本发明涉及生物医学研究领域中的靶向肿瘤细胞的基因编辑范畴，具体来说，本发明涉及一种快速获得基因编辑肝癌细胞株的方法。
背景技术：
肝癌是死亡率占世界第二位的最高发癌症。在我国，肝癌的发病率和死亡率很高，严重危害着国民的身体健康及生活质量。因此，对肝癌发病机制的研究，成为肿瘤生物学研究的热点之一。肝癌是一种基因异常疾病，在癌细胞中形成了数百或数千的突变，使得dna测序技术确定致癌突变基因的挖掘困难重重。此外，许多肝癌调控基因难以通过测序发现，因为它们不发生突变，而是在癌症中通过其他方式失调控。确定肝癌细胞中的突变基因功能，了解它们的突变致癌的机制以及调控肝癌发生发展过程的重要基因功能是一个重大的挑战。常需要建立细胞模型将目标基因做敲除处理，体外探讨相关基因缺失后的变化，从而了解该基因的功能。
crispr/cas是细菌和古细菌在自然界生物长期的进化过程中，演化出了一种独特的适应性免疫系统。在该系统中，一种称之为cas的限制性内切酶能在短链rna的引导下，靶向降解外来入侵的dna或rna，人们将这一系统命名为crispr/cas，即成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关基因(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsandcrispr-associatedgenes,crisprcas)。这一成簇规律间隔的短回文重复序列于1987年首先在大肠杆菌escherichiacoli染色体上被发现，然而其蕴藏的生物学意义并没有立即被人们所了解。之后的研究显示，crispr其实在绝大多数细菌和古细菌中都普遍存在。直到2005年，crispr与抗病毒免疫之间的联系才逐渐被人们认识到，随着科学家们的不断发现，直到2012年crispr的相关作用机理被真正的了解清楚，开始把它应用于基因编辑领域。2013年，crispr-cas9开始被作为一种基因编辑技术而被广泛使用。
现有的crispr/cas9系统实验构建方案：(1)基于dna载体的实验方案。载体通过转染进入细胞后，u6启动子转录出sgrna,cas9基因在细胞内需要转录翻译等多个过程才能表达出cas9蛋白，两者结合在胞内寻找识别目的序列达到基因编辑的作用。(2)基于sgrna和mrnamix的实验方案。sgrna设计及人工合成后，通过将cas9的mrna、人工合成的sgrna以及混合体直接转染或者注射到待编辑细胞中来提高筛选效率。其原理是由于有些细胞难以通过常规转染的方式导入外源dna片段，然而通过此方式可以直接将充足的所需基因编辑元件导入细胞体内，达到基因编辑的目的。该方案转染dna进入细胞，避免了dna进入细胞后的发生基因重组的可能。该方法的另一个重要目的是由于这样避免了cas9在体内的持续表达，从而减少了cas9发挥作用的时间，由此减少脱靶的产生。(3)sgrna和cas9protein复合物的实验方案。获得活性验证过的cas9核酸内切酶，在胞外将sgrna和cas9核酸内切酶混合后，采用特殊转染方法转染或者显微注射进入细胞发挥作用。尽管后两种方式各有一定优势，但其无论从操作技术、试验设备及仪器条件、试验对绝大部分实验室的友好程度(可操作性)都有过高要求，普通实验室很难均满足各项要求，因此，第一种方式适合大部分实验室自主操作实施。然而，第一种方式由于载体携带的sgrna有限，目前肝癌细胞系的基因编辑效率仍不理想，亟需一种新的方法可以使广大实验室都能高效快速的获得基因编辑的肝癌细胞株。因此，应用本发明的最终目标是，建立一种快速高效的基因编辑肝癌细胞株的方法，为广大实验室建立肝癌体外研究模型奠定基础。
目前在药筛导入sgrna和cas9后的肝癌细胞株获得基因编辑阳性细胞株的效率很不理想，通过高效的细胞单克隆化是本发明克服这一障碍的技术进步，为后续快速建立基因编辑肝癌细胞株奠定坚实基础。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种以肝癌细胞作为靶细胞，利用慢病毒介导sgrna实现快速编辑肝癌细胞基因的方法。该细胞株可作为细胞模型，用于研究基因对肝癌的发生发展的调控机制。
本发明将crispr/cas9技术进行改良，通过构建表达效率更佳的重组质粒，结合快速单克隆培养，构建稳定敲除基因的肝癌细胞株。由于采用了优化的crispr/cas9技术，在敲除质粒构建时具有简便、高效及易于在绝大部分实验室可操作的优势。
本发明提供的一种快速建立crispr基因编辑肝癌细胞株的方法，包括如下步骤：
(1)sgrna的设计及选取：确定物种(如人或鼠)及要编辑的目标基因序列，从ncbi中下载基因的基因组序列并对结构进行分析，找到转录起始区域，将靶位点处选取250bp序列作为sgrna设计序列，该sgrna序列由张锋实验室在线设计网站http://crispr.mit.edu/设计，并对sgrna在基因组中的位置及脱靶效率进行加权筛选，根据sgrna在线设计软件选取候选的sgrna。
针对不同的敲除片段位点，在靶片段两端(分别在上游和下游)设计一对sgrna，两条sgrna间隔在250bp左右，以防止基因组片段被过长剪切后发生染色体变异的问题。以lentivirusv2慢病毒载体为骨架，采用两轮pcr扩增的方法获得待插入片段，随后，使用esp3i限制性内切酶酶切插入片段及载体，经t4dna连接酶连接后，构建出同时带有敲除基因片段上下游的两条sgrna的重组敲除质粒。
以下进行两轮pcr扩增的具体步骤：
为了获得最终含有两条sgrna的插入片段，将最终的插入片段分为三部分进行pcr。其插入片段的结构是，sgrna1 间隔序列 sgrna2。第一轮pcr分别获得sgrna1 部分间隔序列和部分间隔序列 sgrna2，这两个产物。然后，将以上两个产物等比例混合，稀释100倍作为第二轮pcr的模板。每一条插入片段需要设计四条pcr引物。四条pcr引物中，primeri和primeriv分别带有一条sgrna(sgrna1或sgrna2)。
如下示例，sgrna模式为n(20)。而primerii和primeriii为通用引物，在合成其他插入片段用于敲除其他基因时序列不变。片段sgrna1 部分间隔序列是由primeri(特异引物)和primerii(通用引物)扩增获得，片段部分间隔序列 sgrna2是由primeriv(特异引物)和primeriii(通用引物)扩增获得。
带有sgrna(sgrna1或sgrna2)片段的特异性扩增引物序列为：
primeri5′-cgtctcgcaccgnnnnnnnnnnnnnnnnnnnngttttagagctagaaatag-3′
primeriv5′-cgtctccaaacannnnnnnnnnnnnnnnnnnncggtgtttcgtcctttccac-3′
其中，n代表sgrna序列。
另外两条通用引物序列为：
primerii5′-caaaaaagcaccgactcggtgccactttttc-3′
primeriii5′-agtcggtgcttttttgcctatttcccatgattcc-3′
以lentivirusv2骨架质粒为模板，插入片段的合成过程：
第一轮pcr使用引物primeri和primerii，获得pcr产物为115bp；
使用引物primeriii和primeriv，获得pcr产物293bp。
最终，以稀释100倍的第一轮pcr产物混合液为模板，第二轮pcr使用特异性引物primeri和primeriv完成最终的pcr，获得一段386bp的插入片段，用于后续质粒连接。
以上获得插入片段的方法技术优势在于，该方法非常快速便捷，成本低。获得的插入片段最终按图1方式连入载体。
(2)采用pcr产物回收纯化试剂盒将上述pcr产物去除引物及杂质后，电泳检测。
(3)采用esp3i酶对慢病毒表达空载体lentvirusv2进行酶切，胶回收线性载体作为骨架载体。
(4)利用t4dna连接酶将步骤(1)中获得的插入片段与步骤(3)中回收的线性载体lentvirusv2于25℃连接2h，构建重组质粒。
(5)将上述连接反应液按1：10的比例转化e.coli感受态细胞stbl3，涂布转化后的菌液于氨苄青霉素抗性的lb固体培养皿中，37℃培养16h；次日挑取直径较大的单菌落，用1.5ml离心管震荡培养5h后，进行菌液pcr鉴定，将阳性菌用15ml离心管扩大培养，离心收集菌体，提取重组质粒，酶切质粒进行第二次鉴定。对鉴定阳性的质粒，采用自行设计的检测引物lv2-3进行测序验证，需在测序结果中精确找到sgrna序列。测序引物lv2-3序列为：5′-ctcctttcaagacctagctagc-3′。
(6)细胞转染前24-48h，在100mm培养皿中接种1-10×105个每毫升hek293t细胞，待次日细胞汇合度达到50-70％用于转染。
(7)细胞转染实验。采用包装慢病毒侵染的方法，将病毒包装质粒pvsvg及pspa×2与步骤(5)获得的阳性重组质粒与按照1：9：10的质量比例混合(总质量4-8μg)，添加到500μlopti-mem基本培养基或无双抗无血清的dmem培养基中，再按1：4(质粒质量：转染试剂)的比例加入转染试剂，混匀、室温静置30min；同时，将hek293t细胞除去旧培养基，用5ml1×pbs轻柔清洗1次，添加无双抗、无血清的dmem培养基2-3ml，再将上述转染试剂及质粒的孵育液，逐滴添加到hek293t细胞中，放入37℃5％co2的培养箱中培养；3-6h后取出培养皿，补加8-10ml含1％双抗和10％血清的dmem培养基，放入培养箱中继续培养。
(8)培养48-72h，收集含有病毒的培养基，使用0.45μm无菌滤膜过滤培养基，获得的滤液即为病毒液。该病毒液可以直接使用或浓缩后使用，也可放置-80℃长期保存。
(9)病毒侵染实验前24-48h，在60mm培养皿中接种肝癌细胞，依据不同细胞生长速度的不同接种量为6-10×105个细胞每毫升，次日细胞汇合度约50-70％。
(10)病毒侵染。取出肝癌细胞培养皿，去除细胞培养基，更换为3ml含1％双抗和10％血清的dmem培养基，将步骤(8)中获得的病毒液添加到上述靶细胞培养皿中，每皿添加4ml，加入6-10μl聚凝胺(polybrene)，在37℃、5％co2培养箱中继续培养24h。
(11)次日从培养箱中取出上述培养皿，除去含有病毒的培养基，换用10ml含1％双抗和10％血清的dmem培养基继续培养。
(12)培养24-48h以后，在显微镜下可见细胞生长较为密集。用0.25％的胰蛋白酶1ml每10cm培养皿的比例将肝癌细胞消化下来，离心后全部重新接种在新的100mm培养皿中，在10ml含1％双抗和10％血清的dmem培养基中依靶细胞种类添加合适量的嘌呤霉素进行阳性细胞株预筛选。每隔三天更换一次含有等浓度puromycin的相同的dmem培养基。连续筛选3-7天。
(13)细胞单克隆的筛选。将预筛选3-7天的细胞(极低密度)用胰酶消化后，以每孔1-2个细胞的密度重稀释后均匀接种至96孔板，培养至显微镜镜检能观察到细胞单克隆。
(14)阳性细胞株的鉴定。将细胞单克隆用胰酶消化后依次经历24孔板、12孔板和6孔板，扩大培养。选取一部分细胞提取基因组dna，用检测引物通过pcr检测该基因是否敲除成功，找到敲除成功的阳性克隆，分别采用1)对pcr片段测序，一代测序鉴定敲除掉的序列，并且2)westernblot检测，鉴定阳性细胞基因组中基因的敲除效果以及靶蛋白表达量的降低，证明基因敲除的肝癌细胞株构建成功，最终获得敲除成功的细胞系。采用该方法，基因敲除效率可达90％以上，并且稳定性好。
(15)与现有技术相比，本发明通过优化的crispr/cas9基因编辑技术，能高效获得基因敲除的稳定肝癌细胞株，本发明的实验靶细胞适用于全部肝癌细胞系以及其他肿瘤(如乳腺癌)敲除细胞系的快速建立，其靶标癌细胞培养条件可依据该具体癌细胞系进行相应调整。
附图说明
图1：同时含有两条用于基因敲除的sgrna的重组质粒模式图。
图中所示，u6为人类u6启动子序列。双箭头的序列依次表示：u6启动子、sgrna1、u6启动子、sgrna2，sgrna1和sgrna2分别为两条sgrna序列。其中sgrna1代表primeri，序列为5′-cgtctcgcaccgnnnnnnnnnnnnnnnnnnnngttttagagctagaaatag-3′中的n(20)；sgrna2代表primeriv，序列为5′-cgtctccaaacannnnnnnnnnnnnnnnnnnncggtgtttcgtcctttccac-3′中的n(20)。
图2：敲除人cpq基因的lm3细胞系在倒置显微镜(40倍放大)中的细胞单克隆。
图3：敲除人cpq基因的lm3稳定细胞系的pcr鉴定图。由于检测引物设计在位于敲除丢失部分内会导致pcr无扩增产物，若敲除成功则无pcr产物。图为采用两对引物分别以基因组dna为模板进行pcr检测。编号ko1-1ce为sgrna1和sgrna2的敲除组合，编号ko2-1ce为sgrna3和sgrna4的敲除组合。引物对2f和22r检测kocpq的sgrna1和sgrna2的敲除cpq效果；引物对testkocpq1f和testkocpq1r检测kocpq的sgrna3和sgrna4的敲除基因效果。
其中，检测引物对2f和22r序列为：
2f：5′-atcttcgcatttttcggtggtg-3′
22r：5′-cttctggaggagtcccaatgc-3′
检测引物对testkocpq1f和testkocpq1r序列为：
testkocpq1f：5′-acagatgacagctgagaaggc-3′
testkocpq1r：5′-tggctttttctaggttcttgg-3′
图4：敲除人cpq基因的lm3稳定细胞系一代测序分析结果。a)lm3ko1-1为测序敲除sgrna1&2，敲除165bp片段；b)lm3ko2-1为测序敲除sgrna3&4，敲除106bp片段。
图5：敲除人cpq基因的lm3稳定细胞系westernblot检测。从左至右依次为：泳道1为转染对照质粒(人aavs的sgrna序列)的lm3细胞系，泳道2为稳定敲除细胞系ko1-1ce，泳道3为稳定敲除细胞系ko2-1ce，抗体为rabbitanti-cpqantibody(购自proteintech公司)。
图6：敲除人mtdh基因的lm3稳定细胞系westernblot检测。从左至右依次为：泳道1为marker，泳道2为转染对照质粒(人aavs的sgrna序列)的lm3细胞系，泳道3为稳定敲除细胞系mtdh，泳道4为稳定敲除细胞系mtdh2，抗体为rabbitanti-mtdhantibody(购自proteintech公司)。
具体实施方式
实施例1、利用优化的crispr/cas9技术构建敲除cpq基因的lm3肝癌细胞株
(1)以lentivirusv2载体(zhangfenglab，mit)为基本骨架，从ncbi中下载人类cpq基因的基因组序列并对结构进行分析，找到转录起始区域，针对该区域在线设计精选出一对sgrna，其上、下游sgrna序列分别如下：
sgrna1cttatcttcgcatttttcgg(tgg)
sgrna2cagaagtgccaatcgctcat(agg)
其中，括号中的三个碱基为pam结构域(ngg)
设计出四条引物序列为：
kocpqprimeri(下划线为sgrna1序列)
5′-cgtctcgcaccgcttatcttcgcatttttcgggttttagagctagaaatag-3′
kocpqprimerii
5′-caaaaaagcaccgactcggtgccactttttc-3′
第一次pcr使用引物primeri和primerii获得pcr产物为115bp
kocpqprimeriii
5′-agtcggtgcttttttgcctatttcccatgattcc-3′
kocpqprimeriv(下划线为sgrna2序列的反向互补)
5′-cgtctccaaacaatgagcgattggcacttctgcggtgtttcgtcctttccac-3′
第二次pcr使用引物primeriii和primeriv获得pcr产物为293bp
第一次和第二次采用的pcr扩增体系均为25微升反应体系：
pcr反应条件：
94℃,5min；(94℃,30s；71℃,30s；72℃,1min)×2(touchdownpcr由71℃至63℃每2循环降2℃)，(94℃,30s；61℃,30s；72℃,1min)×25；72℃,10min；hold4℃。
最终，以稀释100倍的第一轮pcr混合液为模板，第二轮pcr使用引物primeri和primeriv完成最终的扩增，pcr使用2倍的上述25微升pcr反应体系(即50微升)，获得一段386bp的插入片段，用于后续质粒连接。
(2)采用宝生物公司的takaraminibestdnafragmentpurificationkit将上述pcr产物去除引物及杂质后回收纯化，电泳检测其质量。
(3)将回收的pcr产物进行esp3i酶切，酶切反应体系如下：
30μl酶切体系，分别添加3μgpcr产物、1μl10uesp3i、3μl10×fastdigestbuffer(thermo公司)，其余用ddh2o补足，混匀后，放入37℃水浴孵育20min。
(4)将酶切产物在1.0％(g/ml)的1×tae琼脂糖凝胶中电泳，并切胶回收目的片段。采用宝生物公司胶回收试剂盒takaraminibestagarosegeldnaextractionkit，操作参照产品说明书实施，溶于30μl的无菌水中。最终获得长度为386bp的敲除cpq的插入片段。
(5)使用esp3i酶切获得线性慢病毒载体lentivirusv2。采用esp3i限制性内切酶对骨架质粒lentivirusv2进行酶切，在37℃水浴中孵育0.5h；然后在1％琼脂糖凝胶中电泳，并切胶回收线性载体。
(6)利用t4dna连接酶将lentivirusv2线性载体和以上步骤(4)中获得的酶切后的插入片段，以10微升体系于25℃连接2h。
(7)采用42℃热激转化法，将上述连接反应液以1:10比例转化stbl3感受态细胞后，在含有100μg/mlampicillin的lb固体培养平板上过夜培养，涂布菌液后放入37℃过夜培养16h。
(8)次日挑取直径较大的单菌落，用1.5ml离心管震荡培养5h，进行菌液pcr鉴定，将阳性菌落用15ml离心管扩大培养，离心收集菌体提取重组质粒，采用nanodrop1000测定质粒浓度。
(9)采用esp3i酶切法二次鉴定重组质粒。电泳图谱找到插入片段可证明重组质粒构建成功。对鉴定插入片段阳性的质粒，采用自行设计的检测引物lv2-3进行测序，在测序结果中需找到两条sgrna序列。引物lv2-3序列为：5′-ctcctttcaagacctagctagc-3′。
(10)获得阳性质粒。
敲除cpq基因的lm3肝癌稳定细胞系的建立：
(1)将上述重组质粒提取并用nanodrop1000测定质粒浓度后，电泳检测质粒的完整性。
(2)细胞转染前24h，在100mm培养皿中接种细胞密度为5×105个每毫升hek293t细胞，待次日细胞汇合度达到60％用于转染。
(3)细胞转染实验。采用包装慢病毒用于转染的方法，将实施例一获得的阳性重组质粒与病毒包装质粒pvsvg及pspa×2按照10：1：9的质量比例混合(总质量8μg)，添加到500μlopti-mem基本培养基中加入32μl转染试剂，然后混匀、室温静置30min；同时，将hek293t细胞除去培养体系中的培养基，用5ml1×pbs轻柔清洗1次；添加2ml无双抗无血清的dmem培养基，将上述转染试剂及质粒的孵育液，逐滴添加到100mm培养皿中接种的hek293细胞中，放入37℃5％co2的培养箱中继续培养；3h后取出培养皿，补加8ml含1％双抗和10％血清的dmem培养基，放入培养箱中继续培养。
(4)培养48h后，收集含有上述带有病毒的细胞培养基上清液，使用0.45μm无菌滤膜过滤获得病毒液用于后续侵染。
(5)病毒侵染实验前24h，在60mm培养皿中接种lm3细胞，接种量为7×105个每毫升lm3，次日细胞汇合度达60％。
(6)病毒侵染。取出lm3细胞培养皿，去除细胞培养基，加入3ml含1％双抗和10％血清的dmem培养基，将步骤(4)中获得的病毒液添加到上述lm3细胞培养皿中，每皿添加4ml，加入6微升polybrene(聚凝胺)，在37℃5％co2培养箱中继续培养24h。
(7)次日从培养箱中取出上述培养皿，除去含有病毒的培养基，添加含有1％双抗和10％血清的dmem新鲜培养基，在细胞培养箱中继续培养48h。
(8)48h以后，在显微镜下可见细胞生长较为密集。用0.25％的胰蛋白酶1ml每10cm培养皿的比例，将lm3细胞消化下来，离心后全部重新接种在100mm培养皿中，在10ml含1％双抗和10％血清的dmem培养基中添加终浓度为2μg/ml的嘌呤霉素(puromycin)进行阳性细胞筛选。每隔三天更换一次含有2μg/mlpuromycin的dmem新鲜培养基。连续筛选5天。
(9)细胞单克隆的筛选。将预筛选5天的细胞(极低密度)用胰酶消化后，以每孔1.5个细胞的密度重稀释后均匀接种至96孔板，培养至显微镜镜检能观察到细胞单克隆。
(10)阳性细胞系鉴定。将获得的单克隆消化后依次转入24孔板、12孔板、6孔板及100mm培养皿中依次扩大培养，取出部分lm3敲除cpq的阳性细胞，提取基因组dna分别采用1)pcr鉴定，2)一代测序鉴定以及3)westernblot，鉴定阳性细胞基因组中cpq基因的敲除效果以及cpq蛋白表达量的降低，证明cpq敲除的lm3细胞系构建成功。
其中，westernblot鉴定流程为：ripa裂解后提取稳定敲除细胞株的总蛋白，采用bca法进行蛋白定量，然后进行westernblot检测cpq蛋白的表达量(见图5)。具体操作方法如下：将cpq敲除的lm3细胞传代至100mm培养皿中，待其长满后吸去培养基，添加5ml预冷的1×pbs清洗1次，弃上清，加入350μl预冷的ripa细胞裂解液(thermofisher)到上述培养皿中，将培养皿置于冰上进行裂解细胞1h，裂解期间间隔震荡混匀若干次；然后使用预冷的细胞刮铲将细胞快速刮下，并转移到1.5ml离心管中；12000rpm，4℃离心15min，小心吸取上清液，转移到新的1.5ml离心管中。采用bca法测定蛋白浓度(thermofisher)，操作方法参考产品说明书。吸取20μg蛋白提取液，加入终体积1/3的4×sdspageloadingbuffer，于97℃变性10min，进行10％sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒定电压80v；然后将蛋白电转至pvdf膜，恒定电流250ma；转膜后，将pvdf膜用质量体积比为5％的脱脂奶粉(用tbst溶液配制)封闭1h，然后用1×tbst溶液洗膜3次，每次10min，加入rabbitanti-cpq抗体，于4℃过夜孵育。次日早上回收一抗，1×tbst洗膜3次，每次10min，再加入兔二抗抗体，室温孵育1h，1×tbst洗膜3次，每次10min。加入ecl化学发光试剂后进行成像分析。如图5所示，对照组可见cpq蛋白主带，而敲除cpq组该蛋白在主带位置消失，表明敲除cpq的lm3细胞系构建成功。
(11)将步骤(10)获得的成功敲除cpq的lm3稳定细胞系扩大培养后，放置在液氮中长期保存备用。
实施例2、稳定敲除mtdh基因lm3细胞系的建立，具体实施步骤如下：
(1)构建mtdh基因敲除的质粒。两对sgrna序列分别是：
第一对：
mtdhprimeri5′-cgtctcgcaccggaaatgctctcggtcggcctgttttagagctagaaatag-3′；
mtdhprimeriv
5′-cgtctccaaacagcgcccgcaaaaagcggaggcggtgtttcgtcctttccac-3′。
第二对：
mtdh2primeri
5′-cgtctcgcaccgaaatgggcggactgttgaaggttttagagctagaaatag-3′；
mtdh2primeriv
5′-cgtctccaaacatagtggatgggtggtaaaagcggtgtttcgtcctttccac-3′。
将本发明获得的敲除mtdh基因重组质粒提取并用nanodrop1000测定质粒浓度后，电泳检测质粒的完整性。
(2)细胞转染前24h，在100mm培养皿中接种细胞密度为8×105个每毫升hek293t细胞，待次日细胞汇合度达到50％用于转染。
(3)细胞转染实验。采用包装慢病毒用于转染的方法，将实施例一获得的阳性重组质粒与病毒包装质粒pvsvg及pspa×2按照10：1：9的质量比例混合(总质量8μg)，添加到500μlopti-mem基本培养基中加入32μl转染试剂，然后混匀、室温静置30min；同时，将hek293t细胞除去培养体系中的培养基，用5ml1×pbs轻柔清洗1次；添加2ml无双抗无血清的dmem培养基，将上述转染试剂及质粒的孵育液，逐滴添加到100mm培养皿中接种的hek293细胞中，放入37℃5％co2的培养箱中继续培养；3h后取出培养皿，补加8ml含1％双抗和10％血清的dmem培养基，放入培养箱中继续培养。
(4)培养48h后，收集含有上述带有病毒的细胞培养基上清液，使用0.45μm无菌滤膜过滤获得病毒液用于后续侵染。
(5)病毒侵染实验前24h，在60mm培养皿中接种lm3细胞，接种量为7×105个每毫升lm3，次日细胞汇合度达60％。
(6)病毒侵染。取出lm3细胞培养皿，去除细胞培养基，加入3ml含1％双抗和10％血清的dmem培养基，将步骤(4)中获得的病毒液添加到上述lm3细胞培养皿中，每皿添加4ml，加入6微升polybrene(聚凝胺)，在37℃5％co2培养箱中继续培养24h。
(7)次日从培养箱中取出上述培养皿，除去含有病毒的培养基，添加含有1％双抗和10％血清的dmem新鲜培养基，在细胞培养箱中继续培养48h。
(8)48h以后，在显微镜下可见细胞生长较为密集。用0.25％的胰蛋白酶1ml每10cm培养皿的比例，将lm3细胞消化下来，离心后全部重新接种在100mm培养皿中，在10ml含1％双抗和10％血清的dmem培养基中添加终浓度为2μg/ml的嘌呤霉素(puromycin)进行阳性细胞筛选。每隔三天更换一次含有2μg/mlpuromycin的dmem新鲜培养基，连续筛选7天。
(9)细胞单克隆的筛选。将预筛选7天的细胞(极低密度)用胰酶消化后，以每孔1个细胞的密度重稀释后均匀接种至96孔板，培养至显微镜镜检能观察到细胞单克隆。
(10)阳性细胞株鉴定。将获得的单克隆消化后依次转入24孔板、12孔板、6孔板及100mm培养皿中依次扩大培养，取出部分lm3敲除mtdh的阳性细胞，分别采用1)提取基因组dna并pcr鉴定，2)一代测序鉴定以及3)westernblot，鉴定阳性细胞基因组中mtdh基因的敲除效果以及mtdh蛋白表达量的降低，证明mtdh敲除的lm3细胞系构建成功。
其中，westernblot鉴定流程为：ripa裂解后提取稳定敲除细胞株的总蛋白，采用bca法进行蛋白定量，然后进行westernblot检测mtdh蛋白的表达量。具体操作方法如下：将mtdh敲除的lm3细胞传代至100mm培养皿中，待其长满后吸去培养基，添加5ml预冷的1×pbs清洗1次，弃上清，加入350μl预冷的ripa细胞裂解液(thermofisher)到上述培养皿中，将培养皿置于冰上进行裂解细胞1h，裂解期间间隔震荡混匀若干次；然后使用预冷的细胞刮铲将细胞快速刮下，并转移到1.5ml离心管中；12000rpm，4℃离心15min，小心吸取上清液，转移到新的1.5ml离心管中。采用bca法测定蛋白浓度(thermofisher)，操作方法参考产品说明书。吸取20μg蛋白提取液，加入终体积1/3的4×sdspageloadingbuffer，于97℃变性10min，进行10％sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒定电压80v；然后将蛋白电转至pvdf膜，恒定电流250ma；转膜后，将pvdf膜用质量体积比为5％的脱脂奶粉(用tbst溶液配制)封闭1h，然后用1×tbst溶液洗膜3次，每次10min，加入rabbitanti-mtdh抗体，于4℃过夜孵育。次日早上回收一抗，1×tbst洗膜3次，每次10min，再加入兔二抗抗体，室温孵育1h，1×tbst洗膜3次，每次10min。加入ecl化学发光试剂后进行成像分析。如图6所示，对照组可见mtdh蛋白主带，而敲除mtdh组该蛋白在主带位置消失，表明敲除mtdh的lm3细胞株构建成功。
(11)将步骤(10)获得的成功敲除mtdh的lm3稳定细胞株扩大培养后，放置在液氮中长期保存备用。
1.一种快速建立crispr基因编辑肝癌细胞株的方法，其特征在于：以肝癌细胞作为靶细胞，利用慢病毒介导sgrna实现编辑肝癌细胞基因的目的，包括以下步骤：
1)sgrna的设计及选取：确定物种(如人或鼠)及要编辑的目标基因序列，对基因序列的结构进行解析，以基因起始密码子处的第一至第三外显子处的基因序列作为靶位点，将靶位点处选取200-250bp序列作为sgrna设计序列，或根据sgrna在线设计软件选取候选的sgrna；
2)sgrna的制备及重组慢病毒质粒的构建：将靶向基因的1条或2条以上sgrna序列按5’至3’方向依次连接，作为插入片段克隆至用bmsbi酶酶切好的lenticrisprv2载体中，获得含有多条sgrna的重组敲除质粒；
3)对阳性重组质粒进行测序鉴定：将所得重组质粒转化到感受态stbl3菌株中，过夜培养，挑取单菌落，氨苄青霉素抗性lb培养基摇12-16小时；提取质粒，用bsmbi(或同工酶esp3i酶)酶切鉴定，切下小于2000bp片段表示有目的片段插入，后续将质粒用引物对：lentiv25：cttgggtagtttgcagtttta和lentiv23：ctcctttcaagacctagctag进行pcr扩增，再次扩增获得小于2000bp的条带(由于插入sgrna数量不同pcr产物片段大小不同)，该pcr产物样品可以测序确认sgrna的序列(测序引物建议使用lentiv23)，测序序列中必须找到目的sgrnas；测序正确的重组质粒可用于后续病毒包装；
4)病毒包装：包装质粒pvsvg：pspax2：重组质粒＝1：9：10的质量比例包装慢病毒；48-72小时收集病毒培养体系上清液；
5)转染靶细胞：提前24-48小时将靶细胞根据需要铺板，将48-72小时收集到的含病毒培养液，用0.45微米的滤器过滤加入培养的靶细胞中，以8-10微升聚凝胺(polybrene)每10ml培养基的比例加入培养皿，继续培养24-48小时后，胰酶消化细胞后将细胞重新接种于新的培养皿中，依靶细胞种类加入2-6微克每毫升的嘌呤霉素进行阳性细胞株预筛选3-7天；
6)细胞的单克隆化培养：将预筛选3-7天的细胞用胰酶消化后，以每孔1-2个细胞的密度重稀释后均匀接种至96孔板，培养至显微镜镜检能观察到细胞单克隆。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
基因敲除成功的阳性肝癌细胞株的鉴定：96孔板嘌呤霉素药筛预筛选3-7天后的细胞，获得细胞单克隆；将细胞单克隆用胰酶消化后依次经历24孔板、12孔板和6孔板，扩大培养；选取一部分细胞提取基因组dna，用检测引物通过pcr检测该基因是否敲除成功，找到敲除成功的阳性克隆，分别采用1)对pcr片段测序，一代测序鉴定敲除掉的序列，并且2)westernblot，鉴定阳性细胞基因组中基因的敲除效果以及靶蛋白表达量的降低，证明基因敲除的肝癌细胞株构建成功，最终获得敲除成功的细胞株。
3.一种权利要求1或2所述构建方法获得的高效敲除基因的肝癌细胞株。
技术总结