本发明涉及一种植物生物技术领域，具体涉及一种大豆gmst1基因突变体植株及其制备方法。
背景技术：
大豆花叶病毒病由大豆花叶病毒(soybeanmosaicvirus，smv)引起，是影响大豆产量和品质最严重的病毒性病害之一。在我国东北大豆主产区，n1和n3毒株为优势株系，其导致的大豆植株非正常生长可造成大豆大面积减产25％-60％，严重时甚至绝产。由于传统育种方法的局限性，因此利用分子手段筛选及鉴定有效的抗病基因，对抗病品种的选育便显得尤为重要，这为选育抗病品种提高了效率和准确性，加快了选育抗病品种的进程。由于大豆基因组庞大且大豆存在的多倍体化现象及低转化率等问题，对抗病基因的功能分析增加了难度。
技术实现要素：
本发明为了明确大豆抗花叶病毒相关基因的抗病功能，本发明提供了一种大豆gmst1基因突变体植株，所述突变体植株含有突变的大豆gmst1基因，所述突变是指gmst1基因编码区中5’agaaaggggaggaaataa3’或5’cttcctagggagagaggt3’核苷酸序列发生碱基取代或缺失，使其编码的氨基酸序列发生改变，所述大豆gmst1基因核苷酸序列如seqidno：1所示。
上述大豆gmst1基因突变体植株的制备方法，包括如下步骤：
1)根据大豆gmst1基因设计grna单靶点引物；
2)制备grna单靶点引物二聚体；
3)将引物二聚体插入到cas9/grna载体中，构建大豆gmst1基因敲除载体；
4)将步骤3)构建的gmst1基因敲除载体转化大豆，经筛选获得大豆gmst1基因突变体植株。
进一步地限定，步骤1)所述大豆gmst1grna单靶点引物的正向引物为gmst1-1-s，其核苷酸序列如seqidno：2所示，反向引物为gmst1-1-a，其核苷酸序列seqidno:3所示；或者正向引物为gmst1-2-s，其核苷酸序列如seqidno：4所示，反向引物为gmst1-2-a，其核苷酸序列seqidno：5所示。
进一步地限定，步骤2)所述制备grna单靶点引物二聚体，是指每20ul合成体系中正向引物5μl，正向引物5μl和h2o15μl，反应条件为95℃3min，冷却至25℃后，16℃静置5min。
进一步地限定，步骤3)所述构建gmst1基因敲除载体，是指每10ul反应体系中，引物二聚体1-7μl，cas9/grnavector，1μl，solution11μl，solution21μl，h2o0-6μl，16℃过夜反应。
进一步地限定，步骤4)所述gmst1基因敲除载体通过农杆菌介导法转化大豆；所述农杆菌为农杆菌eha105。
进一步地限定，步骤4)所述大豆为东农93-046。
进一步地限定，步骤4)所述筛选所用正向引物为casjc-s，其核苷酸序列如seqidno：6所示，反向引物为casjc-a，其核苷酸序列如seqidno：7所示，用于筛选阳性突变体植株。
进一步地限定，步骤4)所述筛选所用正向引物为gmst1-target1-s，其核苷酸序列如seqidno：8所示，反向引物序列为gmst1-target1-a，其核苷酸序列如seqidno：9所示，用于检测利用引物gmst1-1-s和gmst1-1-a构建获得的大豆gmst1基因突变体植株；或者正向引物为gmst1-target2-s，其核苷酸序列如seqidno：10所示，反向引物为gmst1-target2-a，其核苷酸序列如seqidno：11所示，用于检测利用引物gmst1-2-s和gmst1-2-a构建获得的大豆gmst1基因突变体植株。
进一步地限定，本发明对获得的大豆gmst1基因突变体植株中突变的gmst1基因表达量进行qrt-pcr定量检测，所述检测用的正向引物为qgmst1-s，其核苷酸序列如seqidno：12所示，反向引物为qgmst1-a，其核苷酸序列如seqidno：13所示；用于对照的基因为病毒外壳蛋白基因，检测该基因表达量的正向引物为smv-cp-s，其核苷酸序列如seqidno：14所示，反向引物为smv-cp-a，其核苷酸序列如seqidno：15所示。
有益效果
本发明利用crispr/cas9技术对大豆gmst1基因编码区进行靶向突变，获得了大豆突变体植株，通过与野生型表型鉴定及gmst1基因表达量、病毒外壳蛋白基因表达量分析对比可看出，gmst1基因突变后，其对大豆花叶病毒的抵抗力削弱，确定了gmst1能够参与到抗大豆花叶病毒病的抗性反应中，本发明为大豆抗花叶病毒相关基因功能的研究提供了理论依据。
附图说明
图1gmst1基因2个单靶点载体构建菌液pcr，其中m：dl2000，1、2为靶点1的pcr检测结果，3、4为靶点2的pcr检测结果。
图2t2代gmst1基因敲除植株的pcr突变检测，其中m：dl2000，1-4：转gmst1-1基因敲除载体的植株pcr产物，5：阴性对照(东农93-046)。
图3gmst1-1突变体碱基缺失情况，ck为东农93-046，wt为phytozome上gmst1基因(glyma.13g191400)序列，2-1为突变体植株编号。
图4t2代gmst1基因敲除植株接种smvn1后叶片的变化。
图5gmst1突变体qrt-pcr检测结果，其中a为gmst1-1突变体中gmst1基因qrt-pcr检测结果。ck为东农93-046,1-4：基因敲除突变体，1为gmst1-1靶点的突变体，植株编号2-1，2-4为gmst1-2靶点的突变体，植株编号依次为3-1、3-2、3-3；5-8：非突变体；b为gmst1-1突变体中smvcp基因qrt-pcr检测结果。ck为东农93-046，a为1-4：基因敲除突变体，1为gmst1-1靶点的突变体，植株编号2-1，2-4为gmst1-2靶点的突变体植株，编号依次为3-1、3-2、3-3；5-8：非突变体。
图6t2代gmst1基因敲除植株的pcr突变检测，其中m：dl2000，1-4：转gmst1-2基因敲除载体的植株pcr产物，5：阴性对照(东农93-046)
图7t2代gmst1基因敲除植株的碱基缺失情况，ck为东农93-046，wt为phytozome上gmst1基因(glyma.13g191400)序列，3-1、3-2、3-3分别为突变体植株编号。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药品试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。此外，大豆品种东农93-046(抗病品种)公众可以从东北农业大学获得；该品种记载在：滕卫丽.大豆抗花叶病遗传,细胞超微结构分析及基因定位.博士学位论文.东北农业大学.2006。公众均可以从东北农业大学获得。
其中，所用的lb培养基的配制方法为：配制每升培养基,在950ml去离子水中加入:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，摇动容器直至溶质溶解。用5mol/lnaoh调ph至7.0.用去离子水定容至1l.高压下蒸汽灭菌21min。
yep液体培养基：配制每升培养基,在950ml去离子水中加入:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl5g，摇动容器直至溶质溶解。用5mol/lnaoh调ph至7.0.用去离子水定容至1l。在15psi高压下蒸汽灭菌21min。
ms0培养基：称取4.43gms粉末，30g蔗糖，加600-800ml蒸馏水溶解，玻璃棒搅拌充分溶解后，调节ph值至5.8，定容至1l，加入6g琼脂粉末，在15psi高压下蒸汽灭菌21min。
所述crispr/cas9试剂盒购买自北京唯尚立德生物科技有限公司，货号vk005-15。
大豆花叶病毒n1株系(简称smv-n1株系)：公众可以从东北农业大学获得；该株系记载在：滕卫丽.大豆抗花叶病遗传,细胞超微结构分析及基因定位.博士学位论文.东北农业大学.2006.感病叶片的表型为：叶脉间失绿，系统花叶。
实施例1.大豆gmst1基因突变体植株的制备方法。
本实施例以第一个靶点为例(靶点核苷酸序列为5’agaaaggggaggaaataa3’)位于gmst1编码区第47位至第64位碱基处，描述大豆gmst1基因突变体植株的制备方法。
1)根据大豆gmst1基因设计grna单靶点引物。
首先扩增获得大豆gmst1基因，以大豆品种东农93-046为材料，待长出第一组三出复叶时，取材，提取总rna并反转录合成cdna第一链。根据phytozome上gmst1基因(glyma.13g191400)序列，利用primer5软件设计基因克隆引物(引物1)，其核苷酸序列如下：
引物1-s：5’-gaagatctatggctccaacaaatgtcac-3’(seqidno：20所示)；
引物1-a：5’-cttggttaccttaaaatgacaagcctgac-3’(seqidno：21所示)。
以cdna为模板进行rt-pcr反应，反应体系如下，反应程序：94℃5min；38个循环：94℃30s，58℃30s，72℃1min；72℃7min，4℃保存。反应后取pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测并进行胶回收纯化目的片段。rt-pcr反应体系如下：
按照tiangen公司的pgm-t克隆试剂盒的步骤，将上述得到的胶回收产物与克隆载体进行连接，获得带有目的基因的克隆质粒pgm-t-gmst1，转化top10大肠感受态细胞，挑取单克隆并进行pcr及测序验证。最终得到目的片段大小为1035bp的gmst1基因，如seqidno：1所示。
根据获得的gmst1基因序列，设计grna单靶点引物。正向引物为gmst1-1-s，5’-ttgagaaaggggaggaaataa-3’(seqidno：2所示)，反向引物为gmst1-1-a，5’-aacttatttcctcccctttct-3’(seqidno：3所示)，上述引物经引物合成公司合成获得。
2)制备grna单靶点引物二聚体。
将上述正、反向引物按如下比例混合形成二聚体：gmst1-1-s/a(10μm)各5μl，h2o15μl混合后，进行如下处理：95℃3min；95℃到25℃缓慢冷却；16℃5min。
3)将引物二聚体插入到cas9/grna载体中，构建gmst1基因敲除载体，记为gmst1-1基因敲除载体。
反应体系如下(10μl体系)：16℃过夜反应。
4)将步骤3)构建的gmst1-1基因敲除载体转化农杆菌，侵染大豆，经鉴定获得大豆gmst1基因突变体植株。
a转化：取上述产物10μl加入到刚解冻的50μltop10感受态中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰上静置2min，再加入500μl无抗lb培养基中，置于37℃恒温摇床中，170转，复苏1h后，涂kana抗性的固体平板，37℃过夜培养，挑取3-5个单斑摇菌，进行菌液pcr及测序，如图1所示。所述菌液pcr检测引物为：
casjc-s：5’-aaaagtcccacatcgcttag-3’(seqidno：6所示)
casjc-a：5’-tgtgcaaggtaagaagatgg-3’(seqidno：7所示)，目的片段为435bp，将测序结果与载体序列进行比对，保存阳性菌液于-80℃备用。
b.根癌农杆菌介导法转化大豆茎尖。
将gmst1-1基因敲除载体转入农杆菌eha105中，采用本实验保存的质粒，冻融法转化农杆菌的方法，该方法可参考：王涛.大豆mirna172及靶基因参与开花诱导和逆境响应的功能分析.博士学位论文.东北农业大学.2016中所述农杆菌转化方法。
通过农杆菌介导法将gmst1-1基因敲除载体转化抗病大豆品种东农93-046中，具体方法如下：
(1)菌液制备：取制备好的菌液分别在yep固体平板(50mg/mlstr，50mg/mlkan，25mg/mlrif)上划线28℃培养，挑取单菌落接种于yep液体培养基(50mg/mlstr，50mg/mlkan，25mg/mlrif)中，28℃200rpm震荡培养1-2天，取1-2ml菌液接种于50ml新鲜的yep液体培养基中震荡培养至od600为0.6-0.8。
(2)种子灭菌：选取饱满、无菌斑种子于培养皿中，采用氯气灭菌法，将种子放入通风厨的干燥器内，在干燥器的三角瓶中倒入96ml次氯酸钠，再快速加入6ml浓盐酸后迅速盖紧封盖。灭菌16h后置于超净工作台内吹走残留的氯气，大约30min左右，密封待用。
(3)种子萌发：将灭菌后的种子种脐向下种于ms0培养基中，每瓶种10粒，在23℃、16h光照/8h黑暗条件下萌发5-6天。
(4)茎尖外植体的制备：种子萌发至子叶即将冲破种皮时，用镊子和解剖刀去掉种皮，将两半子叶中的一半切掉，用解剖刀轻轻刮掉子叶和生长点之间的腋芽，并在子叶节处轻轻划3-5道伤口，剩余的部分作为外植体用于侵染。
(5)侵染与共培养：将制备好的外植体放入侵染液中进行抽真空处理，抽真空条件为0.6pa，10min。真空侵染后的外植体用灭菌蒸馏水清洗三次，用无菌纸将外植体表面的侵染液吸干，插入ms0培养基中共培养3天，观察复活情况，根据外植体返青的情况确定移栽时间，移栽至土壤中后，置于25℃，16h光照/8h黑暗条件下的培养箱中培养。
c.突变体植株鉴定：取经敲除gmst1基因的大豆植株的t1代叶片以及对照(东农93-046)叶片，提取其dna，进行pcr鉴定，引物为：
casjc-s：5’-aaaagtcccacatcgcttag-3’(seqidno：6所示)；
casjc-a：5’-tgtgcaaggtaagaagatgg-3’(seqidno：7所示)，目的片段为435bp，鉴定出转gmst1-1基因敲除载体的转基因植株。收取t1代中鉴定为转基因植株的大豆种子并种下，提取叶片dna，用单靶点突变检测引物进行pcr检测，正向引物为：gmst1-target1-s:5'-gatcgaccattagcactcta-3'(seqidno：8)；反向引物：gmst1-target1-a:5'-tccttacattcttgacttagc-3'(seqidno：9)。扩增出目的片段121bp并将产物进行测序，如图2所示，测序结果发现有1个阳性植株在靶点处发生了突变，较野生型发生1个碱基缺失(如图3所示)，突变的gmst1基因序列如seqidno：16所示。收取t1代中鉴定为转基因植株的大豆种子并种下，于t2代植株对生真叶完全展开时进行smvn1病毒接种实验，具体方法为：配制0.01mol/l的磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的磷酸缓冲液(ph＝7.0)(10ml/g病毒叶)，将其加入已放病毒叶和少量金刚砂的研钵内，研磨成匀浆状即可。将材料种在灭菌后的土壤里，待对生真叶充分展开后，用毛刷蘸取接种液并沿真叶叶脉摩擦接种，接种后立即用清水冲洗叶片表面致残渣去除。一周后进行第二次接种。
结果发现：接种后敲除gmst1基因的大豆叶片皱缩、出现较多花叶现象，对照大豆植株无明显变化，如图4所示，说明了gmst1基因在所述的靶点区(核苷酸序列为5’agaaaggggaggaaataa3’)发生上述的碱基缺失，使得功能氨基酸发生了变化，从而导致抗病品种东农93-046对花叶病毒的抗性被削弱。
根据gmst1基因以及病毒外壳蛋白基因的序列分别设计定量引物：
gmst1基因定量引物为：正向引物：qgmst1-s:5'-tcccctttctcggattcatt-3'(seqidno：12)；反向引物qgmst1-a:5'-tgccaatcagtactagagatcg-3'(seqidno：13)；病毒外壳蛋白基因smv-cp(genbank登录号:u25673.1)定量引物为：正向引物：smv-cp-s:5’-aggatccaaagaagagcacc-3’(seqidno：14)，反向引物：smv-cp-a:5’-gcctttcagtattttcggagt-3’(seqidno：15)。
利用qrt-pcr的方法对接种花叶病毒的t2代植株进行检测，结果检测到敲除gmst1基因的大豆叶片中gmst1基因的相对表达量低于对照品种，结果见图5。以超过对照2.5倍的相对表达量为基准，获得1株gmst1基因突变的突变的大豆突变体植株，标号为2-1。同时检测到了敲除gmst1基因的大豆叶片中存在的病毒外壳蛋白基因相对表达量高于对照品种。说明敲除gmst1基因会使得抗大豆花叶病毒病品种东农93-046产生一定的感病性。
实施例2.大豆gmst1基因突变体植株的制备方法。
本实施例以第二个靶点为例(靶点核苷酸序列为5’cttcctagggagagaggt3’)位于gmst1编码区第115位至132位碱基处，描述大豆gmst1基因突变体植株的制备方法。
1)根据大豆gmst1基因设计grna单靶点引物。
根据gmst1基因序列(seqidno：1所示)，该基因获得方法同实施例1所述。设计grna单靶点引物。正向引物为gmst1-2-s，5’-ttgcttcctagggagagaggt-3’(seqidno：4所示)，反向引物为gmst1-2-a，5’-aacacctctctccctaggaag-3’(seqidno：5所示)，上述引物经引物合成公司合成获得。
2)制备grna单靶点引物二聚体。
将上述正、反向引物按如下比例混合形成二聚体。gmst1-2-s/a(10μm)各5μl，h2o15μl混合后，进行如下处理：95℃3min；95℃到25℃缓慢冷却；16℃5min。
3)将引物二聚体插入到cas9/grna载体中，构建gmst1基因敲除载体，记为gmst1-2基因敲除载体。
反应体系如下(10μl体系)：16℃过夜反应。
4)将步骤3)构建的gmst1基因敲除载体转化农杆菌，侵染大豆，经鉴定获得大豆gmst1基因突变体植株。
a转化：取上述产物10μl加入到刚解冻的50μltop10感受态中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰上静置2min，再加入500μl无抗lb，置于37℃恒温摇床中，170转，复苏1h后，涂kana抗性的固体平板，37℃过夜培养，挑取3-5个单斑摇菌，进行菌液pcr及测序，如图1所示，所述菌液pcr检测用的引物同实施例1中casjc-s、casjc-a。将测序结果与载体序列进行比对，保存阳性菌液于-80℃备用。
b.根癌农杆菌介导法转化大豆茎尖，参照实施例1中步骤4)中b所述转化方法，经培养后获得植株。
c.突变体植株鉴定：取经敲除gmst1基因的大豆植株的t1代叶片以及对照(东农93-046)叶片，提取其dna，进行pcr鉴定，(引物为上述casjc-s、casjc-a)目的片段为435bp，最终鉴定出转gmst1-2基因敲除载体的转基因植株。收取t1代中鉴定为转基因植株的大豆种子并种下，提取叶片dna，用单靶点突变检测引物进行pcr检测。
正向引物：gmst1-target2-s:5'-agatcgaccattagcactcta-3'，(seqidno：10)；
反向引物：gmst1-target2-a:5'-gacaatggcaaaggtgaga-3'，(seqidno：11)。
扩增出目的片段324bp并将产物进行测序，如图6所示，测序结果发现3株转基因阳性植株在靶点处发生了突变，其中，编号3-1和3-3的植株较野生型发生2个碱基缺失，编号3-2的植株较野生型发生1个碱基缺失；如图7所示。编号3-1植株中突变的gmst1基因的核苷酸序列如seqidno：17所示，编号3-2植株中突变的gmst1基因的核苷酸序列如seqidno：18所示，编号3-3植株中突变的gmst1基因的核苷酸序列如seqidno：19所示。
收取t1代中鉴定为转基因植株的大豆种子并种下，于t2代植株对生真叶完全展开时进行smvn1病毒接种实验(接种方法参照实施例1所述)，结果发现：接种后敲除gmst1基因的大豆叶片皱缩、出现较多花叶现象，对照大豆植株无明显变化，如图4所示，说明了gmst1基因在所述的靶点区(核苷酸序列为5’cttcctagggagagaggt3’)发生上述的碱基缺失后抗病品种东农93-046对花叶病毒的抗性被削弱。
根据gmst1基因以及病毒外壳蛋白基因的序列分别设计定量引物:
gmst1基因定量引物为：正向引物：qgmst1-s5'-tcccctttctcggattcatt-3'(seqidno：12)；反向引物：qgmst1-a5'-tgccaatcagtactagagatcg-3'(seqidno：13)。
病毒外壳蛋白基因smv-cp(genbank登录号:u25673.1)定量引物为：
正向引物：smv-cp-s:5’-aggatccaaagaagagcacc-3’(seqidno：14)；
反向引物：smv-cp-a:5’-gcctttcagtattttcggagt-3’(seqidno：15)。
利用qrt-pcr的方法对接种花叶病毒的t2代植株进行检测，结果检测到敲除gmst1基因的大豆叶片中gmst1基因的相对表达量低于对照品种，结果见图5。以超过对照2.5倍的相对表达量为基准，获得3株gmst1基因突变的突变的大豆突变体植株，同时检测到了敲除gmst1基因的大豆叶片中存在的病毒外壳蛋白基因相对表达量高于对照品种。说明敲除gmst1基因会使得抗大豆花叶病毒病品种东农93-046产生一定的感病性。
核苷酸序列表
<110>东北农业大学
<120>一种大豆gmst1基因突变体植株及其制备方法
<130>
<160>19
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>1035
<212>dna
<213>大豆gmst1基因
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1.一种大豆gmst1基因突变体植株，其特征在于，所述突变体植株含有突变的大豆gmst1基因，所述突变是指gmst1基因编码区中5’agaaaggggaggaaataa3’或5’cttcctagggagagaggt3’核苷酸序列发生碱基取代或缺失，使其编码的氨基酸序列发生改变，所述大豆gmst1基因核苷酸序列如seqidno：1所示。
2.权利要求1所述的大豆gmst1基因突变体植株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)根据大豆gmst1基因设计grna单靶点引物；
2)制备grna单靶点引物二聚体；
3)将引物二聚体插入到cas9/grna载体中，构建大豆gmst1基因敲除载体；
4)将步骤3)构建的gmst1基因敲除载体转化大豆，经筛选获得大豆gmst1基因突变体植株。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述大豆gmst1grna单靶点引物的正向引物为gmst1-1-s，其核苷酸序列如seqidno：2所示，反向引物为gmst1-1-a，其核苷酸序列seqidno:3所示；或者正向引物为gmst1-2-s，其核苷酸序列如seqidno：4所示，反向引物为gmst1-2-a，其核苷酸序列seqidno：5所示。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述制备grna单靶点引物二聚体，是指每20ul合成体系中正向引物5μl，正向引物5μl和h2o15μl，反应条件为95℃3min，冷却至25℃后，16℃静置5min。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述构建gmst1基因敲除载体，是指每10ul反应体系中，引物二聚体1-7μl，cas9/grnavector，1μl，solution11μl，solution21μl，h2o0-6μl，16℃过夜反应。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述gmst1基因敲除载体通过农杆菌介导法转化大豆；所述农杆菌为农杆菌eha105。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述大豆为东农93-046。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述筛选所用正向引物为casjc-s，其核苷酸序列如seqidno：6所示，反向引物为casjc-a，其核苷酸序列如seqidno：7所示，用于筛选阳性突变体植株。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述筛选所用正向引物为gmst1-target1-s，其核苷酸序列如seqidno：8所示，反向引物序列为gmst1-target1-a，其核苷酸序列如seqidno：9所示，用于检测利用引物gmst1-1-s和gmst1-1-a构建获得的大豆gmst1基因突变体植株；或者正向引物为gmst1-target2-s，其核苷酸序列如seqidno：10所示，反向引物为gmst1-target2-a，其核苷酸序列如seqidno：11所示，用于检测利用引物gmst1-2-s和gmst1-2-a构建获得的大豆gmst1基因突变体植株。
10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，对获得的大豆gmst1基因突变体植株中突变的gmst1基因表达量进行qrt-pcr定量检测，所述检测用的正向引物为qgmst1-s，其核苷酸序列如seqidno：12所示，反向引物为qgmst1-a，其核苷酸序列如seqidno：13所示；用于对照的基因为病毒外壳蛋白基因，检测该基因表达量的正向引物为smv-cp-s，其核苷酸序列如seqidno：14所示，反向引物为smv-cp-a，其核苷酸序列如seqidno：15所示。
技术总结