乳浊液。
epcr扩增程序“epcr20/15/10”：
将上述装有epcr乳浊液的薄壁pcr管放置于pcr仪中，如下设置epcr程序：
第一步:95℃2分钟
第二步:[95℃30秒，55℃60秒，72℃3分钟]，epcr循环数10-20次(每轮使用的epcr循环数如图2所述)。
第三步:72℃5分钟
第四步:4℃维持恒温待取出
标记为epcr反应后乳浊液。
经epcr扩增反应后，得epcr产物。
(6)回收工序
epcr产物回收方法：
从pcr仪中取出薄壁pcr管。
将pcr管中epcr反应后乳浊液用移液枪悬浮均匀后转移至2毫升离心管中，每2毫升离心管中分装700微升epcr反应后乳浊液。
用移液枪加入1毫升的水饱和仲丁醇，在涡旋仪上室温最高速振荡1-2分钟，室温离心12000xg，1分钟。
用移液枪吸弃上层有机层。
加入1毫升的tris平衡酚氯仿异戊醇(含苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1，ph≥7.8)，室温条件下在涡旋仪上最高速涡旋1分钟，室温离心12000xg，1分钟。
用移液枪小心转移全部上层水相，汇总至一个新的1.5毫升离心管。
用移液枪加入600微升的无水仲丁醇，关闭离心管后颠倒摇晃使之混匀，室温离心12000xg，1分钟。用移液枪吸弃上层有机层。
重复上一步一次。
再次用移液枪加入400微升无水仲丁醇，关闭离心管后颠倒摇晃使之混匀，室温离心12000xg，1分钟。用移液枪吸弃上层有机层。
逐量添加无水仲丁醇配合如上所述的颠倒混匀和离心步骤，缓慢调整下层水相至100微升刻度，用移液枪吸弃上层有机层。
使用qiaquickpcrpurificationkit纯化水相中的pcr产物，操作参考试剂盒生产商提供的步骤。
使用nanodrop2000测定dna含量和纯度，作为本轮epcr回收产物。
(7)监测工序
根据nanodrop2000测定的本轮epcr产物中的核酸浓度计算epcr回收产物的核酸总质量，若epcr回收产物的核酸总质量大于等于3微克，则执行下一轮筛选；若核酸总质量大于等于1微克且小于3微克，则重复本轮筛选；若核酸总质量小于1微克，则下一轮执行等比放大扩增。当本轮获得的epcr回收产物的核酸总质量显著高于上一轮获得的epcr产物时，则说明具有亲和性的核酸适配体已经开始富集。
(8)反向筛选工序
在第6轮筛选结束和第8轮筛选结束后进行反向筛选工序。先进行单链核酸文库制备工序，再进行反向筛选工序，具体操作步骤如下所述：
用移液枪取20微升新的磁珠。用500微升筛选缓冲液重悬后，放置于磁力架上静置2分钟，用移液枪吸弃液体，重复该清洗步骤3次。
取上一轮epcr回收产物1-2微克(每次反向筛选具体使用的核酸量如图2所述)，执行单链核酸文库制备工序，获得本轮使用的核酸文库。
用单链核酸文库制备工序制备好的本轮使用的核酸文库500微升，充分重悬该磁珠。在涡旋仪上最高速涡旋10秒。
室温25℃静置该重悬磁珠1小时。
将磁珠悬浮液在磁力架上静置2分钟，用移液枪小心吸取全部液体作为去除非特异性结合序列的本轮单链核酸文库。
用所得的去除非特异性结合序列的本轮单链核酸文库，执行下一轮筛选，即后续亲和结合工序，直到监测工序为止。
(9)等比放大扩增
仅当本轮epcr回收产物总质量低于1微克的情况下执行，具体执行步骤如下所述：
使用全部的本轮epcr回收产物作为dna模板，参照如扩增工序所述，配置epcr有机相和epcr水相。
制备epcr乳浊液，方法参照“乳化方法”。
执行“epcr扩增程序”，采用的epcr循环数为20。
回收epcr产物，方法参照“epcr产物回收方法”，回收产物标记为等比放大扩增产物
若等比放大扩增产物总质量大于3微克即判定执行下一轮筛选，若等比放大扩增产物低于1微克，则丢弃等比放大扩增产物，从上一轮筛选剩余的epcr回收产物执行单链核酸文库制备工序直到监测工序为止。
实施例2以水稻黑条矮缩病毒p10蛋白为靶物质进行单链dna核酸适配体筛选
如图3所示，在10轮的核酸适配体筛选过程中，在第3轮后执行了等比放大扩增工序，在第4轮后执行了重复本轮筛选，在第6轮和第8轮后执行了反向筛选工序。在每一轮筛选中，严格按照如图2所示的每轮筛选条件进行了p10蛋白的核酸适配体筛选，并顺利完成了10轮。
具有亲和p10蛋白的核酸适配体在第6轮筛选后开始富集。如图4所示，通过监测工序对每一轮筛选的epcr产物总量进行比较，可以发现epcr产量在第6轮开始显著提高，提示核酸适配体的筛选已经将具有亲和p10蛋白的核酸适配体进行了富集。用第6轮的epcr产物进行一轮反向筛选后，将剩余的epcr产物随机测序50个反应。从测序结果中去除引物二聚体、长度低于80nt的序列、重复序列，获得f1、f3、f4、f5、f6、f11、f13、f15、f16、f17、f20、f21、f22、f24、f25、f26、f27、f28、f29、f32、f34、f36、f38、f45共24条候选的核酸适配体，其核酸序列分别如seqidno.:6-29所示。可见，采用本发明的筛选方法，可以不用进行10轮而仅用6轮筛选，即可获得能够去除结合到载体上的非特异性核酸适配体，能够筛选出高亲和力核酸适配体，特别是dna核酸适配体，并通过调整多个参数逐步增加筛选过程的严格程度，监控核酸适配体的多样性程度和各链丰度。此外，通过减少筛选轮数，将10轮筛选减少到6轮，可以将筛选时间缩短到3天。
1-10轮的epcr产物琼脂糖凝胶电泳证明epcr法可以成功将核酸适配体文库进行隔离式大量扩增。图5a显示本发明方法所述乳化方法制备的epcr乳浊液可以形成均一的直径为10微米的epcr悬滴，从而将pcr反应体系中的核酸模板分子相互分离进行独立的pcr反应。如图5b所示，1-10轮epcr实现了对核酸适配体筛得文库的大量扩增，并且没有产生常规开放式pcr反应带来的大于目的片段的杂交带，该结果证明采用epcr方法对于核酸适配体筛得文库进行均等扩增的优越性。成功的epcr反应是建立基于epcr回收产物核酸总质量的监测工序的重要前提。
实施例3基于特异性识别水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白p10的核酸适配体的病毒快速检测方法(酶联寡核苷酸吸附实验)
一、实验方法
(1)合成生物素化核酸适配体，方法如下：使用seqidno.:3和seqidno.:4的组合作为pcr扩增的引物，使用1ng/μl的优选的核酸适配体f20作为dna模板，依次在200微升薄壁pcr管中添加如下物质：2xtaqmastermix(诺唯赞，货号：p113-01)，纯水23.5微升，dna模板1微升，0.25微升浓度为100μm的生物素化正向引物(seqidno.:4)，0.25微升浓度为100μm的反向引物(seqidno.:3)。在涡旋仪上振荡10秒混合均匀后，将薄壁pcr管放入pcr仪中，执行pcr程序如下：95℃2分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，循环30次；72℃5分钟，4℃维持。该pcr产物使用qiaquickpcrpurificationkit进行纯化，操作参考试剂盒生产商提供的步骤。将获得的核酸适配体稀释至1ng/μl，在95℃条件下处理10分钟后快速置于冰上放置10分钟。
(2)将待测样品研碎后溶解于包被液(0.05m碳酸盐缓冲液，ph9.6)中，滴加100微升至高亲和力酶标板孔内。在4℃条件下静置过夜。
(3)次日用200微升磷酸盐吐温缓冲液(pbst：0.02m磷酸盐缓冲液，ph7.4，含吐温-200.05％)洗板3次，每次甩干。
(4)加入100微升含3％牛血清白蛋白的包被液到各孔，室温静置2小时。
(5)用200微升筛选缓冲液(与靶物质固定工序所用筛选缓冲液相同)冲洗酶标板各孔3次，每次结束后甩干并在吸水纸上倒置酶标板，吸干残余液体。
(6)按照所需用量为100微升每孔，配置浓度为1ng/μl的生物素化核酸适配体，溶解于筛选缓冲液中，沸水中水浴10分钟后快速放于冰上静置10分钟，添加牛血清白蛋白粉末至终浓度为3％，充分溶解后以此作为核酸适配体溶液。
(7)将该核酸适配体溶液按100微升加入到各待检孔内，室温静置1小时。
(8)用200微升筛选缓冲液冲洗酶标板各孔3次，每次结束后甩干并在吸水纸上倒置酶标板，吸干残余液体。
(9)在各孔中加入100微升浓度为0.2μg/ml的交联有hrp基团的链霉亲和素(溶解于筛选缓冲液)
(10)用200微升筛选缓冲液冲洗酶标板各孔3次，每次结束后甩干并在吸水纸上倒置酶标板，吸干残余液体。
(11)各孔加入现用现配的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)显色液(配方为10ml柠檬酸缓冲液 10μl30％h2o2 50μltmb贮液)室温避光静置5-30分钟。
(12)各孔加入50微升浓度为0.5mh2so4终止反应。
(13)在非实验室条件下，通过目测各孔黄色和对照组孔(预固定bsa)的黄色深度，判定该样本是否带有病毒。颜色越深，含病毒量越高。在实验室条件下可使用酶标仪检测a450吸光度值进行各孔蛋白样品水稻黑条矮缩病毒p10蛋白含量的精确比较。
二、实验结果
(1)第6轮筛选所得24个核酸适配体中9个具有和p10蛋白较高的亲和能力
如图6所示，在该酶联寡核苷酸吸附实验中，以100纳克p10蛋白代替了原方案中待测蛋白，以此对第6轮筛选测序所得24个核酸适配体进行了亲和能力检测。测试结果显示编号为f1、f11、f15、f17、f20、f24、f26、f27、f29具有较高的p10亲和能力和较低的bsa亲和能力。
(2)基于f20核酸适配体建立的酶联寡核苷酸吸附实验可以高通量快速检测样品中水稻黑条矮缩病毒含量
如图7所示，将待检蛋白样品按照前述酶联寡核苷酸吸附实验，优选生物素化的f20核酸适配体作为检测用核酸适配体进行检测操作后，含有水稻黑条矮缩病毒的蛋白样品所在的孔道在实验中出现明显不同程度的黄色反应物。而不含水稻黑条矮缩病毒的样品则保持无色。本实验证明本发明所述基于特异性结合水稻黑条矮缩病毒p10蛋白的核酸适配体可以用于开发简易快捷的病毒检测试剂盒。
实施例4基于特异性识别水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白p10的核酸适配体的免疫荧光标记方法
一、实验方法
(1)texasred标记的核酸适配体引物为：seqidno.:3和seqidno.:5。
(2)使用seqidno.:3和seqidno.:5的组合作为pcr扩增的引物，使用1ng/μl的优选的核酸适配体f20作为dna模板，依次在200微升薄壁pcr管中添加如下物质：2xtaqmastermix(诺唯赞，货号：p113-01)，纯水23.5微升，dna模板1微升，0.25微升浓度为100μm的荧光正向引物(seqidno.:5)，0.25微升浓度为100μm的反向引物(seqidno.:3)。在涡旋仪上振荡10秒混合均匀后，将薄壁pcr管放入pcr仪中，执行pcr程序如下：95℃2分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，循环30次；72℃5分钟，4℃维持。该pcr产物使用qiaquickpcrpurificationkit进行纯化，操作参考试剂盒生产商提供的步骤。将获得的核酸适配体稀释至1ng/μl，在95℃条件下处理10分钟后快速置于冰上放置10分钟。
(3)在体式显微镜下用眼科手术镊分离得到携带水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱中肠组织。
(4)将该中肠组织置于4％多聚甲醛中室温固定20分钟。
(5)将固定后的中肠组织在磷酸盐缓冲液(氯化钠137mm，氯化钾2.7mm，磷酸氢二钠10mm，磷酸二氢钾1.76mm，3％bsa)中室温浸泡5分钟。
(6)将中肠组织转移至含3％bsa的磷酸盐缓冲液中，在25℃条件下静置封闭一小时。
(7)将封闭后的中肠组织浸泡于浓度为1ng/μl的核酸适配体的磷酸盐缓冲液中。在4℃条件下避光静置12小时。
(8)用50微升磷酸缓冲液浸泡中肠组织5分钟后取出中肠。重复本步骤3次。
(9)在载玻片上滴加50微升防荧光淬灭封片液，将上述处理后的中肠组织转移至该封片液滴中，轻轻盖上盖玻片。
(10)在激光共聚焦显微镜下使用波长为595纳米的激光作为激发光照射中肠组织，收集613纳米的发射光进行中肠组织中水稻黑条矮缩病毒p10蛋白分布的共聚焦成像。
二、实验结果
(1)荧光标记的核酸适配体f1、f17、f20、f26对p10蛋白的标记证明f20为优选核酸适配体
图8示出采用荧光标记的核酸适配体f1、f17、f20对携带水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱中肠组织进行核酸适配体的免疫荧光标记，结果显示f1、f17、f20、f26中，f20的特异性和灵敏度最高，核酸适配体f1、f17、f26虽然同样能够标记病毒的p10蛋白，但是出现了不同程度的非特异性染色，证明f1、f17、f26的特异性不如f20。因此，基于免疫荧光定位结果，核酸适配体f20为水稻黑条矮缩病毒p10蛋白的优选核酸适配体。
(2)荧光标记的核酸适配体f20在用于p10蛋白的标记时具有优于单克隆抗体的分辨率
优选上述9个适配体中p10亲和能力最高的核酸适配体f1、f17、f20、f26，依照texasred标记的核酸适配体合成方法，进行荧光核酸适配体的合成。在携带水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱中肠组织中进行核酸适配体的免疫荧光标记，结果如图9所示。核酸适配体f20和由p10蛋白单克隆抗体标记的荧光分布完全一致，且无明显非特异性结合。证明该核酸适配体对靶分子已具有较强结合能力，特异性较好。另外，如图9所示，由荧光核酸适配体标记产生的背景信号明显低于抗体标记产生的背景信号，证明核酸适配体在免疫荧光标记实验中相对于抗体的优越性。由此可见，与抗体相比，该核酸适配体作为荧光探针，信号更强，本底荧光更低，信噪比更高。基于荧光核酸适配体的免疫荧光标记法，操作简便，效果好，已经可以在实验中替代抗体。
(3)第10轮筛选后所得核酸适配体具有更强的结合能力和更高的特异性
如图10所示，按照如图2所示方案经过10轮的筛选后，所得的最高丰度的核酸适配体f27在免疫荧光标记实验中表现出了比f20(如图8所示)更强的荧光信号，并且同样保持了信号分布和抗体标定的p10蛋白的一致性。
实施例5核酸适配体f20和该核酸适配体中央随机区域的二级结构预测
综合酶联寡核苷酸吸附实验和免疫荧光标记实验结果，优选核酸适配体f20作为水稻黑条矮缩病毒p10蛋白的核酸适配体。对核酸适配体f20和中央随机区域用mfold预测软件里的dnafoldingform工具包进行二级结构预测，预测输入条件为：链状单链dna，25℃，钠离子浓度140mm，镁离子5mm，预测结果如图11所示。图11显示中央随机区域在截去两侧固定引物序列后依然具有和全长核酸适配体f20相似的二级结构。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
序列表
<110>新加坡国立大学（nationaluniversityofsingapore）
苏州工业园区新国大研究院
江苏省农业科学院
<120>特异性识别水稻黑条矮缩病毒p10蛋白的核酸适配体及其筛选方法和用途
<130>dic18110078
<160>30
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1.一种核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列包含tgacaccgtacctgctct(n)xaagcacgccagggactat，其中，n为核糖核苷酸或脱氧核苷酸，优选为g、t、a或c，x为50-100之间，优选为60-90，最优选为80的自然数。
2.如权利要求1所述的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列选自seqidno.:6-29中的一个；更优选地，所述核酸适配体的核苷酸序列为seqidno.:6、11、13、15、16、19、21、22或24；最优选地，所述核酸适配体的核苷酸序列为seqidno.:16。
3.如权利要求1或2所述的核酸适配体，其中所述核酸适配体与一种或多种选自荧光分子、放射性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、酶标记和毒素分子的物质连接。
4.如权利要求1至3中任一项所述的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列包括在其一个或多个位置处的磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化和/或同位素化。
5.一种核酸适配体的筛选方法，该筛选方法包括以下步骤：
(1)将靶物质固定于固相载体；
(2)制备单链核酸文库；
(3)将变性后的单链核酸文库和固定于载体的靶物质在溶液中混合，分离未结合的单链核酸与载体-靶物质-单链核酸复合体；
(4)通过洗脱将载体-靶物质-单链核酸复合体中的单链核酸分离；
(5)将分离的单链核酸加入水油混合物，通过匀浆制成水油乳浊液，进行隔离式epcr扩增；
(6)采用有机溶剂破坏乳浊液，回收水相中的双链核酸分子；
(7)测定epcr回收产物的产量，依其判定执行下一轮筛选、重复本轮筛选或执行等比放大扩增；
任选地，以后筛选轮次中的单链核酸文库为上一轮epcr回收产物形成的单链核酸文库；
优选地，所述核酸适配体为dna；
在步骤(1)中，优选地，所述靶物质为肽；更优选地，所述肽具有连续六个组氨酸序列；优选地，所述肽为病毒外壳蛋白；优选地，所述病毒为水稻黑条矮缩病毒；优选地，所述病毒外壳蛋白为水稻黑条矮缩病毒p10蛋白；
在步骤(1)中，优选地，所述固相载体为镍离子包被的磁珠；
在步骤(3)中，优选地，所述分离采用离心管磁力架；
在步骤(5)中，优选地，所述匀浆为室温条件下30赫兹振荡10秒；
在步骤(6)中，优选地，所述有机溶剂为水饱和仲丁醇或无水仲丁醇。
6.如权利要求5所述的筛选方法，所述筛选方法还包括重复步骤(1)至(7)一次或多次，其中将上一轮筛选回收的部分双链核酸分子制备成单链核酸，作为下一轮筛选的单链核酸文库；优选地，所述重复为5-9次。
7.如权利要求5或6所述的筛选方法，所述筛选方法还包括反向筛选；优选地，所述反向筛选采用无靶物质的载体分离去除文库中亲和结合固相载体的核酸分子；更优选地，反向筛选工序仅在第7轮和第9轮筛选之前进行。
8.如权利要求5至7中任一项所述的筛选方法，在步骤(7)中，所述判定包括分别将epcr回收产物的产量与安全值和预警值进行比较；优选地，若epcr回收产物的产量大于等于安全值，则执行下一轮筛选；若epcr回收产物的产量大于等于预警值且小于安全值，则重复本轮筛选；若epcr回收产物的产量小于预警值，则执行等比放大扩增；优选地，所述安全值为3微克；优选地，所述预警值为1微克；
优选地，所述执行下一轮筛选是指所述筛选条件相对上一轮筛选条件改变的筛选；优选地，所述筛选条件的改变是指所述筛选条件中一个或多个的改变，所述筛选条件选自：本轮使用的核酸文库总质量、靶物质-载体复合物总量、结合静置时间、清洗次数、清洗所用体积和epcr循环数中的一个或多个；优选地，各轮筛选条件设置的如下表所示：
9.一种水稻黑条矮缩病毒的检测方法，所述检测方法包括使用权利要求1至4中任一项所述的核酸适配体根据酶联寡核苷酸吸附法检测水稻黑条矮缩病毒，或根据免疫荧光标记法检测水稻黑条矮缩病毒。
10.一种用于检测水稻黑条矮缩病毒的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1至4中任一项所述的核酸适配体和任选的用于酶联寡核苷酸吸附法检测或免疫荧光标记法检测的试剂。
技术总结