本发明属于基因递送
技术领域：
，具体涉及一种基因递送的方法。
背景技术：
：超声靶向递送技术(ultrasoundtargetedmicrobubbledestruction,utmd)为我们提供了一个安全有效的基因递送工具。随着超声造影剂的不断发展，utmd应用于基因递送的实例逐渐增多。相对于其他非病毒类基因递送技术，utmd介导的基因递送具有操作相对简单和无创两大优点。然而，成功实现基因递送的关键在于，保护基因在递送过程中免受血流剪切力作用及dna酶的降解，以及定点、定向释放携载的基因至靶细胞发挥作用。utmd的基本原理为：在超声微泡表面或者内部携带基因，在体外局部应用超声辐照，产生空化作用，提高细胞膜的通透性，有效促进基因向胞内递送。超声微泡作为一种新型的非病毒载体应用于基因治疗，已经被国内外众多学者所采用，与病毒载体相比，这种人工合成的基因“运输工具”，具有低免疫原性、基因载量大、容易制备、成本低等优点。有研究利用utmd技术递送mir-126-3p，有效地降低靶基因的表达，提高了慢性贫血骨骼肌模型中的血管密度。在肿瘤方面，通过utmd介导靶向lncrna-atb的sirna转染肝癌细胞，成功下调了lncrna-atb的表达，抑制了肝癌细胞的转移和侵袭，另外，研究表明utmd介导的sirna转染的效率要高于脂质体转染。因此，研发一种提高基因递送效率的基因载体及其相关制备方法是具有应用前景的。技术实现要素：本发明的一个目的是建立一种阳离子脂质微泡制备方法，以获得高基因递送效率的微泡。本发明的另一个目的是提供一种安全、有效、省时省力的基因体外递送方法，满足体外基因功能研究的需求。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：一种阳离子脂质微泡的制备方法，包括如下步骤：(1)取dspc，dspe-peg2000，dotap，溶于有机溶剂中配制成溶液，将溶液超声处理，装入瓶中；(2)去除步骤(1)配制的溶液的有机溶剂，再往瓶中加入缓冲液；(3)将步骤(2)加入缓冲液后的瓶中空气置换为全氟丙烷，震荡瓶中溶液，获得阳离子脂质微泡，4℃保存。进一步地，所述步骤(1)中dspc，dspe-peg2000，dotap，有机溶剂的用量之比为9mg：2mg：1mg：1ml；所述步骤(1)中有机溶剂是氯仿。进一步地，所述步骤(1)中溶液置于超声水浴锅中，超声处理30s。进一步地，步骤(1)中配制的溶液分装在4个小瓶中，所述步骤(2)中将4个小瓶放置在旋转蒸发仪中，在65℃下旋转蒸发1h，使有机溶剂完全挥发，每个小瓶中均加入800μl含甘油的pbs缓冲液；步骤(2)中缓冲液是含甘油的pbs缓冲液，甘油的质量与pbs缓冲液的体积之比是0.2％。进一步地，所述步骤(3)中溶液在vialmixtm银汞调和器中剧烈震荡45s，获得阳离子脂质微泡悬液。阳离子脂质微泡介导的基因递送方法，包括如下步骤：(a)基因转染前一天，将1×105个mda-mb-231细胞/孔接种于含10％胎牛血清的dmem培养基中，置于24孔板中孵育24h，当细胞汇合度达到80％，将培养基换液至300μl无血清培养基opti-mem；(b)10μl阳离子脂质微泡和10ug表达绿色荧光蛋白的质粒pegfp或者300mmmir-34amimics或者300mmmir-34a孵育10min，得到阳离子脂质微泡-目的基因混合物；(c)将步骤(b)所得的混合物添加到步骤(a)孵育的细胞中，补充培养基至终体积500μl，轻轻地摇动24孔板培养板，放在超声探头上；(d)在24孔板底部和超声探头之间的空隙中充满经消毒的蒸馏水，设置超声强度、占空比和辐照时间参数，启动sonovitro仪器，进行超声辐照转染；(e)转染后，将细胞放在co2浓度为5％，温度为37℃的细胞培养箱中培养10min，然后换液为新鲜的含10％胎牛血清的dmem培养基，培养24h。优选地，所述步骤(d)超声强度是0.6w/cm2。优选地，所述步骤(d)占空比是20％.优选地，所述步骤(d)辐照时间是20s。与现有技术相比，本发明的有益效果为：超声微泡介导的基因转染过程涉及多种机制，空化作用在其中起着关键作用。在空化作用下，产生强驻波和微射流，并在细胞表面形成纳米尺度的孔隙，从而提高细胞膜的通透性，有利于基因导入细胞。超声微泡处理后细胞膜立即出现小孔，约30min后封闭，细胞形态恢复正常。当然，超声强度(acousticintensity，ai)、占空比(dutycycle，dc)和辐照时间(exposuretime，et)这些超声参数是经过优化的。尤其当ai超过1.0w/cm2时，细胞受到明显的不可逆损伤，细胞存活率显著下降。在系统性地研究不同因素的基础上，将pegfp质粒dna转染mda-mb-231细胞，评价utmd系统的效率。本发明通过这种超声微微泡递送方法，pegfp可以有效地转移到细胞中，表达绿色荧光蛋白。流式细胞仪检测结果显示转染率达40％以上。此外，mir-34amimics被用来证明该方法的灵活性。mir-34amimics可以有效抑制乳腺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，此外，下游蛋白包括notch1和hes1被mir-34a下调。综上所述，本发明提供了一个超声微泡递送基因的方法，本发明采用阳离子脂质微泡 超声的方法转染pegfp和mir-34amimics。其中，mir-34amimics能有效抑制mda-mb-231细胞。此外，下游蛋白包括notch1和hes1被mir-34a下调。该系统具有进一步体内基因治疗研究的潜力。附图说明图1为超声微泡转染系统安装示意图，其中，sonovitro设备由盖子(1)、水箱(2)、超声探头(3)和控制面板(5)组成，探头中心放置24孔板(4)中培养的细胞；培养板下面装满消毒过的蒸馏水；图2为utmd转染实验流程图；图3为不同超声参数对细胞活性的影响实验图，其中，图a表示辐照时间对细胞活性的影响；图b表示超声强度对细胞活性的影响，图c表示占空比对细胞活性的影响；图4为超声、阳离子脂质微泡对mda-mb-231细胞凋亡的影响实验图，其中，图a表示采用流式细胞术检测untreated(未处理组)、us(超声处理组)、cmbs(阳离子脂质微泡处理组)和us cmbs(超声处理 阳离子脂质微泡组)诱导的细胞凋亡并进行比较的实验图；图b是凋亡率以annexinv阳性细胞占总细胞的百分比表示的实验图。图5为超声微泡作用于细胞后不同时间细胞膜结构变化的实验图。其中，图a：对照组的实验图；图b：单纯超声作用后5min的实验图；图c：utmd作用后0min的实验图；图d：utmd作用后5min的实验图；图e：utmd作用后15min的实验图；图f：utmd作用后30min的实验图；图6是不同声强utmd处理对细胞膜影响的实验图。图7为pegfp质粒dna转染后的结果实验图。图a为荧光显微镜下观察结果实验图；图b为流式定量结果实验图。图8为mir-34amimics定位分析和定量实验图。图a为不同实验组处理24h后细胞摄取cy5标记的mir-34amimics(红色)实验图；图b为mir-34a的rt-qpcr定量实验图。图9为mda-mb-231细胞增殖与凋亡分析实验图。其中，图a为mir-34amimics对mda-mb-231细胞增殖的抑制作用实验图；图b为流式细胞术检测mir-34amimics诱导的细胞凋亡实验图；图c为annexinv阳性细胞占总细胞的百分比实验图。图10为mda-mb-231细胞中notch1和hes1表达的分析实验图。utmd转染microrna-34amimics48h后，westernblot检测notch1和hes1蛋白表达情况。具体实施方式下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。实施例一、阳离子脂质微泡的制备及检测其表征本发明提供了阳离子脂质微泡的制备及检测其表征的方法，包括如下步骤：(1)精确称量9mgdspc，2mgdspe-peg2000和1mgdotap，溶于1ml氯仿中配制成溶液，将溶液放置于超声水浴锅中，超声处理30s，之后将溶液分装在4个小瓶中，每瓶250μl；(2)将步骤(1)配制的4个小瓶溶液放置在旋转蒸发仪中，在65℃下旋转蒸发1h，使氯仿完全挥发；每个小瓶中均加入800μl含甘油的pbs缓冲液，甘油的质量与pbs缓冲液的体积之比是0.2％；(3)将步骤(2)的小瓶中的空气置换为全氟丙烷；溶液在vialmixtm银汞调和器中剧烈震荡45s，获得阳离子脂质微泡悬液；(4)将步骤(3)中的阳离子脂质微泡悬液在4℃冰箱中放置1h左右后，取适量阳离子脂质微泡悬液，加入0.5mlpbs稀释，实施例二、细胞转染过程中的超声参数优化为了明确转染过程中超声辐照时间、超声强度和占空比对细胞活性的影响，试验采用不同超声辐照时间、超声强度和占空比进行mda-mb-231细胞转染实验，采用cck-8实验检测细胞活性，超声辐照时间、超声强度和占空比对各项所取参数如下表1-表3所示：表1超声辐照时间空白20s40s60s细胞活性100％95％93％92％表2声强空白cmb0.60.81.01.2细胞活性100％95％94％92％89％80％表3占空比空白15％20％25％30％35％细胞活性100％98％98％93％92％90％可见对细胞活力影响最小的参数如下：超声辐照20s，细胞活性最强；声强0.6w/cm2，细胞活性最强；占空比20％，细胞活性最强，结果如图3所示。因此，后续实验采用的超声辐照参数采用该对细胞活力影响最小的参数。实施例三、细胞凋亡检测为了明确超声结合阳离子脂质微泡转染细胞对细胞凋亡是否有影响，试验分了4个实验组，分别是：未处理组(untreated)，mda-mb-231细胞没有经过任何处理；超声处理组(ultrasound，us)，0.6w/cm2ai、20％dc和20set条件下超声处理mda-mb-231细胞；阳离子脂质微泡处理组(cationicmicrobubbles，cmbs)：采用本发明制备的阳离子脂质微泡与mda-mb-231细胞混合，进行转染；超声 阳离子脂质微泡处理组(us cmbs)：采用本发明制备的阳离子脂质微泡，0.6w/cm2ai、20％dc和20set条件下超声处理mda-mb-231细胞；通过annexin-v/pi染色和流式细胞术评估了上述各组实验组的细胞凋亡情况。如图4所示，其中的差异无统计学意义，因此超声处理 阳离子脂质微泡组(us cmbs)与未处理组(untreated)、超声处理组(us)和阳离子脂质微泡处理组(cmbs)相比，超声处理 阳离子超声微泡组(us cmbs)对细胞凋亡无明显影响。实施例四、超声微泡声孔效应分析为分析阳离子脂质微泡 超声的声孔效应，试验分3个实验组，分别是：空白对照组：mda-mb-231细胞没有经过任何处理；超声组：0.6w/cm2ai、20％dc和20set条件下超声处理mda-mb-231细胞；超声 微泡组：采用本发明制备的阳离子脂质微泡，0.6w/cm2ai、20％dc和20set条件下超声处理mda-mb-231细胞，即utmd处理；采用电镜观察对照组及超声辐照后的超声组、超声辐照后的超声 微泡组在不同时间点细胞膜结构的变化。如图5所示，图中a是对照组的状态；b是超声组超声作用后5min的状态，c是超声 微泡组utmd作用后0min的状态；d是超声 微泡组utmd作用后5min的状态，e是超声 微泡组utmd作用后15min的状态，f是超声 微泡组utmd作用后30min的状态，由图中可知：与对照组及超声组相比，超声 微泡组可以明显观察到其细胞膜上出现大量小孔，尤其在utmd作用后的5min内细胞膜上小孔数量最多，当时间超过15min后，细胞上的小孔逐渐减少。可见阳离子脂质微泡联合超声具有一定的声孔效应，可以在细胞膜上穿孔，提高细胞膜的渗透性，有助于基因进入细胞。随着声强的增大，细胞膜上小孔数量有所增加，如图6所示，均是超声作用5min后的不同实验组的实验图，其中a：对照组；b：超声组；c：0.4w/cm2 30μl微泡；d：0.6w/cm2 30μl微泡；e：0.8w/cm2 30μl微泡；f：1.0w/cm2 30μl微泡。需要说明的是图5和图6图中显示的尺寸是5μm实施例五、质粒dna转染现采用本发明转染方法(utmd)转染mda-mb-231细胞，大概流程如图2所示。详细操作过程如下：(1)转染之前，将1×105个mda-mb-231细胞/孔接种于含10％胎牛血清的dmem培养基中，置于24孔板中孵育24h，当细胞汇合度达到约80％，将培养基换液至300μl无血清培养基(opti-mem)；(2)10μl阳离子脂质微泡和10μgpegfp质粒dna混合孵育10min，得到阳离子脂质微泡-质粒混合物；(3)取10μg步骤(2)的阳离子脂质微泡-质粒混合物加入步骤(1)孵育的mda-mb-231细胞中，补充培养基至终体积500μl，轻轻地摇动24孔板培养板，放在sonovitro仪器的超声探头上；(4)在24孔板底部和超声探头之间的空隙中充满经消毒的蒸馏水，按照实施例二优化所得的超声参数设置超声强度、占空比和辐照时间参数，启动sonovitro仪器，进行超声辐照转染；如图1所示，sonovitro设备由盖子1、水箱2、超声探头3和控制面板5组成，探头中心放置24孔板4中培养的细胞。24孔板4下面装满消毒过的蒸馏水。(5)转染后，将细胞放在co2浓度为5％，温度为37℃的温箱中培养；10min后，换液至500μl含10％胎牛血清的dmem培养基，放入温箱中继续培养24h；荧光显微镜下观察转染效率。显微镜观察发现，如图7所示，在该条件下，转染mda-mb-231细胞，表达绿色荧光蛋白的细胞数量显著增多，流式细胞术定量结果表明，转染率可以达到46.8％。实施例六、超声 阳离子脂质微泡递送mir-34amimics为研究本发明方法能否将mir-34amimics高效转染mda-mb-231细胞，本试验合成cy5标记的mir-34amimics，且分了4个试验组：未处理组：mda-mb-231细胞没有经过任何处理；超声组：超声 cy5标记的mir-34amimics对mda-mb-231细胞进行处理，参考上述实施例五pegfp质粒dna转染的操作过程，不同的是，步骤(3)中的操作步骤加入mda-mb-231细胞的只有300mmcy5标记的mir-34amimics；微泡组：阳离子脂质微泡 cy5标记的mir-34amimics对mda-mb-231细胞进行处理；参考上述实施例五pegfp质粒dna转染的操作过程，不同的是，只往mda-mb-231细胞加入阳离子脂质微泡和300mmcy5标记的mir-34amimics的混合物，不进行超声处理。超声 微泡组：超声 阳离子脂质微泡 cy5标记的mir-34amimics对mda-mb-231细胞进行处理，转染方法参照上述实施例五pegfp质粒dna转染的操作过程。不同的是，往mda-mb-231细胞加入阳离子脂质微泡和300mmcy5标记的mir-34amimics的混合物，进行超声处理。试验证明，如图8的a所示，cy5标记的mir-34amimics可以在超声 阳离子脂质微泡的帮助下进入细胞，单纯依靠超声或阳离子脂质微泡则无法使mir-34amimics进入细胞。使用rt-qpcr进一步定量检测mir-34a,如图8的b所示，utmd组mir-34a表达较其他组增加约2倍。实施例七、mir-34amimics对mda-mb-231细胞的作用为验证本发明方法(utmd)转染的mir-34amimics的功能，采用cck-8检测细胞增殖。在utmd转染后3天，mda-mb-231细胞增殖较mir-nc组明显受到抑制。采用流式细胞术检测mir-34a诱导的细胞凋亡，结果如图9所示，与mir-nc组相比，utmd转染的mir-34amimics明显促进细胞凋亡，凋亡率约为25％。最后，用westernblot检测mir-34a的靶蛋白notch1及其靶蛋白hes1的表达情况，如图10所示，mir-34amimics降低了notch1和hes1的表达。上述中，将pegfp质粒dna或mir-34amimics导入mda-mb-231细胞，并对相关因素进行了研究。可以得知，本发明utmd可以高效转染pegfp和mir-34amimics。且，在mda-mb-231细胞中，还研究了utmd传递的mir-34a的功能。结果表明，该方法有进一步体内基因治疗研究的潜力。以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种阳离子脂质微泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取dspc，dspe-peg2000，dotap，溶于有机溶剂中配制成溶液，将溶液超声处理，装入瓶中；
(2)去除步骤(1)配制的溶液的有机溶剂，再往瓶中加入缓冲液；
(3)将步骤(2)加入缓冲液后的瓶中空气置换为全氟丙烷，震荡瓶中溶液，获得阳离子脂质微泡，4℃保存。
2.如权利要求1所述的一种阳离子脂质微泡的制备方法，其特征在于，
所述步骤(1)中dspc，dspe-peg2000，dotap，有机溶剂的用量之比为9mg：2mg：1mg：1ml；
所述步骤(1)中有机溶剂是氯仿。
3.如权利要求1所述的一种阳离子脂质微泡的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中溶液置于超声水浴锅中，超声处理30s。
4.如权利要求1所述的一种阳离子脂质微泡的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中配制的溶液分装在4个小瓶中，所述步骤(2)中将4个小瓶放置在旋转蒸发仪中，在65℃下旋转蒸发1h，使有机溶剂完全挥发，每个小瓶中均加入800μl含甘油的pbs缓冲液；
步骤(2)中缓冲液是含甘油的pbs缓冲液，甘油的质量与pbs缓冲液的体积之比是0.2％。
5.如权利要求1所述的一种阳离子脂质微泡的制备方法，其特征在于，
所述步骤(3)中溶液在vialmixtm银汞调和器中剧烈震荡45s，获得阳离子脂质微泡悬液。
6.如权利要求1所述的阳离子脂质微泡介导的基因递送方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(a)基因转染前一天，将1×105个mda-mb-231细胞/孔接种于含10％胎牛血清的dmem培养基中，置于24孔板中孵育24h，当细胞汇合度达到80％，将培养基换液至300μl无血清培养基opti-mem；
(b)10μl阳离子脂质微泡和10ug表达绿色荧光蛋白的质粒pegfp或者300mmmir-34amimics或者300mmmir-34a孵育10min，得到阳离子脂质微泡-目的基因混合物；
(c)将步骤(b)所得的混合物添加到步骤(a)孵育的细胞中，补充培养基至终体积500μl，轻轻地摇动24孔板培养板，放在超声探头上；
(d)在24孔板底部和超声探头之间的空隙中充满经消毒的蒸馏水，设置超声强度、占空比和辐照时间参数，启动sonovitro仪器，进行超声辐照转染；
(e)转染后，将细胞放在co2浓度为5％，温度为37℃的细胞培养箱中培养10min，然后换液为新鲜的含10％胎牛血清的dmem培养基，培养24h。
7.如权利要求6所述的阳离子脂质微泡介导的基因递送方法，其特征在于，
所述步骤(d)超声强度是0.6w/cm2。
8.如权利要求6所述的阳离子脂质微泡介导的基因递送方法，其特征在于，
所述步骤(d)占空比是20％。
9.如权利要求6所述的阳离子脂质微泡介导的基因递送方法，其特征在于，
所述步骤(d)辐照时间是20s。
技术总结本发明公开了一种阳离子脂质微泡的制备及其介导的基因递送方法，制备步骤包括取DSPC，DSPE‑PEG2000，DOTAP，溶于有机溶剂中配制成溶液，将溶液超声处理，装入瓶中，去除有机溶剂加入缓冲液；瓶中空气置换为全氟丙烷，震荡制得阳离子脂质微泡，4℃保存；递送方法是：转染前培养细胞，阳离子脂质微泡和目的基因孵育，然后加入细胞，超声辐照转染，转染后培养过夜。本发明的优点有：提供了一种高基因递送效率的微泡，为UTMD介导的基因体外递送提供了解决方案操作相对简单无创两大优点，提高了基因转染效率。
技术研发人员：陈智毅;王奕;张辉;刘付春;李悦
受保护的技术使用者：广州医科大学附属第三医院(广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院)
技术研发日：2020.01.18
技术公布日：2020.06.09
