本发明涉及基因编辑
技术领域：
，特别涉及一种清除肠杆菌科细菌中耐药质粒的方法。
背景技术：
：肠杆菌科是一大类不同类型的细菌，通常在医疗机构中引起感染。其中最为多见的是大肠埃希菌(e.coli)和肺炎克雷伯菌。当肠杆菌科细菌对碳青霉烯类的抗生素产生抗药性时，细菌被称为对碳青霉烯类耐药的肠杆菌科(carbapenemresistantenterobacteriaceae，cre)。目前，cre对临床上使用的绝大多数抗生素均耐受，对公共卫生构成巨大威胁。肠杆菌科中对碳青霉烯类的抗药性通常是细菌产生碳青酶烯酶，这源于能够产生该酶的碳青霉烯编码基因。肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(kpc)，新德里金属β-内酰胺酶(ndm)和oxacillinase-48(oxa-48)产碳青霉烯酶的肠杆菌科中最常见的碳青霉烯酶。这些基因通常由质粒所携带，能够在不同菌体之间进行水平传播，从而导致了耐药性的广泛流行。质粒清除技术是对抗包括cre在内的多重耐药细菌(mdr)的潜在有效方法，因为它具有从菌体中去除耐药基因而不增加细菌选择性压力的特性，这一点与抗生素对细菌的作用机制不同。此外，从含有多个抗性质粒的细菌中定向清除某一特定质粒，生成缺失质粒的模式菌株，对于研究每个质粒的功能，阐述与宿主的关系至关重要。传统的质粒清除策略包括将宿主菌株置于高温下，用结晶紫、十二烷基硫酸钠(sds)等化学试剂，或利用紫外线辐射处理。然而，这些方法很可能在这些处理过程中导致细菌染色体突变，并且对于质粒清除缺乏特异性。此外，建立在质粒不相容性原理的质粒清除技术需要了解目标质粒的复制子信息，也同样不适用于临床分离株。crispr/cas9技术为应对碳青霉烯抗性菌株提供了新的机会，因为这种rna引导的dna核酸酶可以模拟天然的细菌对质粒的防御能力，特别是切割细菌抗性基因。近年来，cas9/sgrna系统已成功用于携带超广谱β内酰胺酶、mcr-1基因的细菌宿主中的质粒清除。通过使用crispr/cas9系统特异性切割抗性基因，可以诱导抗生素抗性细菌恢复为抗生素敏感性，为此，我们提出一种清除肠杆菌科细菌中耐药质粒的方法。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种清除肠杆菌科细菌中耐药质粒的方法，可以有效解决
背景技术：
中的问题。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种清除肠杆菌科细菌中耐药质粒的方法，包括以下步骤：(1)、耐药基因信息挖掘：通过ncbi检索并下载genbank中的所有blakpc和blandm基因序列，利用blast对各基因序列分别进行比对，以紧临pam基序的20个碱基的共有序列作为耐药基因清除的靶点；(2)、步骤s1中基因序列与grna进行连接：通过人工合成引物和pcr的方法生成靶向的sgrna基因片段；(3)、构建含有上述s1步骤中所述靶向序列的crispr/cas9工具质粒pcurekpc和pcurendm；(4)、更换pcurekpc和pcurendm质粒的抗性标记；(5)、cre菌株的药物敏感性试验：利用纸片法和肉汤稀释法对临床分离的肺炎克雷伯菌进行mic试验；(6)、耐药质粒的清除和筛选：首先制备产碳青酶烯酶的肠杆菌感受态细菌，根据药物敏感性实验结果，将不同耐药标记的pcurekpc和pcurendm质粒电转入感受态细菌，加入阿拉伯糖诱导cas9蛋白的表达过夜，pcr方法筛选清除耐药质粒的菌株，然后利用5％的蔗糖溶液清除crispr/cas9工具质粒，将宿主细菌的质粒清除。优选的，紧临pam基序的20个碱基的共有序列采用耐药质粒的靶向序列。优选的，所述序列在crispr-cas9系统中能够引导cas9核酸酶对细菌中的质粒特异性位点进行酶切，所述序列如sequence1和sequence2所示：sequence1：(n20-kpc)：caatttgttgctgaaggagt；sequence2：(n20-ndm)：cccaacggtgatattgtcac。优选的，所述序列能够与grna骨架序列相连接，序列与grna骨架序列构成靶向酶切kpc和ndm的引导rna。优选的，与所述序列相连接的grna骨架序列的基因序列为：tttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt。优选的，所述序列包含kpc和ndm的引导rna的psgkp-arr质粒和插入阿拉伯糖诱导的cas9基因。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：利用crispr/cas9基因编辑技术，对细菌携带质粒中的耐药基因进行酶切以清除耐药质粒。首先是利用生物信息学技术，筛选靶向耐药基因的sgrna序列，该序列为绝大多数耐药基因所共有，同时又不存在于宿主菌中，既保证cas9的酶切具有高度的特异性，又不对宿主基因带来影响；其次利用这一特异性dna序列引入引导rna，插入可诱导表达型cas9编码基因，最终构建成功一步法清除耐药质粒的pcurekpc和pcurendm质粒，从而为耐药质粒功能研究和cre的防治提供新的工具。附图说明图1是构建成功的pcurekpc/pcurendm的质粒示意图；图2是耐药质粒清除前后的pcr电泳和s1-pfge电泳图；图3是不同阿拉伯糖诱导浓度和时间对质粒清除的效果。具体实施方式为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。实施例1一种清除肠杆菌科细菌中耐药质粒的方法，包括以下步骤：(1)、耐药基因信息挖掘：通过ncbi检索并下载genbank中的所有blakpc和blandm基因序列，利用blast对各基因序列分别进行比对，以紧临pam基序的20个碱基的共有序列作为耐药基因清除的靶点；紧临pam基序的20个碱基的共有序列采用耐药质粒的靶向序列。(2)、步骤s1中基因序列与grna进行连接：通过人工合成引物和pcr的方法生成靶向的sgrna基因片段。(3)、构建含有上述s1步骤中靶向序列的crispr/cas9工具质粒pcurekpc和pcurendm。(4)、更换pcurekpc和pcurendm质粒的抗性标记。(5)、cre菌株的药物敏感性试验：利用纸片法和肉汤稀释法对临床分离的肺炎克雷伯菌进行mic试验。(6)、耐药质粒的清除和筛选：首先制备产碳青酶烯酶的肠杆菌感受态细菌，根据药物敏感性实验结果，将不同耐药标记的pcurekpc和pcurendm质粒电转入感受态细菌，加入阿拉伯糖诱导cas9蛋白的表达过夜，pcr方法筛选清除耐药质粒的菌株，然后利用5％的蔗糖溶液清除crispr/cas9工具质粒，将宿主细菌的质粒清除。序列在crispr-cas9系统中能够引导cas9核酸酶对细菌中的质粒特异性位点进行酶切，序列如sequence1和sequence2所示：sequence1：(n20-kpc)：caatttgttgctgaaggagt；sequence2：(n20-ndm)：cccaacggtgatattgtcac。序列能够与grna骨架序列相连接，序列与grna骨架序列构成靶向酶切kpc和ndm的引导rna。与序列相连接的grna骨架序列的基因序列为：tttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt。序列包含kpc和ndm的引导rna的psgkp-arr质粒和插入阿拉伯糖诱导的cas9基因。实施例21.构建用于清除肠杆菌中耐药基因的工具质粒靶点序列设计：根据crispr技术基本要求，引导rna识别序列应与待编辑基因存在20个碱基互补序列，且该序列应紧临被称为ngg的pam基序。通过ncbi检索并下载genbank中的所有blakpc和blandm基因序列，利用blast对各基因序列分别进行比对，寻找耐药基因清除的靶点，结果如下：n20-kpc：caatttgttgctgaaggagtn20-ndm：cccaacggtgatattgtcac2.靶点序列插入到psgkp-arr质粒与grna进行连接根据靶点序列合成引物：名称序列f-kpcaatactagtcaatttgttgctgaaggagtgttttagagctagaaatagcf-ndmaatactagtcccaacggtgatattgtcacgttttagagctagaaatagcr1gccgctctagaagtagtgga以pcr方法引入靶点序列，pcr反应体系为：反应条件为：预变性：95℃5分钟；变性：95℃30秒；退火：55℃30秒；延伸：72℃30秒；最后延伸：72℃5分钟；变性、退火和延伸步骤重复35次。pcr反应产物经纯化后，利用xbai与spei进行双酶切，酶切反应体系见下表：dna1μg10xcutsmartbuffer5μl(1x)xbai1.0μl(20units)spei1.0μl(10units)nuclease-freewaterto50μ37℃孵育30分钟；psgkp酶切条件与pcr产物酶切条件相同，然后利用琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收；用t4连接酶将上述纯化的pcr和质粒产物进行连接，t4连接酶反应体系如下表：10xt4dnaligasebuffer*2μlvectordna(3kb)50ng(0.025pmol)insertdna(1kb)50ng(0.076pmol)t4dnaligase1μlnuclease-freewaterto20μl将连接好的产物转入到dh10b感受态大肠杆菌，利用利福平平板进行筛选，pcr进一步验证后保留阳性菌株。lb肉汤培养基将阳性克隆菌株37℃过夜培养，提取质粒待下一步使用。3.cas9基因克隆和插入以psgkp质粒为模板，not1-cas9和xbai-cas9分别作为前向和反向引物扩增cas9编码基因，引物序列如下：not1-cas9aaagcggccgcccaggagctatttaatggataagaaxbai-cas9ctagtctagaaaccagccatcagtcacctcpcr反应体系和条件同前；将pcr产物利用noti和xbai进行双酶切，体系如下表：dna1μg10x3.1buffer5μl(1x)xbai1.0μl(20units)spei1.0μl(10units)nuclease-freewaterto50μ37℃孵育30分钟，然后利用琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收，将回收产物与同样酶切的上述质粒进行连接，连接体系和条件同前。将连接好的产物转入到dh10b感受态大肠杆菌，利用利福平平板进行筛选，pcr进一步验证后保留阳性菌株。lb肉汤培养基将阳性克隆菌株37℃过夜培养，提取质粒(psgkp-cas9)待下一步使用。4.arac诱导型启动子插入cas9基因上游合成引物ara_noti_f1和ara_noti_r1，序列如下表：ara_noti_f1aaagcggccgcgaagcagggattctgcaaacara_noti_r1aaagcggccgccgggtatggagaaacagtagaga以pbad24质粒为模板，进行pcr扩增，反应条件同前，将pcr产物和上述步骤中获得的psgkp-cas9质粒分别用noti核酸内切酶进行双酶切，反应条件如下：dna1μg10x3.1buffer5μl(1x)noti1.0μl(20units)nuclease-freewaterto50μ利用t4连接酶将酶切产物进行连接，然后克隆转化。所构建质粒如图1所示。实施例3摸索最佳阿拉伯糖诱导浓度和诱导时间1.将含有pcure-arr-kpc质粒的菌株过夜培养物在5ml含0.2％阿拉伯糖和100ug/ml利福平的lb肉汤中稀释1000倍。阿拉伯糖分别诱导0、2、4、6和16小时，然后将培养物分别接种在含有多利培南/利福平的双抗板和利福平的lb琼脂上单抗板，测定多瑞培南/利福平双抗板和利福单抗板的集落比，计算清除率。2.为了评估最佳阿拉伯糖浓度，将带有pcure-arr-kpc质粒的菌株过夜培养物在5ml含有0.02％，0.2％，2％阿拉伯糖的lb培养基中稀释1000倍，并在37℃摇动(250rpm)下生长)持续6个小时。将培养物稀释并铺在分别含有多立培南/利福平和利福平的lb平板上。通过检查抗生素抗性的丧失来检查每种培养物的菌落中是否存在靶向质粒(结果参见图2)实施例4碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌中耐药质粒的清除1.收集特殊耐药表型的实验菌株搜集临床上分离到的耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌菌株，mcim试验进行碳青霉烯酶表型确认，pcr方法验证耐药基因型，引物如下：2.感受态细菌的制备按照标准流程制备上述实验菌株的电转感受态细菌3.电转和筛选利用电转仪将清除耐药质粒的工具质粒转移至上述步骤的感受态细菌中，用含有利福平的平板进行阳性克隆的筛选4.清除了耐药基因的细菌筛选加入终浓度为0.2％的阿拉伯糖，液体培养基诱导表达6小时，接种于利福平单抗平板，利用pcr抗性基因的引物对菌落进行鉴定，同时进行s1-pfge电泳(参见图3)5.工具质粒的自身清除为了清除pcure-ndm和pcure-kpc工具质粒，选择一个含有所需突变的菌落，然后将其划线到含有5％蔗糖的lb琼脂平板上。将该板在37℃下孵育过夜。通过菌落pcr检查至少10个菌落，以确认工具质粒的丢失情况。实验表明：100％的菌株均能够清除工具质粒。本发明清除肠杆菌科细菌中耐药质粒的方法，本发明利用crispr/cas9基因编辑技术，对细菌携带质粒中的耐药基因进行酶切以清除耐药质粒。首先是利用生物信息学技术，筛选靶向耐药基因的sgrna序列，该序列为绝大多数耐药基因所共有，同时又不存在于宿主菌中，既保证cas9的酶切具有高度的特异性，又不对宿主基因带来影响；其次利用这一特异性dna序列引入引导rna，插入可诱导表达型cas9编码基因，最终构建成功一步法清除耐药质粒的pcurekpc和pcurendm质粒，从而为耐药质粒功能研究和cre的防治提供新的工具。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页1 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技术特征：1.一种清除肠杆菌科细菌中耐药质粒的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)、耐药基因信息挖掘：通过ncbi检索并下载genbank中的所有blakpc和blandm基因序列，利用blast对各基因序列分别进行比对，以紧临pam基序的20个碱基的共有序列作为耐药基因清除的靶点；
(2)、步骤s1中基因序列与grna进行连接：通过人工合成引物和pcr的方法生成靶向的sgrna基因片段；
(3)、构建含有上述s1步骤中所述靶向序列的crispr/cas9工具质粒pcurekpc和pcurendm；
(4)、更换pcurekpc和pcurendm质粒的抗性标记；
(5)、cre菌株的药物敏感性试验：利用纸片法和肉汤稀释法对临床分离的肺炎克雷伯菌进行mic试验；
(6)、耐药质粒的清除和筛选：首先制备产碳青酶烯酶的肠杆菌感受态细菌，根据药物敏感性实验结果，将不同耐药标记的pcurekpc和pcurendm质粒电转入感受态细菌，加入阿拉伯糖诱导cas9蛋白的表达过夜，pcr方法筛选清除耐药质粒的菌株，然后利用5％的蔗糖溶液清除crispr/cas9工具质粒，将宿主细菌的质粒清除。
2.根据权利要求1所述的一种清除肠杆菌科细菌中耐药质粒的方法，其特征在于：紧临pam基序的20个碱基的共有序列采用耐药质粒的靶向序列。
3.一种耐药质粒的靶向序列，其特征在于：所述序列在crispr-cas9系统中能够引导cas9核酸酶对细菌中的质粒特异性位点进行酶切，所述序列如sequence1和sequence2所示：
sequence1：(n20-kpc)：caatttgttgctgaaggagt；
sequence2：(n20-ndm)：cccaacggtgatattgtcac。
4.根据权利要求3所述的一种耐药质粒的靶向序列，其特征在于：所述序列能够与grna骨架序列相连接，序列与grna骨架序列构成靶向酶切kpc和ndm的引导rna。
5.根据权利要求3所述的一种耐药质粒的靶向序列，其特征在于：与所述序列相连接的grna骨架序列的基因序列为：
tttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt。
6.根据权利要求3所述的一种耐药质粒的靶向序列，其特征在于：所述序列包含kpc和ndm的引导rna的psgkp-arr质粒和插入阿拉伯糖诱导的cas9基因。
技术总结本发明公开了一种清除肠杆菌科细菌中耐药质粒的方法，包括以下步骤：耐药基因信息挖掘：通过NCBI检索并下载genbank中的所有blaKPC和blaNDM基因序列，利用blast对各基因序列分别进行比对，以紧临PAM基序的20个碱基的共有序列作为耐药基因清除的靶点。本发明所述的一种清除肠杆菌科细菌中耐药质粒的方法，公开了耐药质粒的靶向序列，该序列能够引导Cas9酶切蛋白，对含有互补序列的耐药基因进行酶切，其次能够定向且高效的清除对碳青酶烯类抗生素耐药的肠杆菌细菌(CRE)所携带的kpC基因、NDM基因和携带质粒，为耐药质粒功能研究提供模式菌株，并为CRE的防治提供新的思路，带来更好的使用前景。
技术研发人员：郝明巨;石晓红;马建萍;董秀涛;郭建壮;马万山
受保护的技术使用者：山东省千佛山医院
技术研发日：2020.02.27
技术公布日：2020.06.09
