本发明属于嵌合抗原受体领域，具体涉及靶向cd22的嵌合抗原受体及其用途。
背景技术：
cd22是分子量为135kd的b细胞限制性跨膜唾液酸糖蛋白，表达于前b细胞的胞浆内、成熟正常b细胞和91％到99％的侵袭性和顽性b细胞群的表面，其主要功能为:①作为亲合素特异性结合含有α-2,6-硅酸糖蛋白，介导同型或异型细胞亲合作用；②通过b细胞受体复合物作为共受体调节信号。cd22作为nhl导向治疗靶分子的特点为：①只选择性表达于正常和恶性的成熟b淋巴细胞系，非b淋巴细胞、骨髓细胞、造血干细胞和非造血细胞系不表达cd22，所以cd22为靶点的治疗不会影响任何不表达cd22的组织，也不会抑制新的b细胞生成；②表达于成熟和恶性b细胞膜上较好的内化分子，当cd22分子被配体结合后，细胞能将配体内吞入细胞内，所以与放射性核素、毒素结合可能增加治疗效果；③在所有恶性细胞上的表达稳定，不随胞外环境不同而发生抗原调变。
随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体t细胞疗法(chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，car-t)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一[schmitzm，etal.chimericantigenreceptor-engineeredtcellsforimmunotherapyofcancer.jbiomedbiotechnol，2010，doi：10.1155/2010/956304.]。嵌合抗原受体(car)是car-t的核心部件，car能针对所选择的免疫细胞重定向其特异性和反应性，因此赋予t细胞hla非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过car改造的t细胞相较与正常t细胞受体(tcr)应答不同，不受mhc限制，具有活化和增殖的能力，因此具有高效的杀伤肿瘤细胞的能力。
嵌合抗原受体(car)在t细胞上表达合成蛋白，其将抗体的抗原识别片段(如抗体单链可变区片段)与胞内信号结构域融合。研究发现，以肿瘤特异性单克隆抗体的单链可变区(scfv)取代tcr的α，β链可变区，并将scfv直接和t细胞信号传导结构域连接，形成嵌合抗原受体(car)表达于t细胞表面，可通过scfv识别肿瘤特异性抗原，直接产生t细胞的活化信号，促进t细胞活化、增殖，特异性杀伤肿瘤细胞。该过程主要依赖car-t细胞表面的scfv对肿瘤抗原的特异性识别，免疫反应的特异性和杀伤性较强。
本发明对构建的靶向cd22的新型car，本发明采用的是人源化cd22(huc2b)单链抗体，huc2b具有高亲和力。huc2b是靶向cd22的人源化形式的单克隆抗体，对肿瘤具有治疗和诊断作用。本发明对car-t细胞进行了修饰，针对cd22靶点发挥car-t细胞抗肿瘤作用。本发明为临床实验和临床治疗奠定良好的基础。
随着car-t细胞治疗经验的积累和不断完善，其在恶性肿瘤中的应用越来越受到各界关注。在此环境下，我们要加快步伐，利用自身已有的工作基础、研发团队、医疗团队申请开展临床试验，推动car-t细胞治疗在治疗恶性肿瘤的道路上快速前进。
技术实现要素：
本发明第一方面提供一种核酸序列，所述核酸序列选自：
(1)含有依次连接的人自然杀伤激活受体相关蛋白(dap12)的编码序列、t2a的编码序列、抗cd22单链抗体的编码序列、人髓样触发受体(trem1)跨膜和胞内区的编码序列。
在一个或多个实施方案中，在所述抗cd22单链抗体的编码序列前的所述信号肽的编码序列如seqidno:1第412-474位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述抗cd22单链抗体的编码序列如seqidno:1第481-1218位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人dap12的核酸序列如seqidno:1第1-339位核酸所示。在一个或多个实施方案中，所述t2a的核酸序列如seqidno:1第355-405位核酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人trem1跨膜和胞内区的核酸序列如seqidno:1第1255-1392位核酸所示。本发明第二方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：
(2)含有依次连接的人dap12、t2a、抗cd22单链抗体、人trem1跨膜和胞内区的融合蛋白和限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化t细胞活性的融合蛋白；
优选地，所述抗cd22单克隆抗体huc2b。
在一个或多个实施方案中，所述核酸序列在所述抗cd22单链抗体的编码序列前还含有信号肽的编码序列。在一个或多个实施方案中，所述信号肽的氨基酸序列如seqidno:2第138-158位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述抗cd22单链抗体的氨基酸序列如seqidno:2第161-406位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人dap12的氨基酸序列如seqidno:2第1-113位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述t2a的氨基酸序列如seqidno:2第119-135位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人trem1跨膜和胞内区的氨基酸序列如seqidno:2第419-463位氨基酸所示。
本发明第三方面提供一种核酸载体，所述核酸载体含有本文所述的核酸序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为慢病毒载体，含有本文所述的核酸序列，以及任选的可选择的标记。
本发明第四方面提供一种慢病毒，所述慢病毒含有本文所述的核酸载体，优选含有所述慢病毒载体。
本发明第五方面提供一种基因修饰的t细胞，所述细胞含有本文所述的核酸序列，或含有本文所述的核酸载体，或感染了本文所述的慢病毒，或稳定表达本文所述的融合蛋白。
本发明第六方面提供一种含本文所述的基因修饰的t细胞的药物组合物。
本发明第七方面提供本文所述的核酸序列、融合蛋白、核酸载体或慢病毒在制备活化的t细胞中的应用。
本发明第八方面提供本文所述的核酸序列、融合蛋白、核酸载体、慢病毒、或基因修饰的t细胞或其药物组合物在制备治疗cd22介导的疾病的药物中的用途。
在一个或多个实施方案中，所述cd22介导的疾病为脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肝癌、肾脏癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、皮肤癌、胸腺瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、子宫癌。在一个或多个实施方案中，所述cd22介导的疾病为白血病、非霍奇金淋巴瘤。
附图说明
图1：pelns-cd22car慢病毒表达载体示意图。
图2：cd22-car结构示意图
图3：cd22car-t和ntd增殖情况
图4：cd22car-t与靶细胞共培养细胞因子分泌情况
图5：cd22car-t杀伤作用
具体实施方式
本发明提供一种靶向人源化cd22的嵌合抗原受体(car)。该car含有依次连接的人dap12、t2a、抗cd22单链抗体、人trem1跨膜和胞内区。
适用于本发明的抗cd22单链抗体可衍生自本领域周知的各种抗cd22单克隆抗体。
因此，在某些实施方案中，适用于本发明的抗cd22链抗体含有特异性识别人cd22。任选地，所述轻链可变区和重链可变区可通过接头序列连接在一起。可举例的这类单链抗体包括但不限于5/44、c2b。在某些实施方案中，所述单克隆抗体是huc2b。
形成本发明的融合蛋白，如人dap12、t2a、抗cd22单链抗体、人trem1跨膜和胞内区等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含g和s的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是gggs、ggggs、ssssg、gsgsa和ggsgg。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有插入氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(a)、亮氨酸(l)、苏氨酸(t)、谷氨酸(e)、苯丙氨酸(f)、精氨酸(r)、谷氨酰胺(q)等。
应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的n-末端、c-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的融合蛋白(即所述car)的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是flag，ha，ha1，c-myc，poly-his，poly-arg，strep-tagii，au1，ee，t7，4a6，ε，b，ge以及ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
本发明也包括第1-463位氨基酸序列所示的car或seqidno:2所示的car的突变体。这些突变体包括：与该car具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该car的生物学活性(如活化t细胞)的氨基酸序列。可采用例如ncbi的blastp计算两条比对的序列之间的序列相同性。
突变体还包括：在seqidno:2第1-463位所示的氨基酸序列或seqidno:2所示的氨基酸序列中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留该car的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。
本发明包括编码本发明融合蛋白的核酸序列。本发明的核酸序列可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码融合蛋白的核酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。
本文所述的核酸序列通常可以用pcr扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，在某些实施方案中，编码本文所述融合蛋白的核酸序列如seqidno:1第1-1392位核酸所示。
本发明也涉及核酸载体，该核酸载体含有本文所述的核酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的核酸序列可以多种方式被操作以保证所述融合蛋白(car)的表达。在将核酸载体插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸载体进行操作。利用重组dna方法来改变核酸序列的技术是本领域已知的。
调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mrna的非翻译区。前导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
本发明的核酸序列可被克隆入许多类型的载体。例如，可被克隆入质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。进一步地，载体是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如sambrook等(2001，molecularcloning:alaboratorymanual，coldspringharborlaboratory，newyork)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，wo01/96584；wo01/29058；和美国专利号6,326,193)。
例如，在某些实施方案中，本发明使用慢病毒载体，该慢病毒载体含有本文所述的核酸序列，以及任选的可选择的标记。
合适的启动子的一个例子为延伸生长因子-1α(ef-1α)启动子序列。合适的启动子的另一个例子为即时早期巨细胞病毒(cmv)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、鸟类白血病病毒启动子、eb病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的核酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估car多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段dna上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。在dna已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将核酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。将感兴趣的核酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用dna和rna载体。将核酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。
将核酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用病毒载体，特别是慢病毒载体，这已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自逆转录病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺伴随病毒等等。已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多反转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。
因此，在某些实施方案中，本发明还提供用于活化t细胞的慢病毒，该病毒含有本文所述的慢病毒载体以及相应的包装基因，如gag、pol和vsvg。
因此，在某些实施方案中，本发明提供一种基因修饰的t细胞，该基因修饰的t细胞含有本文所述的核酸序列，或含有本文所述的慢病毒载体，或感染了本文所述的慢病毒，或采用本文所述的方法制备得到，或稳定表达本文所述的融合蛋白。
本发明的car-t细胞可经历稳固的体内t细胞扩展并在血液和骨髓中以高水平持续延长的时间量，并形成特异性记忆t细胞。不希望被任何具体的理论所束缚，在遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，本发明的car-t细胞可体内分化成中心记忆样状态。
本发明还包括一类细胞疗法，其中t细胞被基因修饰以表达本文所述的car，和car-t细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，car-t细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
由car-t细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外，car介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中car-t细胞诱导对car中的抗原结合部分特异性的免疫应答。
因此，可采用本发明的car、其编码序列、核酸载体、表达载体、病毒以及car-t细胞治疗的疾病优选为cd22介导的疾病。
具体而言，本文中，“cd22介导的疾病”尤其包括各种类型的脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肝癌、肾脏癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、皮肤癌、胸腺瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、子宫癌。在某些实施方案中，所述cd22介导的疾病为白血病、非霍奇金淋巴瘤。
本发明的car-修饰的t细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的car-t细胞，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的t细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量。t细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如rosenberg等，neweng.j.ofmed.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的t细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的t细胞组合物优选通过静脉注射施用。t细胞的组合物可被直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。
在本发明的一些实施方案中，本发明的car-t细胞或其组合物可与本领域已知的其它疗法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。例如，可结合本领域周知的治疗cd22介导的疾病的放疗或化疗制剂进行治疗。
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例1、嵌合抗原受体制备
本发明提供一种靶向人源化cd22嵌合抗原受体。设计依次含有dap12、t2a、人源化cd22单链可变区、trem1，其结构如图1所示。
pelns-dap12-t2a质粒由南京卡提医学科技有限公司保存，或者根据文献(enxiuwangetal.generationofpotentt-cellimmunotherapyforcancerusingdap12-based,multichain,chimericimmunoreceptors.2015,cancerimmunologyresearch,3(7):815)公开的方法进行构建，cd22scfv-trem1基因合成由生工生物工程(上海)股份有限公司生物科技公司合成并提供，将质粒pelns-dap12-t2a分别和合成的基因片段通过bamhi、sali双酶切(购自takara公司)，酶切反应按说明书进行，酶切后再连接，获得表达嵌合抗原受体的慢病毒载体：
将5μl慢病毒载体转化大肠杆菌top10感受态细胞中(购自南京安杰优生物科技有限公司)，37℃培养16h后挑取单克隆，挑取的单克隆在37℃条件下培养12h后用质粒抽提试剂盒(购自takara公司)抽提质粒，具体方法见说明书。
实施例2、慢病毒包装
本实施例包装慢病毒采用磷酸钙法，具体步骤如下：
293t细胞隔天传代，每个t150细胞瓶种植5×106个细胞。48小时后，细胞数目应该达到20-25百万/瓶。以1个t150细胞培养瓶为例，用约15ml的1×pbs轻柔地洗细胞两次，加入3ml0.25％胰酶-2.21mmedta，等到细胞脱落，加入12ml10％(wt)fbs(购自gibico)的dmem培养基(购自corning)至已经脱落的细胞中，收集并将细胞转移至无菌离心管，1000rpm,离心10分钟，吸掉上清，将沉淀重悬于10ml10％(wt)fbs的dmem培养液中。细胞计数，根据细胞浓度计算12×106个细胞所需要的体积，将细胞和25ml的10％(wt)fbs的dmem培养液合并，放入t150细胞瓶中，轻摇，使得细胞均匀分布到细胞瓶底37℃，5％co2培养箱中培养过夜。
观察细胞，细胞密度大约达到80％-90％，此时就可以开始转染，在转染前30-60分钟，轻柔吸掉培养液。混合质粒dna和氯化钙溶液，以一个t150瓶为例，需要28ugprsv.rev(购自invitrogen公司)，28ugpgag-pol(购自invitrogen公司)，11ugpvsvg(购自invitrogen公司)，23ug重组慢病毒表达质粒cd22car，加入到1.5ml氯化钙溶液中，混匀。将1.5mlbbs溶液加入到15ml无菌离心管中，用1ml枪头把dna-氯化钙溶液混匀后滴加到bbs溶液中，迅速混匀15-20下，室温孵育25-30分钟。用5ml移液管把dna-氯化钙-bbs混合物(购自上海碧云天生物技术有限公司)均匀逐滴加到t150瓶中。在含5％二氧化碳的37℃细胞培养箱内培养，6h换液。6h后换液。轻轻晃动培养板数次以充分悬浮一些磷酸钙沉淀，吸去含磷酸钙沉淀的培养液，加入20ml新鲜的5％(wt)fbs的dmem培养液，继续培养。
将前一天转染的293t细胞培养上清收集到离心管，1000rpm离心5分钟，标记，暂存于4℃冰箱。将事先预热的20ml5％(wt)fbs的dmem培养基加入细胞瓶中，37℃细胞培养箱继续培养过夜。第二次收集病毒上清液(48h/第四天)。将两次收集的上清液集中在一起，用0.45μm的滤膜过滤去除细胞碎片。4℃，12000-24000rpm离心过夜，离心后，倾倒全部上清，加入新鲜5％(wt)fbs的dmem培养基重悬，进行病毒分装，迅速存放于-80℃冰箱备用
实施例3、病毒感染t细胞
用含有抗凝剂的采血管采集外周血约10ml，室温(18-25℃)自然沉降约30min，收集上层血浆，将收集的上层血浆于5000r/min条件下离心10min，按体积比1:1加到淋巴细胞分离液(购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)上，梯度离心，3000r/min，离心30min，离心后，离心管由上之下分层：第一层为血浆层；第二层为淋巴细胞白膜层；第三层为透明分离液层；第四层红细胞层。吸取淋巴细胞白膜层，并用pbs洗涤2次，两次离心以1500r/min，离心10min，pbs重悬细胞，加入5％自体血浆 300iu/ml重组人il-2 kbm581完全培养基培养人外周血单核细胞。用含5％自体血浆 300iu/ml重组人il-2 kbm581完全培养基培养新制备的单个核细胞pbmc，il-2购自r&dsystems，kbm581购自corning，第0天加入cd3/cd28dynabeads免疫磁珠(购自invitrogen)活化t细胞，前3天进行慢病毒感染，加入0.25moi对应的慢病毒载体，未感染的t淋巴细胞作为空白对照，48h后将培养基更换为含有5％自体血浆 300iu/ml重组人il-2 kbm581完全培养基，继续培养7-9天。
实施例4、病毒感染car-t细胞对细胞增殖的影响
慢病毒感染完t细胞后，将t细胞用含体积分数5％自体血浆 300iu/ml重组人il-2 kbm581完全培养基，每1-2天计数一次。然后观察t淋巴细胞生长情况，结果如图3所示。结果表明细胞在感染表达car的病毒后，依然能够形成典型的增殖克隆团，通过对细胞进行计数，绘制细胞增殖曲线可见感染cd22car-t细胞增殖比未感染病毒的t细胞(图3中ntd)增殖能力稍弱。
实施例5、检测病毒感染car-t细胞的细胞因子分泌
(1)细胞因子检测采用elisa的方法，使用r&d公司试剂盒进行。
(2)标准品的稀释：准备1ml离心管7支，依次编号号码，先在各离心管中加入标准品稀释液500μl，然后取原浓度标准品500μl加入到1只已编好号的离心管中，充分混匀，再在该离心管中取500μl加入第二支离心管中，充分混匀；再在该离心管中取500μl加入第三只离心管中，充分混匀；再在该离心管中取500μl加入第四只离心管中，充分混匀；再在该离心管中取500μl加入第五只离心管中，充分混匀；再在该离心管中取500μl加入第六只离心管中，充分混匀；再在该离心管中取500μl加入第七只离心管中，充分混匀。
(3)在酶标包被板上设标准品孔，依次加入不同浓度的标准品100μl，每个浓度2-3个平行孔。
(4)加样：分别设置空白孔(空白对照孔用水代替，酶标试剂及生物素标记的抗体操作照旧)、待测样品孔，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品100μl，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀
(5)孵育：室温放置孵育2h
(6)洗涤：弃去液体，甩干，每孔加200μl洗涤液，静止30s后弃去，如此重复3次，拍干
(7)加抗体：酶标包被板上加入100μl检测抗体
(8)孵育：同操作(5)
(9)洗涤：同操作(6)
(10)加标记：每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记链霉亲和素
(11)孵育：避光室温放置孵育20min
(12)洗涤：同操作(6)
(13)显色：每孔加入显色液100μl，轻轻震荡混匀，避光室温放置孵育20min
(14)终止：每孔加入终止液50μl，终止反应
(15)测定：以空白值校零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)，测定应在加入终止液后15min内进行。
选择抗原表达水平具有差异的靶细胞与cd22car-t共培养，检测cd22car-t受到抗原刺激产生响应作用分泌ifn-γ水平，靶细胞选择293t-cd22(cd22高表达)，293t(cd22阴性)，以此来显示出cd22car-t在受到cd22抗原刺激时所特异性分泌出ifn-γ，结果反映出cd22car对于抗原表达水平具有差异的靶细胞产生了不同的响应作用。cd22car-t在cd22高表达靶细胞293t-cd22共培养时显著分泌ifn-γ(图4)，表明cd22car-t对于抗原阳性的肿瘤细胞具有响应作用。
实施例6、病毒感染car-t细胞体外杀伤效果评估
(1)分别培养靶细胞293t-cd22细胞(cd22高表达细胞株)、293t(cd22阴性细胞株)和效应细胞cd22car-t细胞。
(2)收集靶细胞和效应细胞，1500rpm/min，离心5min，弃上清
(3)用10％fbs 1640完全培养基重悬靶细胞和效应细胞
(4)利用实时细胞分析系统(rtca)，在e-plate16的空中加入50μl1640培养基
(5)利用rtca检测基线，确定所选孔接触正常
(6)设置效靶比为0:1、1:1、5:1、10:1
(7)取出e-plate16，按照效靶比，在每孔中加入混合均匀的靶细胞悬液100μl，使每孔种细胞数目为104cells/100μl。
(8)将e-plate16置于培养箱中，以37℃，5％co2条件下，过夜放置
(9)第二天，将e-plate16取出，加入50μl相应的效应细胞，计算加入效应细胞8h后的杀伤率。
(10)
检测结果如图5所示。cd22car-t对cd22抗原阳性肿瘤细胞表现出显著的杀伤作用。图4和图5结果综合显示，体外杀伤实验结果表明以cd22为靶点的car-t细胞具有显著的抗肿瘤活性，该car设计有利于临床应用。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权力要求书所限定的范围。
序列表
<110>南京艾德免疫治疗研究院有限公司
<120>靶向人源化cd22的嵌合抗原受体及其用途
<130>2019
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1.一种核酸序列，所述核酸序列选自：含有依次连接的人dap12的编码序列、t2a的编码序列、抗cd22单链抗体的编码序列、人trem1跨膜和胞内区的编码序列。
2.如权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列在所述抗cd22单链抗体的编码序列前还含有信号肽的核酸序列，优选地，所述信号肽的核酸序列如seqidno:1第412-474位核酸所示；和/或所述抗cd22抗体的核酸序列如seqidno:1第481-1218位多核酸所示；和/或所述人dap12的核酸序列如seqidno:1第1-339位多核酸所示；和/或所述t2a的核酸序列如seqidno:1第355-405位核酸所示；和/或所述人trem1跨膜和胞内区的核酸序列如seqidno:1第1255-1392位核酸所示。
3.一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：含有依次连接的人dap12、t2a、抗cd22单链抗体、人trem1跨膜和胞内区的融合蛋白；和限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化t细胞活性的衍生的融合蛋白；优选地，所述抗人源化cd22单克隆抗体为huc2b。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一个或多个特征：所述融合蛋白在所述抗cd22抗体的n端还含有信号肽，优选地，所述信号肽的氨基酸序列如seqidno:2第138-158位氨基酸所示；所述抗cd22单链抗体的氨基酸序列如seqidno:2第161-406位氨基酸所示；所述人dap12的氨基酸序列如seqidno:2第1-113位氨基酸所示；所述t2a的氨基酸序列如seqidno:2第119-135位氨基酸所示；所述人trem1跨膜和胞内区的氨基酸序列如seqidno:2第419-463位氨基酸所示。
5.一种核酸载体，所述核酸载体含有权利要求1-2中任一项所述的核酸序列；优选地，所述核酸载体为慢病毒载体，含有权利要求1-2中任一项所述的核酸序列。
6.一种慢病毒，所述慢病毒含有权利要求5所述的核酸载体，优选含有所述慢病毒载体。
7.一种基因修饰的t细胞或含该基因修饰的t细胞的药物组合物，其特征在于，所述细胞含有权利要求1-2中任一项所述的核酸序列，或含有权利要求5所述的核酸载体，或感染了权利要求6所述的慢病毒，或稳定表达权利要求4中任一项所述的融合蛋白。
8.权利要求1-2中任一项所述的核酸序列、权利要求3-4中任一项所述的融合蛋白、权利要求5所述的核酸载体或权利要求7所述的慢病毒在制备活化的t细胞中的应用。
9.权利要求1-2中任一项所述的核酸序列、权利要求3-4中任一项所述的融合蛋白、权利要求5所述的核酸载体、权利要求6所述的慢病毒、或权利要求7所述的基因修饰的t细胞或其药物组合物在制备治疗cd22介导的疾病的药物中的用途；优选地，所述cd22介导的疾病为脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肝癌、肾脏癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、皮肤癌、胸腺瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、子宫癌，优选为白血病、非霍奇金淋巴瘤。
技术总结