本发明涉及生物技术领域，特别是一种番茄泛素化e3连接酶基因slchip1和slchip2及slchip1的应用。
背景技术：
随着我国农业的发展和进步，蔬菜种植业也越来越规模化产业化。然而，正是大规模蔬菜的种植，面对的生物或者非生物的灾害也越来越多，灾害的来临常常造成巨大的经济损失。特别是全球气候变暖，气温逐渐升高，严重影响了农作物的生长繁殖。番茄作为一种夏季生长的农作物，常常面临着高温的考验，如何从根本上解决番茄抗高温这一问题是具有重大意义的。
泛素化是蛋白质组中最普遍的翻译后修饰的方式之一，经过三种酶(e1、e2和e3)的催化，将泛素分子共价结合到靶蛋白上。泛素化广泛参与了诸如转录调节、dna损伤修复、细胞周期、细胞凋亡、囊泡运输等生理过程。许多研究证明，不同的e3连接酶通过不同机制调控生物的各个生理过程，在植物中主要体现为抗逆境胁迫。已有研究表明atchip在拟南芥抗高温胁迫中起重要作用(plosgenet.2014,10(6):e1004118)，而番茄中的chip同源基因还未被克隆，其功能未知。如若番茄中存在atchip的同源基因，而它的功能及作用机理需要进一步的研究验证。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种番茄泛素化连接酶的基因slchip1和slchip2，以及slchip1基因在植物抗高温育种及选种上的应用。
针对上述技术问题，本发明提供了一种番茄泛素化e3连接酶基因slchip1，所述番茄泛素化e3连接酶基因slchip1的核苷酸序列如下：
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所述番茄泛素化e3连接酶基因slchip1在植物抗高温中的应用。
一种番茄泛素化e3连接酶基因slchip2，所述番茄泛素化e3连接酶基因slchip2的核苷酸序列如下：
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本发明相对于现有技术具有的有益效果：提供一种番茄泛素化e3连接酶的基因slchip1和slchip2。并将上述番茄泛素化e3连接酶的基因slchip1应用到提高番茄或其它植物的抗高温性能上。
附图说明
图1本发明的基因slchip1和slchip2的克隆结果。
图2本发明的24个不同物种中的slchip1和slchip2同源基因分析进化树a。
图3本发明的24个不同物种的40个chip同源序列分析进化树b。
图4本发明的番茄泛素化e3连接酶基因slchip1和slchip2基因沉默以及对热的敏感性。
图5本发明中高温胁迫下基因沉默番茄植株中不可溶蛋白的变化。
图6本发明中高温胁迫下不可溶蛋白中泛素化蛋白含量与番茄泛素化e3连接酶基因slchip1和slchip2的关系。
图7本发明中番茄泛素化e3连接酶基因slchip1和slchip2基因在不同激素途径中的表达。
图8本发明的番茄泛素化e3连接酶基因slchip1转基因到拟南芥中在抗高温中所起的作用。
具体实施方式
所述番茄泛素化e3连接酶基因slchip1的核苷酸序列如下：
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所述番茄泛素化e3连接酶基因slchip2的核苷酸序列如下：
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一、番茄泛素化e3连接酶基因slchip1和slchip2的克隆
1、材料准备
番茄为浙杂809，拟南芥为野生型(col-0)、突变体(atchip1、atchip2)、转基因(atchip1/slchip1、atchip2/slchip2)；大肠杆菌菌株为dh5α，农杆菌菌株为gv3101；质粒为pfgc5941、trv1、trv2、trv2-pds。
2、番茄培养
2.1基质灭菌
番茄基质由草炭：蛭石体积比＝1:1组成，并加水搅拌均匀。湿润程度是用手攥起，有水溢出但是不会形成水流。设定高压蒸汽灭菌锅的灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min，压强为100kpa，保证杀死基质中的病原微生物和虫卵。基质灭完菌后取出待冷却后放入干净的箱子中备用。
2.2种子处理
番茄种子采用温汤浸种进行消毒和催芽，种子进行55℃恒温水浴，30min，水浴后的种子置于培养皿中，底部加双层滤纸，用蒸馏水浸透滤纸，将培养皿置于23℃恒温培养箱中培养，每12h观察一次，及时补水。约2-3天，种子发芽即可播种。
2.3营养液配制
番茄营养液使用霍格兰营养液。
2.4播种
提前清理场地，检查基质的湿度，填满穴盘，不要压太紧实。将发芽的番茄种子依次种植于穴盘内，一穴一种。配置好的霍格兰营养液工作液倒入托盘，盖上盖子注意保湿3天，设置人工气候室的温度23℃，湿度75％。
2.5移苗
一般播种三天后开始零星出苗，七天基本上出苗完毕，10-14天后可以进行移苗。移苗三天内需要盖上盖子保湿。
2.6养护
定期检查番茄发芽、出苗、及幼苗生长情况，做好照片记录。及时补充营养液。
3、拟南芥培养
3.1基质灭菌
拟南芥基质由草炭：蛭石体积比＝2:1组成，并加蒸馏水搅拌均匀。湿润程度是用手攥起，有水溢出但是不会形成水流。设定高压蒸汽灭菌锅的灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，压强为100kpa，保证杀死基质中的病原微生物和虫卵。基质灭完菌后取出待冷却后放入干净的箱子中备用。
3.2种子处理
拟南芥种子预处理与番茄不同，采用预冷处理进行催芽。将所需种子置于1.5mlenppendorf管内，加dh2o，摇晃后置于4℃冰箱。
3.3营养液配制
拟南芥使用霍格兰营养液。
3.4播种
提前清理场地，检查基质的湿度，填满穴盘，不要压太紧实。剪去枪头前端，用移液枪吸取种子均匀的打在每个穴孔的中心位置。配置好的霍格兰营养液工作液倒入托盘，盖上盖子注意保湿，并设置人工气候室的白天温度21℃，湿度75％。
3.5移苗
一般播种三天后开始零星出苗，七天基本上出苗完毕，10-14天后可以进行移苗。原则：一苗一孔。要小心不要损坏拟南芥幼苗根系。移苗三天内需要盖上盖子保湿。
3.6养护
定期检查拟南芥发芽、出苗、及幼苗生长情况，做好照片记录。及时补充营养液。
3.7收种
开花后两周可以准备收种。注意将不品种拟南芥分开，避免种子混在一起。
4、基因克隆及序列分析
4.1提rna，反转cdna
用总rnasimpletotalrnakit试剂盒提取总rna，并跑电泳检测提取的总rna质量。tiangenfatquantrtkit第一链合成试剂盒进行反转。
4.1.1植株总rna的提取
将番茄或拟南芥叶片在液氮中磨碎，加1ml裂解液rz，用匀浆仪进行匀浆处理。样品的体积不应超过裂解液rz体积的十分之一。将匀浆样品在室温下放置5min，使核酸蛋白复合体完全分离。4℃，12000rpm离心5min，取上清，转到一个新的无rnase的离心管中。加入200ul的氯仿，盖好盖子，剧烈振荡15sec，室温放置3min。4℃，12000rpm离心10min，样品分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相。rna主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液rz的50％。将水相转移到新管中。缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀分2次转入吸附柱cr3，4℃，12000rpm离心30sec，弃掉收集管中的废液。向吸附柱cr3中加入500ul去蛋白液rd(已加入乙醇)，4℃，12000rpm离心30sec，弃废液，将cr3放入收集管中。向吸附柱cr3中加入500ul漂洗液rw(已加入乙醇)，室温放置2min，4℃，12000rpm离心30sec，弃废液。重复漂洗液的步骤。将吸附柱放入2ml收集管中，4℃，12000rpm离心2min，去除残余液体。将吸附柱cr3转入一个新的1.5ml得离心管中，加50ulrnase-freeddh2o，室温放置2min,4℃，12000rpm离心2min。分装，保存于-80℃。
4.1.2琼脂糖凝胶电泳检测总rna的质量
核酸为两性离子，有阳离子和阴离子基团，常以颗粒分散在溶液中。它们的静电荷取决于介质的h 浓度或与其他大分子的相互作用。在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号。它包括四个过程：电解、电泳动、电层积、电襂。在需快速检测所提总rna样品完整性时，rna电泳可以在非变性条件下进行，配制普通的1％琼脂糖凝胶即可。用biorrd进行电泳分析。
4.1.3反转录
反转录的原理是以rna为模板,通过反转录酶,合成dna。番茄总rna用tiangenfatquantrtkit第一链合成试剂盒进行反转录。反转录体系如下：
表1-1gdna去除体系
使用pcr仪，42℃，3min，然后置于冰上。
表1-2反转录反应体系
使用pcr仪，42℃，15min；95℃，3min，然后置于冰上。
4.2pcr
使用primerpremier软件设计slchip1引物对，以及slchip2引物对，序列见表2-1。
按pcrsystem和pcrprogram扩增slchip1和slchip2。slchip1用引物primerf1，primerr1；slchip2用引物primerf2，primerr2(表2-1)。pcrsystema20ul，由10ul2×mix，上下游引物各0.25ul10um，2ulcdna组成,最后用ddh2o补足总体积。pcrsystemb20ul，由10ul2×mix，上下游引物各0.25ul10um，0.5ulcdna,最后用ddh2o补足总体积。pcr扩增条件均采用94℃变性2min，94℃变性30sec。55℃退火和72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸7min。
利用pcr反应体系及pcrprogram，扩增获得slchip1和slchip2两个基因。
pcr扩增获得两个番茄泛素化e3连接酶基因slchip1和slchip2。如图1b所示，基因slchip1(编号3、4)电泳条带在基因slchip2(编号1、2)条带下方，说明其基因长度小于slchip2，测序结果表明slchip1为957bp，slchip2为831bp。如图1c所示，基因slchip1和基因slchip2都含3个tpr，但只有基因slchip1含有u-box，说明基因slchip1和基因slchip2虽然同源，但却不同，同源性比对结果显示，二者同源性达到44.9％。
表2-1引物序列
4、进化树分析
为了了解slchip1和slchip2这两个基因的进化关系，选取植物(烟草，番茄，拟南芥等)、动物(果蝇，天牛，家鼠等)不同物种的同源序列构建进化树。如图2，为24个不同物种中slchip1基因与slchip2基因的对比，从图中可以看出，slchip1基因与slchip2基因在两个不同的簇中，可以推断出这两个基因可能存在差异。而且有意思的是nelumbonucifera-1与slchip1基因和slchip2基因都未在同一个簇中，而是独立出来的；而nelumbonucifera-2与slchip2基因在同一个簇中。这就说明这两个基因在进化当中并未在同一物种中按照同一的亲源关系在进化，而是存在差异，事实上，slchip1位于第六条染色体，slchip2位于第九条染色体上，这就更加说明了这两个基因的功能可能存在差异。
如图3所示，我们还分别检测了24个物种的40个chip同源序列，它们属于动物、植物或微生物。除slchip2外，23种植物聚集在同一起源的集群中。在14只动物的chip中，只有12个组成一个分支。其他两个动物chips形状的a和b的果蝇黑色素组单独形成一个部分，并接近slchip2。大肠杆菌(ecchip)、维斯假丝酵母(cvchip)和甘薯长喙壳菌(cfchip)的三个chip被分成三个绝对分区。ecchip与slchip2和cvchip相邻。cfchip接近于植物chip同源物和cechip(秀丽隐杆线虫同源物)的集群。有趣的是，甘薯长喙壳菌是甘薯黑斑病的病原体，秀丽隐杆线虫以细菌或其他微生物为食。
二、番茄泛素化e3连接酶基因slchip1和slchip2在高温中的应用
1、泛素化e3连接酶基因slchip1和slchip2基因沉默以及对热的敏感性
将slchip1基因和slchip2基因沉默突变，如图4a所示，黑色代表slchip1基因，灰色代表slchip2基因；浙杂89代表野生型，将野生型的相对表达量看做1，从图可以看出，slchip1基因的突变体的表达量降为约10％，而slchip2基因的突变体的表达量不到10％；表明slchip1和slchip2基因在植株中的沉默效率均高于80％，用于后续研究能够说明基因突变后对功能的影响。
这两个基因在沉默突变之后对热的敏感性是否受影响呢，将对照的番茄植株、slchip1突变基因的番茄植株和slchip2突变基因的番茄植株分别放置在22℃和45℃的环境下生长，从图4c可以看出，三种番茄植株在22℃时生长良好。在高温45℃时，对照的番茄变化不明显，而slchip1基因突变的番茄和slchip2基因突变的番茄都出现了不同程度的脱水现象，特别是slchip1基因突变的番茄的脱水萎蔫的程度更明显，如图4d。
高温条件下slchip1基因和slchip2基因表达是否受诱导，如图4b为0、3、6、9h时slchip1基因和slchip2基因的表达量的变化趋势，从图可以看出，当6h时slchip1基因的表达量高达7.4，而2h时slchip2基因的表达量为2.2，这就说明，slchip1基因和slchip2基因都受到高温的诱导，而slchip1基因受诱导程度远远高于slchip2，在热胁迫中起的作用远大slchip2基因。
2、基因沉默番茄植株中不可溶蛋白的变化
为什么这两个基因沉默后尤其是slchip1沉默的番茄更易受热胁迫呢？45℃高温下处理过的上述三种番茄植株，在0h、3h、6h、9h四个时间点进行取样，提取蛋白并用bca蛋白测定试剂盒测定不可溶蛋白浓度。研究表明这两个突变体中含有更多的不可溶蛋白，如图5a可知，随着受热时间的增加，野生型中的不可溶蛋白的变化并不明显，而slchip1沉默植株的不可溶蛋白含量大大提高；而图5b中的野生型中的不可溶蛋白的变化也不明显，相对的slchip2沉默植株中的不可溶蛋白含量发生了较小的变化。因此，这两个突变体进行对比，slchip1沉默的中的不可溶蛋白变化更加显著，这就是为什么在面对热胁迫时slchip1沉默的植株脱水现象最为明显。
3、高温胁迫下不可溶蛋白中泛素化蛋白含量与泛素化e3连接酶基因slchip1和slchip2的关系
那高温胁迫下不可溶蛋白中泛素化蛋白与slchip1基因和slchip2基因有没有关系呢。如图6所示，1代表对照植株，2代表slchip1沉默突变体，3代表slchip2沉默突变体，三者在高温下，随着时间的推移，可溶蛋白中泛素化的蛋白的量并没有发生太大变化，而不可溶蛋白中slchip1沉默植物不可溶蛋白中泛素化的蛋白的含量大大提高，而slchip2沉默突变体不可溶蛋白泛素化的蛋白的含量也有轻微的提高，但低于slchip1沉默突变体不可溶蛋白中泛素化蛋白的含量。这一结论说明虽然slchip1很可能通过泛素化降解高温胁迫下受损伤的蛋白，但植物体内还存在其它泛素化降解的途径，与slchip1共同保护植物减轻高温伤害。
4、slchip1和slchip2基因在不同激素途径中的表达
slchip1和slchip2基因在不同激素途径中的表达程度是不是一样？如果表达程度越高，表明基因在这个激素途径中参与度越高。如图7所示，图7a为slchip1和slchip2基因在水杨酸(sa)中的表达量，图7b为slchip1和slchip2基因在脱落酸(aba)中表达量，图7c为slchip1和slchip2基因在茉莉酸(ja)中表达量，d为拟介南在这三种激素(sa、aba、ja)中的表达量；图7a，slchip2基因在1h时表达量升高到2而后下降，而slchip1基因在6h时表达量达到3；说明在水杨酸中，slchip2基因起作用的时间早于slchip1基因。图7b，1h时slchip1基因的表达量高达8，而后下降，slchip2基因不受aba诱导；图7c，slchip1和slchip2基因均未受ja诱导；图7d，拟南芥在sa和ja中未受诱导，在aba中，1h时拟南芥的表达量增加，这也进一步印证了图7b中slchip1基因受aba诱导；而研究表明aba信号途径在植物抗非生物胁迫中起重要作用，则从另一个角度证明了slchip1基因在番茄抗高温中的重要功能。
5、番茄的slchip1转基因到拟南芥中在抗高温中所起的作用
将番茄的slchip1转基因到拟南芥的突变体中，如图8a，在常温和高温下，野生型的拟南芥变化不明显，而高温时拟南芥突变体几乎干枯，而转接因后的拟南芥突变体植株恢复了一些，状态好于突变体的状态，并且不可溶蛋白含量也发生相应的变化，这就进一步的验证了slchip1基因通过降低高温胁迫下受损伤蛋白的积累量保护番茄受高温损害。
三、讨论与展望
研究表明，泛素化e3连接酶在植物抗非生物胁迫中起作用，而番茄中atchip的同源基因还未被克隆，本研究找到了番茄中的两个同源基因slchip1与slchip2，并对其功能及作用机理进行初步探究。
通过同源序列比对，发现基因slchip1与slchip2的同源性仅达44.9％，暗示着这两个同源基因在番茄中可能行驶不同的功能；进化树分析发现，slchip1与slchip2在进化树上相隔甚远，且slchip1与atchip距离较近，slchip2与atchip很远。研究结果表明，atchip基因在拟南芥抗高温中起重要作用，推测番茄slchip1与slchip2基因也可能在番茄抗高温中有功能，slchip1更可能起抗高温胁迫的作用。
植物激素aba调控生长发育及多种非生物胁迫等过程，已有的研究揭示了不同作物中多种e3连接酶调控aba生物合成或aba信号传导途径成分而影响植物抗非生物胁迫。我们对野生型番茄和拟南芥进行激素处理，在外源aba激素诱导下，slchip1和atchip基因的相对表达量在1h分别迅速提高至8或2倍以上，至于提高表达的两者是否会进一步影响aba合成或其它aba信号通路成分，则有待于进一步研究，表明slchip1和atchip基因功能与aba信号通路相关。上述研究结果证实泛素e3连接酶与aba信号通路多种作用的关系，有趣的是，slchip1和slchip2还对sa激素信号有反应，它们可能在其它生理功能中发挥作用。
许多研究表明，高温胁迫导致细胞中蛋白变性积累，形成不可溶的蛋白聚集体，而泛素化之后的蛋白是不可溶蛋白的重要组成部分。本研究发现slchip1基因沉默植株在45℃高温处理后，基因沉默植株叶片萎蔫程度比野生型番茄严重，且处理9小时后细胞不可溶蛋白的量比0小时高出23％，而野生型植株9小时细胞不可溶蛋白量与0小时没有显著差别，说明slchip1基因在番茄抗高温中通过影响细胞不可溶蛋白含量起作用，且不可溶蛋白中泛素化蛋白的量也相应提高。
本研究克隆了两个番茄泛素e3连接酶slchip1和slchip2基因，证实了slchip1对于番茄抵抗高温有作用，该基因是否参与番茄对其他非生物胁迫如盐害等的抗性过程仍不清楚。此外，slchip1的泛素化功能及slchip2的生理功能也需要进一步研究。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
sequencelisting
<110>丽水学院
<120>一种番茄泛素化e3连接酶基因slchip1及应用和基因slchip2
<130>123456
<160>2
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>831
<212>dna
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1.一种番茄泛素化e3连接酶基因slchip1，其特征在于：所述番茄泛素化e3连接酶基因slchip1的核苷酸序列如下：
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2.如权利要求1所述的番茄泛素化e3连接酶基因slchip1，其特征在于：所述番茄泛素化e3连接酶基因slchip1在植物抗高温中的应用。
3.一种番茄泛素化e3连接酶基因slchip2，其特征在于：所述番茄泛素化e3连接酶基因slchip2的核苷酸序列如下：
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技术总结