本发明涉及增强子鉴定方法，特别涉及一种高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法。
背景技术：
：增强子是一种重要的顺式作用元件，它在基因组的分布具有不确定性，所调控的靶基因距离也不确定，可位于靶基因启动子上游、基因下游、基因内或基因间区。增强子序列不保守，没有明显序列特征，给鉴定工作带来了困难。增强子与反式作用因子结合发挥作用，它通过招募不同反式作用因子来重塑染色质，改变染色质构象，进而增强子激活靶基因的转录，参与基因表达调控。在植物中通过建立增强子捕获株系突变体库筛选到有功能的增强子。但该方法需要筛选大量的转基因材料，因此研究周期长，结果随机性强和可靠性差。近年来，随着chip-seq、dnase-seq等技术的发展，借助生物信息学的方法越来越多的增强子被预测出来。但现有验证技术不够高效、快捷。技术实现要素：发明目的：本发明目的是提供一种高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法。本发明构建验证增强子活性的表达载体，结合水稻原生质体瞬时转化方法，转化后在共聚焦显微镜下观察转化子中是否有荧光，从而明确增强子活性强弱，同时缩短实验周期。技术方案：本发明提供一种高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法，包括如下步骤：(1)构建载体：正对照载体采用p1300lv载体，同时构建相应的负对照载体；(2)增强子的分离克隆及表达载体构建：选取增强子序列，以水稻基因组dna为模板，pcr扩增得到目的片段，再与bsai酶线性化的负对照载体连接，得到增强子表达载体；(3)制备水稻原生质体；(4)水稻原生质体的转化：将增强子表达载体与水稻原生质体在peg介导下共培养，进行转化；(5)显微镜观察荧光信号。进一步地，所述步骤(1)中负对照载体构建是将p1300lv载体线性化后，pcr扩增启动子序列，得到序列seqidno1，将2个片段连接，筛选阳性转化子，测序验证。所述步骤(1)中使用限制性内切酶ncoi和bamhi酶切p1300lv载体，去掉camv35s启动子，得到线性化载体。所述步骤(1)中采用大肠杆菌dh5α筛选阳性转化子。所述水稻品种为日本晴。所述步骤(2)中bsai酶切位点位于启动子下游，距离启动子约4.5kb。上述技术方案中：在正对照载体p1300lv中camv35s启动子能够启动报告基因gfp表达，在瞬时转化后观察到绿色荧光。负对照载体使用启动子活性较弱的启动子则不能启动报告基因gfp的表达，即在在原生质体转化后检测不到荧光。根据增强子可远距离调控表达的特征，在启动子下游(约4.5kb)插入增强子序列，转化后观察转化子是否有荧光，如果有荧光，则说明增强子有活性。构建选取部分增强子，详细信息见表1。将增强子连接在启动子的下游，如图1所示。原生质体转化后使用共聚焦显微镜进行观察，对增强子的活性进行快速鉴定。有益效果：本发明首次提出了通过水稻瞬时转化验证增强子活性的方法，该方法操作简单，耗时短，能够对生物信息学预测出的增强子进行快速验证，对进一步研究增强子功能提供了重要依据。附图说明图1是增强子验证载体的结构示意图，正对照为camv35s启动gfp表达；负对照为启动子活性较弱的启动子驱动gfp表达；将负对照载体作为骨架载体，通过远端的bsai酶切将候选的增强子整合进来，构建增强子表达载体；图2为是水稻原生质体中增强子的活性检测，其中ck( )、ck(-)，结构如图1所示，osenh1-4为实施例的候选增强子。具体实施方式本实施例的方法如下：1.构建载体正对照载体为p1300lv载体，该载体为camv35s启动子驱动报告基因gfp表达。负对照载体构建方法为：在p1300lv载体中用限制性内切酶ncoi和bamhi将酶切掉camv35s启动子，使载体线性化；pcr扩增启动子序列，得seqidno1，使用连接试剂盒将2个片段快速连接，转化至大肠杆菌dh5α中，筛选阳性转化子，测序验证。载体示意图如图1所示。2.增强子的分离克隆及表达载体构建生物信息学分析方法选取4个增强子序列，命名为osenh1-4。表1为候选增强子及其在染色体上的具体位置。其中osenh1序列参见：wu,changyin&li,xiangjun&yuan,wenya&chen,guoxing&kilian,andrzej&li,juan&xu,caiguo&li,xianghua&zhou,d.-x&wang,shiping&zhang,qifa.(2003).developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.theplantjournal35(3):418-27.10.1046/j.1365-313x.2003.01808.x.osenh2-4增强子序列获得方法：通过dnase-seq研究方法获得水稻基因组开放染色质作图，高通量预测并鉴定了开放染色质区域，结合表观遗传学标记，预测基因组中增强子位点。以水稻日本晴基因组dna为模板，使用特异引物pcr扩增得到目的片段(引物序列见表2)。bsai酶切位点位于启动子下游，距离启动子约4.5kb，将每一个增强子序列与bsai酶线性化的负对照载体连接，得到各自的增强子表达载体。表1本实验的候选增强子编号染色体上位置osenh1chr10:3542500-3543500osenh2chr7:20735655-20735737osenh3chr2:3344121-3344503osenh4chr5:24061158-24061582表2本实验所使用的引物序列引物名称引物序列(5’to3’)osenh1faaggtcgaaaaggtctctcggcggaggcgatgcacgcosenh1ratgtacgtgctatccacaccacaaataacccaatctgosenh2faaggtcgaaaaggtctctgtacttacgcacacactttgosenh2ratgtacgtgctatccacagcttgaattcagatattgctosenh3faaggtcgaaaaggtctctgaaaacagctgcagaaatgcosenh3ratgtacgtgctatccacatgatcttatccaatctgttcosenh4faaggtcgaaaaggtctctgaagagccactcttttatgosenh4ratgtacgtgctatccacataacgaaccttggtcatgcc3.水稻原生质体制备与转化水稻原生质体制备：(1)叶片准备。取无菌培养14天左右生长良好的新鲜水稻植株40-60株，去掉根部，备用。(2)酶解。将水稻叶片和茎段用锋利刀片切成宽度为0.5mm的条状，速度要快，防止叶片脱水，将切好的叶片放入盛有10ml酶解液的培养皿中，置于密闭容器中用真空泵抽真空30min，用封口膜封口，置于转速为60rpm的摇床上25℃黑暗条件下过夜酶解。(3)过滤。将过夜酶解的粗酶液通过预先用2mlw5washingbuffer润洗过的孔径40μm的细胞筛进行过滤，去除酶解不充分的杂质。(4)提纯。将过滤过的细胞酶解液转移到两个15ml离心管中，每管6ml细胞酶解液，用装有长针头的注射器吸取16ml0.55m蔗糖，每管细胞酶解液底部加入8ml0.55m蔗糖，注意：加蔗糖时，针头伸入底部，推动注射器，随着液面升高，缓慢上移注射器，动作要轻柔，防止对原生质体细胞造成破坏。1000g离心5min。(5)清洗。取50ml离心管一个，加入10mlwashingbuffer，置于试管架上。用装有长针头的注射器吸取8mlwashingbuffer，再将针头伸到上步离心后的中间细胞层，慢慢吸取该层的所有原生质体，然后小心转移至盛有10mlwashingbuffer的50ml离心管中。轻弹混匀，100g室温离心5min。(6)重复清洗一次。移除上清，沿壁慢慢加入10mlwashingbuffer，轻弹混匀，100g离心2min。(7)重悬。去掉上清，加入5mlwashingbuffer，注意沿壁缓慢加入，轻弹混匀，使细胞保持悬浮。(8)计数。吸取100μl细胞用于计数，取6-7μl细胞置于细胞计数板进行计数，如果细胞数目太多可采用mgg稀释后再进行计数。(9)细胞稀释。根据计数结果取适量细胞悬浮液进行离心，然后用mggbuffer重悬细胞，最终将细胞稀释至1×106个/ml，用于原生质体转化。水稻原生质体的转化：(1)质粒的准备。采用质粒小提试剂盒进行质粒(正对照载体、负对照载体和增强子表达载体质粒)的提取，确保质粒浓度尽量在500ng/μl以上，整个过程最好为无菌操作。质粒置于-20℃冰箱冻存。使用前以离心机最高转速进行离心10min处理，使杂质沉淀于离心管底部，避免因杂质影响原生质体转化的效率。处理好的质粒用mggbuffer稀释到实验所需质粒浓度，稀释后充分混匀备用。(2)peg介导的转化。每管质粒中加入200μl按照2.2.6制备过程制备的原生质体细胞，轻弹混匀。然后，每管加入210-230μl40％peg(peg加入量与质粒体积相关，确保等体积加入)，轻弹混匀，直至细胞均匀悬浮于peg当中，从第一管加入peg开始计时，计时20min。从第一管加入到最后一管加入的时间尽量控制在5min以内。(3)清洗。加入peg反应20min后，每管加入1mlw5washingbuffer，终止反应，轻轻颠倒混匀，250g离心5min。(4)重复清洗一次。用枪轻轻吸掉上清，重新加入800μlwashingbuffer，轻轻颠倒混匀，150g离心5min，轻轻吸掉上清。(5)细胞重悬与培养。取40mm培养皿加入2mlw5buffer，再取培养皿中的w5buffer重悬离心管中的细胞，并全部转移至培养皿中，25℃黑暗培养，两天后在显微镜下观察荧光。4.激光共聚焦显微镜观察使用激光共聚集显微镜进行观察。gfp使用的激发波长分别为：488nm，吸收波长为490-540nm。所有的荧光实验至少重复三次。观察结果如图2所示。图2中可知，与负对照相比，带有增强子的转化子中有明显的荧光信号，其中osenh1、osenh2荧光信号相对较强。序列表<110>扬州大学<120>一种高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>229<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1acttgggaggtggggaggctagggtttcagcgctccgatgcgtttctggccgtcggattt60gatctgatccggagtattattcatccaagtcccacacaaacctctaatactcgttaacca120tccctgaggggaggactacgtagaatgttttcaaataagcatatttgaaagggccaaatt180acaaagtagcacagggagtcatagcagcggtggaatagaatcgagtcat229当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)构建载体：正对照载体采用p1300lv载体，同时构建相应的负对照载体；
(2)增强子的分离克隆及表达载体构建：选取增强子序列，以水稻基因组dna为模板，pcr扩增得到目的片段，再与bsai酶线性化的负对照载体连接，得到增强子表达载体；
(3)制备水稻原生质体；
(4)水稻原生质体的转化：将增强子表达载体与水稻原生质体在peg介导下共培养，进行转化；
(5)显微镜观察荧光信号。
2.根据权利要求1所述的高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法，其特征在于：所述步骤(1)中负对照载体构建是将p1300lv载体线性化后，pcr扩增启动子序列，得到序列seqidno1，将2个片段连接，筛选阳性转化子，测序验证。
3.根据权利要求1所述的高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法，其特征在于：所述步骤(1)中使用限制性内切酶ncoi和bamhi将p1300lv载体剪切线性化。
4.根据权利要求1所述的高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法，其特征在于：所述步骤(1)中采用大肠杆菌dh5α筛选阳性转化子。
5.根据权利要求1所述的高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法，其特征在于：所述水稻品种为日本晴。
6.根据权利要求1所述的高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法，其特征在于：所述步骤(2)中bsai酶切位点位于启动子下游，距离启动子约4.5kb。
技术总结本发明公开了一种高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法，包括如下步骤：(1)构建载体：正对照载体采用p1300LV载体，同时构建相应的负对照载体；(2)增强子的分离克隆及表达载体构建：选取增强子序列，以水稻基因组DNA为模板，PCR扩增得到目的片段，再与BsaI酶线性化的负对照载体连接，得到增强子表达载体；(3)制备水稻原生质体；(4)水稻原生质体的转化：将增强子表达载体与水稻原生质体在PEG介导下共培养，进行转化；(5)显微镜观察荧光信号。本发明方法首次提出了通过水稻瞬时转化验证增强子活性的方法，高效，快捷。
技术研发人员：张韬;李鑫琪;刘鹏
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：2020.03.30
技术公布日：2020.06.09
