本发明涉及一种果胶酸裂解酶的基因序列及其制备方法和应用。本发明提供了该果胶酸裂解酶的重组质粒和重组基因工程菌株及其在多糖降解方面的应用。本发明提供的果胶酸裂解酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及寡糖制备等领域。
背景技术：
果胶(pectin)是植物细胞壁中结构和功能最为复杂的多糖，广泛存在于自然界中；果胶以果胶，果胶酸，原果胶三种形态分布在植物的软组织细胞壁，细胞间层，细胞与次生壁连接区等；果胶多糖是一种高分子化合物，平均分子量介于20000～400000之间。果胶多糖的结构十分复杂，主要包括同聚半乳糖醛酸(homogalacturonan，hg)，约占果胶的65％；鼠李糖半乳糖醛酸聚糖i(rhamnogalacturonan-i，rg-i)，约占果胶的20％～35％；鼠李糖半乳糖醛酸聚糖ii(rhamnogalacturonan-ii，rg-ii)三部分，约占果胶的10％。果胶的主要结构是半乳糖醛酸在α-1,4糖苷键的作用下线性聚合而成，是果胶的hg部分，也就是聚半乳糖醛酸(pga)。根据果胶酯化度的大小将果胶分为低甲氧基果胶(lm)与高甲氧基果胶(hm)；低酯果胶根据是否酰胺化又可分为普通低酯果胶和酰胺化低酯果胶，根据果胶的凝结速率将高酯果胶分为快凝果胶，中凝果胶，慢凝果胶，三者之间的区别在于其酯化程度，分别为高于70％，介于65％～70％之间，低于65％。
果胶寡糖又称寡聚半乳糖醛酸，是由果胶多糖降解而成的一种酸性寡糖。寡聚半乳糖醛酸不仅具有普通寡糖的生物功效，如抑制病原菌、增强机体的免疫功能，改善脂类代谢，改善动物肠道与胃中的微生物区系，降低血清中胆固醇含量，改善动物生产性能，防止便秘、腹湾，降低血压等，还可激活植物的自卫系统，对植物起到抗病、防病和提高生长速度等功效。由果胶降解得到的寡聚半乳糖酸酸已经被证实在植物中有一系列的生物活性，如能够诱导植物抗病性防御反应，调节植物生长发育及细胞表面的快速反应。在大肠和结肠中，微生物降解果胶寡糖释放出对健康产生积极影响的短链脂肪酸(益生元效应)。
果胶的基本组成单位是半乳糖醛酸，而果胶在自然界分布广泛，丰富的原料来源是酶解果胶生产寡聚半乳糖醛酸的最显著优势。目前制备寡聚半乳糖醛酸的方法大多是用果胶酶来水解果胶或果胶酸，得到不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸的混合物。酶法制备寡聚半乳糖醛酸具有反应重复性好、条件温和、产物分离纯化过程简单、所得到的寡聚半乳糖醛酸品质优良等特点。同时利用酶解果胶多糖的方法获得，酶的反应效率高，方法简单、易控制，后期分离也容易，且酶作为一种生物制剂，不会带来化学试剂产生的不利因素。所以利用酶解果胶多糖的方法生产寡聚半乳糖醛酸是一条相对简单，容易研究的生产方法。
果胶酸裂解酶(pectatelyase,pel)又叫聚半乳糖醛酸裂解酶(polygalacturonaselyase,pgl),它是通过反式消去作用裂解果胶多糖的同聚半乳糖醛酸(hg)部分的结构，断裂半乳糖醛酸的α-1,4糖苷键，在c-4位置上断开糖苷键，同时从c-5处消去一个h原子从而形成一个不饱和双键，生成不同聚合度的半乳糖醛酸寡糖。在果胶酸裂解酶在果汁澄清、果实软化和成熟、生物精炼和生产果胶寡糖等方面的研究比较少。传统酶制剂的生产技术主要是通过微生物的初级发酵产品来生产商品，需要通过各种理化因素的改变或对菌种进行突变，但往往提高产量的幅度有限。目前已报道的果胶酸裂解酶对果胶多糖的降解活性均较弱，不适于大规模应用。因此，寻找一种能够高效、稳定降解果胶多糖的果胶酸裂解酶是获得果胶寡糖的有效途径。而由于果胶酸裂解酶在生物体内的含量非常少，借助基因水平进行高量表达和表征是提高果胶酸裂解酶产量的一种最有效措施。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明利用基因工程的方法，通过基因克隆技术获得产果胶酸裂解酶的结构基因，并将其转入表达菌体中，获得能高效表达的高产菌株。具体而言，本发明的第一个目的是提供一种新型的来源于寄生曲霉(aspergillusparasiticus)的果胶酸裂解酶appel及其编码基因。
本发明的第二个目的是提供一种制备新型果胶酸裂解酶appel的方法。
本发明的第三个目的是提供含有所述的果胶酸裂解酶appel基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。
本发明的第四个目的是提供一种新型果胶酸裂解酶appel在果胶多糖降解中的应用。
本发明所提供的果胶酸裂解酶appel，来源于土壤中分离纯化的寄生曲霉(aspergillusparasiticus)，从中扩增出的果胶酸裂解酶appel编码基因(命名为appel)，具有下述核苷酸序列特征中的一种或二种以上：
1)具有序列表中seqidno.1的第1-1065位的脱氧核糖核酸(dna)序列；
2)序列表中seqidno.1的脱氧核糖核酸(dna)序列；本发明的果胶酸裂解酶appel的基因序列是通过pcr技术从寄生曲霉(aspergillusparasiticus)中克隆得到。该基因编码区长1086bp，属于多糖裂解酶的pl1(polysaccharidelyase1family)家族。其中从第1-1065位为编码具有果胶酸裂解酶appel活性的脱氧核糖核酸(dna)序列，1066-1086位为酶切位点、his-tag和终止密码子的脱氧核糖核酸(dna)序列；
3)编码序列表中seqidno.2的第1-355位氨基酸序列的脱氧核糖核酸(dna)序列；
4)编码序列表中seqidno.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(dna)序列；
5)对序列表中seqidno.1的第1-1065位的脱氧核糖核酸(dna)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有果胶酸裂解酶活性的核苷酸序列；
6)对序列表中seqidno.1的脱氧核糖核酸(dna)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有果胶酸裂解酶活性的核苷酸序列；
7)与序列表中seqidno.1的第1-1065位限定的脱氧核糖核酸(dna)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解果胶多糖和聚半乳糖醛酸的蛋白质的脱氧核糖核酸(dna)序列。
8)与序列表中seqidno.1限定的脱氧核糖核酸(dna)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解果胶多糖和聚半乳糖醛酸的蛋白质的脱氧核糖核酸(dna)序列。
本发明还提供了果胶酸裂解酶appel的氨基酸序列，具有如下特征中的一种或二种以上：
1)序列表中seqidno.2从氨基端开始的第1-355位氨基酸残基序列；
2)序列表中的seqidno.2从氨基端开始的第1-361位氨基酸残基序列，其中：1-355位为具有果胶酸裂解酶appel活性的氨基酸序列，356-361位为酶切位点及his-tag的氨基酸序列；
3)对序列表中seqidno.2的第1-355位氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有果胶酸裂解酶活性的氨基酸序列。
4)对序列表中seqidno.2所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有果胶酸裂解酶活性的氨基酸序列。
本发明的果胶酸裂解酶appel的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的果胶酸裂解酶appel的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。
与本文所公开的序列相似或同源(例如至少约70％序列同一性)的序列也是本发明的组成部分。在某些实施方案中，氨基酸水平上的序列同一性可以约为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上。在核酸水平上，序列同一性可以约为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上。
“基本相同(或“基本同源”)”，第一氨基酸或核苷酸序列与第二氨基酸或核苷酸序列含有足够数量的相同或等同(例如具有相似侧链，例如保守氨基酸取代)氨基酸残基或核苷酸，以使第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似活性。
制备重组酶appel的方法，是将上文所述技术方案中的果胶酸裂解酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的果胶酸裂解酶。
所述的重组表达果胶酸裂解酶appel的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。具体的，在本发明实施例中使用的表达载体是真核表达载体ppiczαa。
用于重组表达果胶酸裂解酶appel的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如escherichiacolibl21、escherichiacolijm109、escherichiacolidh5α等)、酵母菌宿主细胞(如saccharomycescerevisiae、pichiapastoris、kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如bacillussubtilisr25、bacillussubtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如lacticacidbacteriacocc101等)、放线菌宿主细胞(如streptomycesspp.等)、丝状真菌宿主细胞(如trichodermaviride、trichodermareesei、aspergillusniger、aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如bombyxmori、antharaeaeucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞cho、幼小仓鼠肾脏细胞bhk、中国仓鼠肺细胞chl等)。
本发明提供的果胶裂解酶在降解果胶多糖、聚半乳糖醛酸或降解含有半乳糖醛酸聚糖连接的底物中的应用。具体的，对于上文所述本发明提供的果胶裂解酶的应用，包括以下应用中的一种或二种：
1)在断裂果胶多糖的糖苷键，获得单糖或半乳糖醛酸寡糖中的应用；
2)在断裂聚半乳糖醛酸的糖苷键，获得单糖或半乳糖醛酸中的应用；
3)与其他酶混合后，在协同断裂果胶多糖糖苷键方面的应用。
本发明从毕赤酵母重组表达获得的果胶酸裂解酶appel，可以高效降解果胶多糖，以果胶多糖为底物时，在40℃、ph7-9的条件下具有较好活性。
本发明的果胶酸裂解酶appel可广泛应用于农业、工业、食品、饲料添加、医药及果胶寡糖的制备等领域。
附图说明
图1：果胶酸裂解酶基因appel琼脂糖凝胶电泳检测。m:核酸标准；泳道1-appel扩增产物。
图2：果胶酸裂解酶appel表达及纯化的sds-page图。各泳道加入的样品分别是：m:蛋白分子量标准，泳道1-appel上柱三次流穿液，泳道2-20mm咪唑洗脱流穿液，泳道3-60mm咪唑洗脱流穿液，泳道4-80mm咪唑洗脱流穿液，泳道5-100mm咪唑洗脱流穿液，泳道6-200mm咪唑洗脱流穿液，泳道7-250mm咪唑洗脱流穿液，泳道8-500mm咪唑洗脱流穿液。
图3：果胶酸裂解酶appel对果胶多糖和聚半乳糖醛酸降解产物的hpaec-pad分析图谱。
图4：果胶酸裂解酶appel对果胶降粘度的滴定时间图(对照一：加入商品化果胶酶的果胶降解产物；对照二：未加果胶酶的果胶；加入果胶酸裂解酶appel的果胶降解产物)。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
seqidno.1的信息：核苷酸序列，长度：1086bp；链型：单链。
seqidno.2的信息：氨基酸序列，长度：361；链型：单链。
实施例1果胶酸裂解酶appel全长基因克隆
参照柱式真菌总rna抽提纯化试剂盒(上海生工)操作步骤提取寄生曲霉总rna并参照revertaidfriststrandcdnasynthesiskit(thermoscientific)操作步骤合成第一链cdna。对thenationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)数据库中果胶酸裂解酶基因序列进行多序列比对分析后，设计简并引物：
appel-f:5’-cagtctcgagaaaagacagaaagtctctggtgcc-3’；
appel-r:5’-atcttctagagatcttgcccgcaccagcattc-3’，
以寄生曲霉的第一链cdna为模板，扩增编码果胶酸裂解酶蛋白的基因序列(不包括信号肽基因)。pcr反应条件为：98℃3min，1个循环；98℃10s，55℃15s，72℃2min，35个循环；72℃5min，1个循环。pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后(见图1)，对目的基因进行切胶回收，经双酶切的方法连接到真核表达载体ppiczαa上，在大肠杆菌top10中扩增后，提取质粒测序。
实施例2果胶酸裂解酶基因序列分析
测序结果采用genbank数据库中的basiclocalalignmentsearchtool(blast)分析，dnaman软件进行多序列比对，vectornti分析序列信息。
获得的果胶酸裂解酶基因(命名为appel)编码区长1086bp，其核苷酸序列如seqidno1所示。appel编码361个氨基酸和一个终止密码子，其氨基酸序列如seqidno2所示，蛋白质理论分子量为38.10kda，预测等电点为8.90。appel编码的氨基酸具有果胶酸裂解酶中心结构域，此表明appel为多糖裂解酶家族的一名成员。
实施例3果胶酸裂解酶appel在毕赤酵母中异源表达及纯化
果胶酸裂解酶appel按毕赤酵母表达手册方法进行诱导表达。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测果胶酸裂解酶appel的表达及纯化情况，结果如图2所示，纯化后的果胶酸裂解酶appel在电泳胶上呈单一条带，且位置(约38kda)与预测的分子量(38.10kda)相吻合。
实施例4果胶酸裂解酶appel的活性测定
以450μl0.5％(w/v)的果胶多糖为底物，加入50μl重组酶appel，反应30min，采用3,5-二硝基水杨酸(dns)法测定其活性。酶活力单位定义为:每分钟释放1μmol还原糖(以半乳糖醛酸计)所需的酶量为一个酶活力单位(u)。蛋白浓度使用碧云天bca蛋白浓度测定试剂盒进行测定。
实施例5重组酶appel降解果胶和聚半乳糖醛酸产物分析
将0.5％(w/v)果胶多糖/聚半乳糖醛酸与重组酶appel按9:1(体积比)的比例混合后，在40℃条件下反应24h，通过sevage法除蛋白后，对其产物进行hpaec-pad和esi-ms分析。如图3所示，appel对果胶多糖和聚半乳糖醛酸的降解可以生成dp＝1-15的多种聚合度的低聚糖混合物，通过观察生成的不同聚合度寡糖产物的峰面积，发现appel对聚半乳糖醛酸的降解能力显著高于果胶，且对不同公司生产的聚半乳糖醛酸的降解能力有一定的差异性工。因此，appel可用于果胶寡糖的制备以及与果胶多糖降解相关方面的研究，包括农业、工业、食品、饲料添加、医药及果胶寡糖制备等领域。
实施例6果胶酸裂解酶appel酶解产物的降粘度分析
对照一：以1ml0.5％(w/v)的柑橘低酯为底物，加入商品化果胶酶(其它实验室生产赠送)10ul(1mg/ml)和90ul超纯水，40℃摇床300转震荡反应8h；对照二：以1ml0.5％(w/v)的柑橘低酯为底物，加入100ul超纯水，40℃摇床300转震荡反应8h；pl1:以1ml0.5％(w/v)的柑橘低酯为底物，加入100μl重组酶appel(0.4mg/ml)，40℃摇床300转震荡反应8h。反应结束后，煮沸10min，使酶失活，冷却离心后取上清液测粘度。果胶酸裂解酶appel对果胶降粘度的滴定时间如图4所示,果胶酸裂解酶appel的粘度滴定时间最短，显著低于对照一和对照二，说明果胶酸裂解酶appel对果胶有显著降粘度的效果。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110>中国科学院大连化学物理研究所
<120>一种果胶酸裂解酶编码基因及酶和制备与应用
<130>2013
<160>2
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>1086
<212>dna
<213>核苷酸序列
<400>1
cagaaagtctctggtgccgcccaaggtttcgcttctggcgtgacgggtggtggtaacgct60
tcacctcagaccccgaaggatatcaacgaactcaagaaattgctcgccgatccctcccct120
cgtgtgattgtccttgacaagttgtacgactacaccggaacggagggcacctcgaaggga180
acggtctgtgccaactggggtgaaggtgcaaaatgccagaagatcatccaggatgactgc240
ggaagcgccgccaaatccactggaacctgggacactgctgccaagaccccaatcgatgtc300
gcctcacacaagaccatcatcggtgttggtaacaagggtatcatcaagggcaagggcttg360
agattccgcggtggtgctaccaacattattgtccagaacatccagattaccgacctgaac420
ccccagtacgtgtggggtggtgatgccatctcttttgatggcgctgatctgatctgggtt480
gaccacgttactactgctcgtatcggacgtcagcactacgttttcggcttcaacaccagc540
aagcgtgtgactctttccaacaacttcatcaacggcgacagccctttctctgccggatgc600
aacggataccactactggaccttcgagatggttggcaagggagaccagatcacccttcag660
aacaaccacatttaccacacctctggccgtagtcctgccctgagcggcggtaccctcctg720
catgcagtgaacaacgtctgggacggcaacactggccacgcccttgagggaggcgaggcc780
actgccaatggtatcttcgagggtaacgttttcaccgatgtcaaggccattgtcgccgac840
ttcaagggcaaggctttcttctcccccgatgccaattccaacaagcagtgcagctccgcc900
cttggccgagcctgcgaagtcaatgttcttaccaagtccggtactcttccccctctcaag960
gatacctccttcttcggtgacttcaagggcctcaagattgcccctgctactccggcttct1020
caggccgcggttaacgtccccaagaatgctggtgcgggcaagatccatcatcatcatcat1080
cattga1086
<210>2
<211>361
<212>protein
<213>氨基酸序列
<400>2
qkvsgaaqgfasgvtgggnaapqtpkdinelkklladpsprvivldklydytgtegtskg60
tvcanwgegakcqkiiqddcgsaakstgtwdtaaktpidvashktiigvgnkgiikgkgl120
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lgracevnvltksgtlpplkdtsffgdfkglkiapatpasqaavnvpknagagkihhhhh360
h361
1.一种果胶酸裂解酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：
1)具有序列表中seqidno.1的第1-1065位的脱氧核糖核酸(dna)序列；
2)具有序列表中seqidno.1的脱氧核糖核酸(dna)序列；
3)编码序列表中seqidno.2的第1-355位氨基酸序列的脱氧核糖核酸(dna)序列；
4)编码序列表中seqidno.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(dna)序列；
5)对序列表中seqidno.1的第1-1065位的脱氧核糖核酸(dna)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有果胶酸裂解酶活性的核苷酸序列；
6)对序列表中seqidno.1的脱氧核糖核酸(dna)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有果胶酸裂解酶活性的核苷酸序列；
7)与序列表中seqidno.1的第1-1065位限定的脱氧核糖核酸(dna)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解果胶多糖和聚半乳糖醛酸的蛋白质的脱氧核糖核酸(dna)序列。
8)与序列表中seqidno.1限定的脱氧核糖核酸(dna)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解果胶多糖和聚半乳糖醛酸的蛋白质的脱氧核糖核酸(dna)序列。
2.一种权利要求1所述的果胶裂解酶基因编码的果胶裂解酶，其特征在于：其氨基酸序列具有如下特征中的一种或二种：
1)序列表中seqidno.2从氨基端开始的第1-355位氨基酸残基序列；
2)序列表中seqidno.2氨基酸残基序列；
3)对序列表中seqidno.2的第1-355位氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有果胶酸裂解酶活性的氨基酸序列；
4)对序列表中seqidno.2所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有果胶酸裂解酶活性的氨基酸序列。
3.一种权利要求2所述的果胶酸裂解酶的制备方法，其特征在于：将如权利要求1所述的果胶酸裂解酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的果胶酸裂解酶。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的重组表达载体选自，大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞，即用于重组表达果胶酸裂解酶的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞，哺乳动物细胞中的一种。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞选自，escherichiacolibl21、escherichiacolijm109、escherichiacolidh5α、saccharomycescerevisiae、pichiapastoris、kluyveromyceslactis、bacillussubtilisr25、bacillussubtilis9920、lacticacidbacteriacocc101、streptomycesspp.、trichodermaviride、trichodermareesei、aspergillusniger、aspergillusnidulans、bombyxmori、antharaeaeucalypti、中国仓鼠卵巢细胞cho、幼小仓鼠肾脏细胞bhk或中国仓鼠肺细胞chl。
7.如权利要求2所述的果胶裂解酶在降解果胶多糖、聚半乳糖醛酸或降解含有半乳糖醛酸聚糖连接的底物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：包括以下应用中的一种或二种：
1)在断裂果胶多糖的糖苷键，获得单糖或半乳糖醛酸寡糖中的应用；
2)在断裂聚半乳糖醛酸的糖苷键，获得单糖或半乳糖醛酸中的应用；
3)与其他酶混合后，在协同断裂果胶多糖糖苷键方面的应用。
技术总结