本发明属于生物技术及基因工程领域，涉及一种邻苯二酚1,2-双加氧酶编码基因在合成4位取代顺，顺-粘康酸(4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸)中的应用，具体涉及一株表达邻苯二酚1,2-双加氧酶的重组菌及其全细胞催化合成4位取代顺，顺-粘康酸的方法。
背景技术：
粘康酸，又称己二烯二酸，可以用作树脂、医药、食品和农药的基础原料，被认为是一种很有价值的中间体，可用来生产如己二酸，对苯二甲酸这样的大宗化学品。这两种产品可以用来制造尼龙-66、工业塑料、聚酯合成纤维等。由于高分子主链具备一定的规整性，尼龙大多数呈现白色半透明外观，透明性不好限制了它在某些方面的使用，通过引入含侧基或环结构的单体，破坏分子链规整性，可得到透明尼龙。因此，开发能够高效催化合成含侧基的顺，顺-粘康酸的邻苯二酚1,2-双加氧酶(cata)具有重要的意义，其中底物含侧基的儿茶酚(如4-乙基儿茶酚和4-丙基儿茶酚)可从廉价、可再生的生物质资源中获得，从而使得工艺流程具有满足绿色工业的发展需求的潜能。
节杆菌主要存在于土壤和某些极端环境中，其对多种压力环境有显著的耐受性，能在复杂的环境中降解多种污染物，包括多种苯衍生物、多环芳香族化合物、硝化甘油等多种化合物。近年来，多株节杆菌基因组序列的获得，为节杆菌代谢机制的解析和功能基因的挖掘提供了研究基础。目前尚无利用节杆菌cata催化生产4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸方法的报道。大肠杆菌培养条件简单、周期短，利用高效表达节杆菌cata的大肠杆菌工程菌株，以4-乙基儿茶酚和4-丙基儿茶酚为原料全细胞催化合成相应的4位取代顺，顺-粘康酸，且全细胞催化无需酶的分离和提纯等操作，易于大规模生产，同时天然的细胞环境有利于保持酶的稳定性。此途径反应体系简单、条件温和、环境友好，在制备生物基透明尼龙产品方面，具有潜在的工业应用价值。
技术实现要素：
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种邻苯二酚1,2-双加氧酶的编码基因。
本发明还要解决的技术问题是提供含有上述邻苯二酚1,2-双加氧酶编码基因的重组载体。
本发明进一步要解决的技术问题是提供含有上述重组载体的重组菌。
本发明进一步要解决的技术问题是提供上述重组菌在表达邻苯二酚1,2-双加氧酶中的应用。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组菌在合成4位取代顺，顺-粘康酸中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种邻苯二酚1,2-双加氧酶(cata)编码基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示；其氨基酸序列如seqidno.2所示。
其中，该cata编码基因长度为885bp，编码294个氨基酸和1个终止密码子，编码的cata以含侧基的儿茶酚(如4-乙基儿茶酚和4-丙基儿茶酚)为底物合成相应4位取代顺，顺-粘康酸。所述cata编码基因来自于节杆菌arthrobactersp.cgmcc3584，该菌株已公开于中国发明专利申请201010191515.6中。
含有上述邻苯二酚1,2-双加氧酶编码基因的重组载体也在本发明的保护范围之内；其中，所述的重组载体为融合表达载体。
优选地，所述重组载体的出发载体为pet28a。
上述重组载体的制备方法为：利用一步克隆法将cata编码基因片段插入出发载体pet28a的ndei和ecori酶切位点之间得到重组载体pet28a-arcata，其核苷酸序列如seqidno.3所示。
含有上述重组载体的重组菌也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述重组菌的宿主菌为escherichiacolibl21(de3)。
上述重组菌的构建方法包括如下步骤：将重组载体pet28a-arcata通过热击法转化至e.colibl21(de3)中，即得重组菌。
上述重组菌在表达邻苯二酚1,2-双加氧酶中的应用也在本发明的保护范围之内。
其中，所述的应用包括如下步骤：
(i)将重组菌活化后得到的种子液接种到培养基中，培养至od600nm为0.6-0.8时，加入iptg，iptg的终浓度为0.05-1.0mm(优选0.2mm)，诱导表达后，离心收集菌泥；
(ii)将上述收集的菌泥用100mmtris-hcl(ph8.0)清洗两遍，然后加入10ml的100mmtris-hcl(ph8.0)重悬，超声破碎，离心得到的上清即为粗酶液。
上述重组菌在合成4位取代顺，顺-粘康酸中的应用也在本发明的保护范围之内；其中，所述的4位取代顺，顺-粘康酸优选为4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸。
其中，所述的应用包括如下步骤：
(1)将重组菌活化后得到的种子液接种到培养基中，培养至od600nm为0.6-0.8时，加入iptg，iptg的终浓度为0.05-1.0mm(优选0.2mm)，诱导表达后，离心收集菌泥；
(2)全细胞催化：向tris-hcl缓冲液中添加4位取代儿茶酚和步骤(1)得到的菌泥，建立全细胞催化反应体系，进行全细胞催化反应，生成4位取代顺，顺-粘康酸；
或进行酶催化，即将步骤(1)得到的菌泥进行超声破碎，离心，得到含邻苯二酚1,2-双加氧酶的粗酶液；向tris-hcl缓冲液中添加粗酶液和4位取代儿茶酚，建立酶催化反应体系，进行酶催化反应，生成相应4位取代顺，顺-粘康酸。
步骤(1)中，重组菌活化后得到的种子液的制备方法为将重组菌接种到至含有50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，即得。
步骤(1)中，将重组菌种子液按照1％的体积比接种到lb液体培养基中。
步骤(1)中，所述的诱导表达为在20℃，150rpm诱导表达2-10h(优选8h)。
步骤(2)中，所述的tris-hcl缓冲液中tris-hcl的浓度为50-100mm；4位取代儿茶酚的终浓度为10-90mm。
步骤(2)中，所述的全细胞催化反应体系中，菌泥的终浓度为5-20g/l；所述的酶催化反应体系中，粗酶液的终用量为0.1-1u/ml。
优选地，所述的tris-hcl缓冲液中tris-hcl的浓度为100mm；4位取代儿茶酚的浓度为10mm；菌泥的用量为10g/l；粗酶液的终用量为0.262u/ml。
其中，所述的4位取代儿茶酚优选为4-乙基儿茶酚和4-丙基儿茶酚。
步骤(2)中，粗酶液的制备方法具体为将步骤(1)得到的菌泥用100mmtris-hcl清洗后，再重悬于10ml的100mmtris-hcl中，超声破碎后，离心，所得上清液即为粗酶液；其中，每200ml种子液处理后，离心得到的菌泥，重悬于10ml的100mmtris-hcl中。
酶活定义如下：在30℃下每分钟转化1微摩尔底物儿茶酚所需的酶量定义为一个酶活单位u。
步骤(2)中，所述的全细胞催化反应和酶催化反应均为在ph6.0-10.0，20-45℃反应1-9h；优选地，所述的全细胞催化反应和酶催化反应均为在ph8.0，30℃下反应9h。
更优选地，所述的重组菌在合成4位取代顺，顺-粘康酸中的应用为分批补料的方式，具体的，反应体系(20ml)及反应条件如下：100mm的tris-hcl(ph8.0)，10g/l反应液的菌泥，4位取代儿茶酚底物的初始浓度为10mm，之后每隔1h加入50μl浓度为4m的4位取代儿茶酚母液，并且每隔0.5h用2m的naoh溶液将反应体系ph调至8.0，30℃反应9h。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)本发明首次扩增了节杆菌(arthrobactersp.cgmcc3584)中的cata编码基因，并实现了cata编码基因在e.colibl21(de3)中的高效表达；iptg诱导表达重组大肠杆菌，所得cata作为单一酶，利用重组大肠杆菌分批补料策略全细胞催化4位取代儿茶酚生成相应的4位取代顺，顺-粘康酸。利用分批补料策略，通过不断补加反应底物4位取代儿茶酚的浓度，能够进一步提高4位取代顺，顺-粘康酸的产量，具有成本低，污染低等优点。
(2)与其他来源的重组邻苯二酚1,2-双加氧酶相比，本发明中节杆菌(arthrobactersp.cgmcc3584)中的cata编码基因在制备4位取代顺，顺-粘康酸产量更高。
附图说明
图1为pet28a-arcata质粒图谱；
图2为pet28a-arcata质粒电泳图，其中泳道m为10,000bpmarker，泳道1为重组质粒；
图3为重组菌提取质粒验证的电泳结果，其中泳道m为10,000bpmarker，泳道1、2、3分别为转化子1-3的重组质粒；
图4为在不同iptg浓度下诱导表达cata后，破碎细胞上清蛋白电泳结果，其中泳道m为200.0kda标准蛋白marker，泳道1为不加iptg诱导的e.colibl21(de3)(pet28a-arcata)上清空白对照，泳道2、3、4、5、6、7分别为0.05mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1.0mmiptg浓度下诱导的e.colibl21(de3)(pet28a-arcata)上清蛋白电泳结果；
图5为在不同诱导时间下诱导表达cata后，破碎细胞上清蛋白电泳结果，其中泳道m为200kda标准蛋白marker，泳道6为诱导0h的e.colibl21(de3)(pet28a-arcata)上清空白对照，泳道1、2、3、4、5分别为诱导10h、8h、6h、4h、2h的e.colibl21(de3)(pet28a-arcata)上清蛋白电泳结果；
图6为产物4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸的质谱分析结果图；
图7为利用分批补料策略全细胞催化合成4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸的结果图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1节杆菌中cata基因的克隆及重组载体的构建
cata编码基因来自节杆菌(arthrobactersp.cgmccno.3584)，该菌株已公开于中国发明专利申请201010191515.6中。以上述的节杆菌基因组为模板，pcr扩增cata基因。
引物序列如下：
上游引物：
5’-tgccgcgcggcagccatatgactgagacccaagtggatatc-3’(含ndei酶切位点，见横线部分)
下游引物：
5’-ttgtcgacggagctcgaattcctacttggtctcgccttcctt-3’(含ecori酶切位点，见横线部分)
pcr反应体系及反应条件见表1。
表1cata基因的pcr反应体系及反应条件
将载体pet28a进行线性酶切，酶切体系及反应条件见表2。
表2载体pet28a的酶切体系及反应条件
利用clonexpresstmⅱ重组反应体系(clonexpressiionestepcloningkit；cat:c112-01/02)进行一步克隆得到重组载体pet28a-arcata的连接液。待一步克隆反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min，然后将该连接产物转化e.colidh5α感受态细胞(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)，涂布于带有卡那霉素抗性的lb琼脂平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落，在lb液体培养基中过夜培养，质粒dna小量提取试剂盒(购自axyprep公司，cat:ap-mn-p-250g)提取质粒，测序结果正确后可获得阳性重组载体。构建的重组载体质粒pet28a-arcata的图谱如图1所示，质粒电泳结果如图2所示。
其中，含卡那霉素抗性的lb琼脂平板的配方如下：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，琼脂15-20g/l，卡那霉素50mg/l。
lb液体培养基的配方如下：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l。
实施例2重组大肠杆菌bl21(de3)(pet28a-arcata)的构建
将构建好的重组质粒pet28a-arcata通过热击法转化至e.colibl21(de3)(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)，具体操作如下：取9μl的重组质粒(实施例1得到)，加入到100μl的e.colibl21(de3)感受态细胞液中，冰上放置30min，42℃热击90s，立即取出放冰上2min。加入900μl的lb液体培养基，37℃，200rpm，培养40min后，取200μl培养液涂布于含卡那霉素的lb固体培养基中，37℃培养12h后所得的单菌落即为重组菌e.colibl21(de3)(pet28a-arcata)。挑取单菌落，在lb液体培养基中过夜培养，用质粒dna小量提取试剂盒(购自axyprep公司,cat:ap-mn-p-250g)提取转化子质粒，凝胶电泳验证获得阳性重组大肠杆菌，电泳结果如图3所示。
实施例3重组cata蛋白的表达条件优化
1、诱导剂iptg浓度对重组cata蛋白表达的影响
将实施例2构建的重组菌e.colibl21(de3)(pet28a-arcata)接种至含有50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，然后按1％(v/v)的接种量接种到含200mllb培养基的500ml三角瓶中，待od600nm达到0.6-0.8时，以不加iptg诱导作为空白对照，分别加入终浓度为0.05-1.0mm的iptg(选取终浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mm的iptg浓度梯度)诱导，20℃，150rpm诱导6h。诱导结束后4℃，8000rpm离心10min收集菌泥，-20℃保存备用。
将上述收集的菌泥用100mmtris-hcl(ph8.0)清洗两遍，然后加入10ml的100mmtris-hcl(ph8.0)重悬，超声破碎(200w，超3s，停7s，共10min)。离心得到的上清即为粗酶液，粗酶液的蛋白电泳结果如图4所示，蛋白大小约为34.9kda。由图4可知，本发明提供的诱导重组cata蛋白表达最适itpg浓度为0.2mm。
2、诱导时间对重组cata蛋白表达的影响
当菌体密度od600为0.6-0.8时，在对数生长前期加入0.2mm的iptg诱导剂，以不加iptg诱导作为空白对照，分别在20℃下培养2h、4h、6h、8h、10h，菌泥破碎得粗酶液，蛋白电泳结果如图5所示。由图5可知，加入0.2mmiptg诱导剂，诱导后的8h内，蛋白的表达水平一直在增加，当诱导时间达到了10h，蛋白的表达水平有所下降。本发明提供的诱导重组cata蛋白表达最适诱导时间为8h。
实施例4粗酶酶活的测定
酶促反应体系(1ml)及反应条件如下：100mm的tris-hcl(ph8.0)，100μl粗酶液，浓度为10mm的儿茶酚底物，催化条件为ph8.0，30℃，反应1h，95℃加热10min灭酶，离心，上清液过膜。采用uplc检测产物粘康酸的含量，具体为acquityuplcbehc18色谱柱，150mm×2.1mm流动相：5mm醋酸钠:甲醇＝88:12(ph3.2)；紫外检测器，波长265nm，柱温30℃，流速1ml/min，进样量20μl。
酶活定义如下：在30℃下每分钟转化1微摩尔底物儿茶酚所需的酶量定义为一个酶活单位u。经检测，cata粗酶酶活为2.62u/ml。
对比例1
作为本发明申请重组cata的对照，将来源于pseudomonasputidakt2440的cata基因cata-i按实施例1的方法克隆到pet28a载体上，按实施例2的方法将重组质粒导入e.colibl21(de3)感受态，按实施例3的方法诱导表达获得粗酶液。通过实施例4的酶反应体系测定粗酶活，经检测来源于p.putida的cata粗酶活为1.56u/ml。
实施例5质谱分析催化产物4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸
分别以4-乙基儿茶酚和4-丙基儿茶酚为底物，其他酶促反应条件如实施例4，反应1h后，放入95℃水浴锅中加热10min停止反应，于室温8000rpm离心5min后取上清进行分析。按实施例4中uplc条件检测产物4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸的浓度分别为1.48和1.27g/l。同时，质谱图初步验证催化反液中分别含有产物4-乙基粘康酸(ms-：168.9698)和4-丙基粘康酸(ms-：183.0070)，4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸的分子量分别为170.19和184.19g/mol(图6)。
对比例2
作为对照，将对比例1构建的重组大肠杆菌通过实施例3中的方法获得粗酶液1ml，按照实施例5相同的催化反应体催化生成4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸，经检测催化液中产物4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸的浓度分别为0.92和0.76g/l。
实施例6利用分批补料策略全细胞催化合成4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸
利用分批补料策略全细胞催化合成4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸反应体系(20ml)及反应条件如下：100mm的tris-hcl(ph8.0)，10g/l反应液的菌泥，4位取代儿茶酚底物的初始浓度为10mm，之后每隔1h加入50μl浓度为4m的4位取代儿茶酚母液，并且每隔0.5h用2m的naoh溶液将反应体系ph调至8.0，30℃反应9h。催化结果如图7所示，e.colibl21(de3)(pet28a-arcata)产4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸的浓度分别达到7.35g/l和5.27g/l。说明利用分批补料策略，通过不断补加反应底物的浓度，能够进一步提高4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸的产量；
本实施例中所述的4位取代儿茶酚分别为4-乙基儿茶酚和4-丙基儿茶酚，其得到的产物分别为4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸。
序列表
<110>南京工业大学
<120>一种邻苯二酚1,2-双加氧酶基因及其在在合成4位取代顺，顺-粘康酸中的应用
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>885
<212>dna
<213>邻苯二酚1,2-双加氧酶(cata)
<400>1
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gaacgcgtgagcctgctggccggcgcgctcatcaaggccgcgaatgacatcgtcgttgag180
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tcccaggagcgccccggcaccaagggcaccatcgagggcccctactacgtgccagggtca360
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cgcttcaccggccagttcacggacaccaacggcagcgccctccagaacgcccaggtggaa480
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<213>邻苯二酚1,2-双加氧酶(cata)
<400>2
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leusergluleuasnvalprolysgluargvalserleuleualagly
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<213>重组载体(pet28a-arcata)
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cgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccgg6180
cgtagaggatcgagatctcgatcccgcgaaat6212
1.一种邻苯二酚1,2-双加氧酶编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如seqidno.1所示。
2.含有权利要求1所述邻苯二酚1,2-双加氧酶编码基因的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的出发载体为pet28a。
4.含有权利要求2或3所述重组载体的重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主菌为大肠杆菌bl21(de3)。
6.权利要求5所述的重组菌在表达邻苯二酚1,2-双加氧酶中的应用。
7.权利要求5所述重组菌在合成4位取代顺，顺-粘康酸中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将重组菌种子液接种到培养基中，培养至od600nm为0.6-0.8时，加入iptg，诱导表达后，离心收集菌泥；
(2)全细胞催化：向tris-hcl缓冲液中添加4位取代儿茶酚和步骤(1)得到的菌泥，建立全细胞催化反应体系，进行全细胞催化反应，生成4位取代顺，顺-粘康酸；
或酶催化：将步骤(1)得到的菌泥进行超声破碎，离心，得到含邻苯二酚1,2-双加氧酶的粗酶液；向tris-hcl缓冲液中添加粗酶液和4位取代儿茶酚，建立酶催化反应体系，进行酶催化反应，生成相应4位取代顺，顺-粘康酸。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述的tris-hcl缓冲液中tris-hcl的终浓度为50-100mm；4位取代儿茶酚的终浓度为10-90mm；
其中，所述的全细胞催化反应体系中，菌泥的终浓度为5-20g/l；所述的酶催化反应体系中，粗酶液的终用量为0.1-1u/ml。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述的全细胞催化反应和酶催化反应均为在ph6.0-10.0，20-45℃反应1-9h。
技术总结