本发明涉及生物技术领域，利用木质纤维素原料生产乙醇方向，具体涉及一种原位脱毒发酵生产乙醇的方法。
背景技术：
木质纤维素作为构成植物细胞壁的主要成份，是世界上最丰富的可再生资源之一。目前已经被视为化石燃料最具潜力的替代品，对国家的能源安全和发展有着重大意义。但是木质纤维素在预处理过程中产生的衍生物对发酵微生物有强烈的抑制作用。特别是木质素衍生的酚类抑制物具有毒性强、抑制物种类多、常规方法(水洗法，生物降解法)难去除等特点，已成为限制微生物利用木质纤维素发酵产业化发展的重要问题之一。
羟基肉桂酸作为木质素的主要成分与半纤维素中阿拉伯木聚糖侧链形成共价键相连，是各种植物细胞壁中广泛存在的酚酸类化合物，主要包括：阿魏酸和p-香豆酸(也称对香豆酸，3-(4-羟基苯基)-2丙烯酸)。绝大部分木质纤维素生物质原料经过稀酸、碱性过氧化氢和水热处理等预处理后的水解物中广泛存在羟基肉桂酸，并呈现较高含量(bioresourcetechnology,2016,199:103-112)。另外，阿魏酸和p-香豆酸对酿酒酵母、毕赤酵母、假丝酵母、乳酸菌和大肠杆菌等模式微生物的生长和发酵性能具有强烈的抑制作用。当阿魏酸和p-香豆酸浓度分别超过0.25g/l(1.3mm)和1.56g/l(9.5mm)时，就会对其生长和乙醇发酵产生明显的抑制作用，当浓度进一步提高到1.56g/l(8.0mm)和2.05g/l(12.5mm)时能够导致酵母细胞生长完全停滞。尽管，酿酒酵母能够通过苯基丙烯酸脱羧酶对阿魏酸和p-香豆酸进行降解，但是产生的乙烯基苯酚(4-乙烯基愈创木酚和4-乙烯基苯酚)对酿酒酵母的毒性强于羟基肉桂酸(journalofagriculturalandfoodchemistry,2016,64,11,2325-2332)。因此，仅通过酿酒酵母自身降解羟基肉桂酸类抑制物并同时进行乙醇发酵的方法并不能改善酵母在预处理后的木质纤维素发酵体系中的生长和发酵状况，反而会导致发酵中期酵母活性进一步下降，从而影响乙醇发酵的速率和产率。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
为了解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种原位脱毒发酵生产乙醇的方法，可实现体系中原位脱毒，高效生产乙醇。
本发明提供的原位脱毒发酵生产乙醇的方法，包括以下步骤：
(1)对酿酒酵母依次使用含25％、50％生长抑制浓度的羟基肉桂酸的培养基进行驯化培养；
(2)原位脱毒发酵：步骤(1)所得菌株，接种到包括木质纤维素预处理产物或者经过糖化的木质纤维素预处理产物、水和有机溶剂的发酵体系中，进行发酵。
(3)分离提取：步骤(2)发酵浆液进行固液分离，液体静置后有机相和水相分层，取水相蒸馏得乙醇，有机相旋转蒸发回收有机溶剂。
25％生长抑制浓度、50％生长抑制浓度，是指能够导致原始酵母菌株比生长速率产生25％、50％抑制时的羟基肉桂酸浓度。
优选的，所述驯化培养的具体步骤如下：
初级驯化：酿酒酵母接种至含25％生长抑制浓度的羟基肉桂酸的培养基中进行驯化培养，期间不断更换新的培养基，重复此过程至酵母菌株正常生长并连续5次转接培养后依然保持稳定；此步骤新的培养基是指含25％生长抑制浓度的羟基肉桂酸的培养基。
二级驯化：再将菌液转接至50％生长抑制浓度的羟基肉桂酸的培养基中继续培养，期间不断更换新的培养基，重复此过程至酵母菌株正常生长并连续5次转接培养后依然保持稳定；此步骤新的培养基是指含50％生长抑制浓度的羟基肉桂酸的培养基。
重复二级驯化步骤，直至所得菌株能够在含最小致死浓度的羟基肉桂酸的培养基中正常生长为止。
更换新的培养基的时间间隔优选为12小时。驯化过程中，每次更换培养基后的接种量优选为5-10％。
优选的，上述方法中，在初级驯化前，酿酒酵母还经过活化培养，所述活化培养是将酿酒酵母在培养基中30℃、150转/分的条件下培养12-18小时，使其菌体密度达到od600吸光值6.0-7.0。
优选的，上述方法中，所述培养基每升含有无水葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，硫酸铵1g，酵母浸粉10g；所述羟基肉桂酸是阿魏酸和/或p-香豆酸。
优选的，上述方法中，所述羟基肉桂酸为阿魏酸时，浓度为0.5-2.0g/l；所述羟基肉桂酸为p-香豆酸时，浓度为1.0-2.4g/l；所述羟基肉桂酸为阿魏酸和p-香豆酸时，阿魏酸浓度0.1-0.75g/l，p-香豆酸浓度0.2-0.82g/l。
优选的，上述方法中，步骤(2)所述有机溶剂为十二烷和/或十四烷，有机溶剂占发酵体系的体积分数为10-30％。
优选的，上述方法中，步骤(2)使用木质纤维素预处理产物时，还在发酵体系中加入纤维素酶，纤维素酶加入量为10-30fpu/g干燥的木质纤维素预处理产物。由于不同的预处理方式存在条件差异，例如，料液比不同、处理强度不同，导致最终获得产物中纤维素或固体物质的含量相差很多。如果根据产物总质量估算酶用量是很困难的。而且考虑到纤维素酶的价格很高，为避免不必要的浪费，我们通常会在预处理以后取少量预处理产物进行干燥，对固体含量和纤维素含量进行分析，然后针对预处理产物中的纤维素含量或者是固体物质含量来添加纤维素酶。
优选的，上述方法中，步骤(2)所述经过糖化的木质纤维素预处理产物，是在木质纤维素预处理产物中加入纤维素酶，在纤维素酶用量为10-30fpu/g干燥的木质纤维素预处理产物、35-55℃条件下进行48-72小时糖化反应后所得的产物。
优选的，上述方法中，所述木质纤维素包括农作物秸秆、木屑、甘蔗渣、工业玉米芯废渣中的至少一种。
优选的，上述方法中，所述木质纤维素预处理产物是木质纤维素通过稀酸法、碱法和蒸汽爆破法中的至少一种进行预处理后的产物。
稀酸法，是将木质纤维素类生物质用浓度为0.1-4wt％的硫酸溶液于120-200℃下反应3-120分钟，反应结束后进行过滤，得到料液比为1:3-1:25。
碱法，是将木质纤维素类生物质用浓度为0.5-5wt％的氢氧化钠溶液于30-100℃下反应1-48小时，反应结束后进行过滤，得到料液比为1:5-1:25。除了用氢氧化钠，还可以用碱性过氧化氢来处理。
蒸汽爆破法，是将木质纤维素类生物质在蒸汽爆破处理装置中于180-200℃和1.2-2.0兆帕下处理3-10分钟，反应结束后进行过滤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)通过在培养基中逐渐提高羟基肉桂酸类抑制物的浓度对酿酒酵母进行适应性进化的方法能够有效提高酿酒酵母对羟基肉桂酸类抑制物的耐受性。通过上述方法获得的耐受性酵母菌株在生长性能、羟基肉桂酸的降解和乙醇发酵均比原始酵母菌株明显提高。
(2)上述适应进化的酿酒酵母对预处理后木质纤维素原料进行原位脱毒和乙醇发酵，将脱毒步骤和发酵步骤整合在一步进行，不仅简化了纤维素乙醇发酵工艺，而且降低了脱毒的成本。
(3)通过有机溶剂-水两相体系在酿酒酵母发酵乙醇同时萃取羟基肉桂酸的降解产物，发明中所述有机溶剂能够将绝大部分毒性更强的乙烯基苯酚物质分离，降低对酿酒酵母的抑制作用；并且本身对酿酒酵母生长发酵没有抑制作用；而且对产物乙醇的分配系数很低，有效避免产物乙醇的损失。
附图说明
图1为适应性进化酿酒酵母两相体系原位脱毒和乙醇发酵方法示意图。
图2为实施例2中对阿魏酸适应进化过程中酵母菌株的od600吸光值。
图3为实施例3中对p-香豆酸适应进化过程中酵母菌株的od600吸光值。
图4为实施例5中利用玉米芯残渣进行同步糖化与乙醇发酵过程中原始菌株、阿魏酸耐受菌株和在两相体系原位脱毒同步糖化与乙醇发酵过程中阿魏酸耐受菌株菌体生长状况比较。
具体实施方式
为了使本领域技术人员能够更好地理解本发明，以下结合附图和实施例对本发明进行清楚、详细地描述。
实施例1通过阿魏酸对酿酒酵母适应性进化方法
(1)培养基的配制：无水葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，硫酸铵1g，酵母浸粉10g，加水至1l；在121℃灭菌20分钟。
(2)阿魏酸抑制物培养基的配制：在上述灭菌后的培养基中添加阿魏酸，使培养基中阿魏酸浓度为(0.94-1.79g/l)，制成阿魏酸抑制物培养基。
(3)酿酒酵母驯化：
将原始酿酒酵母干粉(湖北宜昌安琪酵母有限公司)进行活化培养，其中活化培养条件：在培养基中30℃，150转/分的条件下培养18小时，获得菌体密度为od600吸光值6.0-7.0的原始酵母菌株。
初级驯化：以10％的接种量转接到含0.94g/l(25％生长抑制浓度)阿魏酸的培养基中进行适应性进化培养，其中适应性进化培养条件为30℃，150转/分培养，每培养12小时后，以10％接种量转接到新鲜的含0.94g/l阿魏酸的培养基中继续培养，直到酵母菌株生长和发酵状况明显改善，并在5次转接培养过程中保持稳定，该过程经过转接培养63批次。
二级驯化：将初级驯化所得菌株转接到1.29g/l(50％生长抑制浓度)的阿魏酸培养基中继续转接培养，经过64次转接培养，酿酒酵母生长达到稳定。将菌液涂布在含有最低致死浓度(1.56g/l)阿魏酸的培养基平板上培养24小时，挑取最快生长的酵母单菌落在液体培养基中培养，得到阿魏酸耐受性酿酒酵母菌株。适应进化过程中酿酒酵母的生长状况如图2所示。
实施例2.阿魏酸耐受性能评价
将实施例1获得的阿魏酸耐受性酿酒酵母菌株，以及原始酵母菌株，分别放入培养基中活化培养18小时后，再分别以10％接种量转接到含有1.29g/l阿魏酸的培养基中，30℃，150转/分的条件下培养24小时，在设定时间取样1ml，10000转/分种离心5分钟。上清液用于液相色谱分析葡萄糖和乙醇含量，菌体用于测定od600吸光值。
其中，样品上清液稀释10倍，过0.22μm孔径的滤膜，待测。样品中葡萄糖和乙醇含量利用配有示差检测器的液相色谱检测，检测条件：色谱柱为aminex-hpx-87h(300mm×7.8mm)，柱温箱温度为65℃，流动相为0.005mol/l稀硫酸，流速为0.60ml/分钟，进样量为20μl。样品中阿魏酸利用配有二极管阵列检测器的液相色谱检测，检测条件：色谱柱为zorbaxsb-c18(150mm×4.6mm，5μm)，柱温箱温度为25℃，检测波长为280nm，流动相a为甲醇：乙酸：水＝9:1:90，流动相b为甲醇：乙酸：水＝90:1:9。流动相梯度洗脱条件：流动相a梯度100％-75％，0-25分钟；75％-30％，25-40分钟；30％-0％，40-45分钟。流速为1ml/分钟，进样量为20μl。
在上述条件下，阿魏酸耐受性酿酒酵母菌株的最大比生长速率、最大生物量、葡萄糖消耗速率和乙醇生产速率分别为0.25h-1、od600吸光值11.7、2.81g/l/h和1.23g/l/h，比原始酵母菌株分别提高1.0、1.9、0.5和0.6倍。另外，阿魏酸耐受性酿酒酵母菌株对阿魏酸降解速率为0.0179g/l/h，比原始酵母菌株提高5.1倍。
上述驯化方法所得阿魏酸耐受性酿酒酵母菌株分类命名为：酿酒酵母saccharomycescerevisiaepat02，2019年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号cgmccno.18022。
实施例3.通过p-香豆酸对酿酒酵母适应性进化方法
其他试剂及操作步骤与实施例1相同。
与实施例1不同的步骤：
(1)p-香豆酸抑制物培养基的配置：在灭菌后的培养基中添加p-香豆酸，使培养基中p-香豆酸浓度为(1.56-2.05g/l)，制成p-香豆酸抑制物培养基。
(2)将活化后的原始酿酒酵母菌株以10％的接种量转接到含1.56g/l的p-香豆酸的培养基中进行适应性进化培养转接64次(初级驯化)，然后将其转接到含1.78g/l的p-香豆酸的培养基中继续转接培养70次(二级驯化)，得到p-香豆酸耐受性酿酒酵母菌株。适应进化过程中酿酒酵母的生长状况如图3所示。
实施例4.p-香豆酸耐受性能评价
将实施例3获得的p-香豆酸耐受性酿酒酵母菌株，以及原始酵母菌株，分别放入培养基中活化培养18小时后，再分别以10％接种量转接到含有1.78g/l阿魏酸的培养基中培养24小时，培养条件和发酵代谢产物分析检测方法与实施例2相同。
在上述条件下，p-香豆酸耐受性酿酒酵母菌株的最大比生长速率、最大生物量、葡萄糖消耗速率和乙醇生产速率分别为0.22h-1、od600吸光值9.57、2.99g/l/h和0.89g/l/h，比原始酵母菌株分别提高0.6、1.5、1.0和0.7倍。另外，p-香豆酸耐受性酿酒酵母菌株对p-香豆酸降解速率为0.0098g/l/h，比原始酵母菌株提高0.6倍。
实施例5.酿酒酵母对玉米芯残渣原位脱毒和发酵生产乙醇
(1)种子培养：将上述适应进化方法得到的阿魏酸耐受性酿酒酵母菌株pat02和原始酵母菌株分别在培养基中活化培养18小时，然后以10％接种量转接到200ml培养基中培养12小时，培养条件与实施例2相同，所得菌液在6000转/分钟离心5分钟，弃上清，菌体沉淀作为种子。
(2)玉米芯残渣糖化：分别在a、b、c三个5l的配有螺带式搅拌桨的发酵罐中进行玉米芯残渣糖化，酶解糖化体系中液体质量2000ml，干燥的玉米芯残渣用量为25％(w/v)，纤维素酶用量为15fpu/g干燥的玉米芯残渣。在50℃、150转/分种、ph4.8条件下糖化12小时。该体系中阿魏酸和p-香豆酸浓度分别为0.35g/l和0.68g/l。
其中玉米芯残渣为稀酸法处理玉米芯生产木糖的副产物，从山东龙力生物科技股份有限公司获得，纤维素含量为56.5％(基于干物质)。
玉米芯残渣是用玉米芯经过酸水解生产木糖的产物，该酸水解的过程相当于对玉米芯原料进行了稀酸法预处理。稀酸法处理条件：料液比1:10(质量比)、稀硫酸浓度4％，在121℃蒸煮1h，固液分离，固体部分为玉米芯残渣。
(3)两相体系原位脱毒同步糖化与乙醇发酵：将驯化获得的阿魏酸耐受性酿酒酵母菌株种子加入发酵罐a中，并加入液体总体积10％(v/v)的十四烷，以及与培养基成分相同的全部营养盐，葡萄糖除外。在35℃、150转/分种、ph5.5条件下进行两相体系原位脱毒同步糖化与乙醇发酵。在发酵罐b和c中分别按相同接种量接种阿魏酸耐受性酿酒酵母菌株和原始酵母菌株的种子，补充培养基成分相同的全部营养盐(葡萄糖除外)，不添加十四烷，作为对照试验。
(4)菌落计数：同步糖化发酵过程中，菌株的生长状况通过分析不同时间发酵醪样品中细胞数量进行评价。具体步骤：将1ml发酵醪样品稀释105倍，取100μl滴加并涂布在固体培养基平板上，在30℃恒温培养24小时，进行菌落计数，计算1ml样品中细胞数量，单位：cfu/ml。
阿魏酸耐受性酿酒酵母菌株在两相体系原位脱毒同步糖化与乙醇发酵过程中，生长状况如图4所示。在初始24小时菌体密度达到2.69×107cfu/ml，而且在后续发酵过程保持稳定良好的生长状况。乙醇发酵状况：乙醇浓度达到53.6g/l，分别比原始酵母菌株和阿魏酸耐受性酿酒酵母菌株在不含有机溶剂体系条件下提高23.8％和7.8％。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种原位脱毒发酵生产乙醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对酿酒酵母依次使用含25％、50％生长抑制浓度的羟基肉桂酸的培养基进行驯化培养；
(2)原位脱毒发酵：步骤(1)所得菌株，接种到包括木质纤维素预处理产物或者经过糖化的木质纤维素预处理产物、水和有机溶剂的发酵体系中，进行发酵；
(3)分离提取：步骤(2)发酵浆液进行固液分离，液体静置后有机相和水相分层，取水相蒸馏得乙醇，有机相旋转蒸发回收有机溶剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述驯化培养的具体步骤如下：
初级驯化：酿酒酵母接种至含25％生长抑制浓度的羟基肉桂酸的培养基中进行驯化培养，期间不断更换新的培养基，重复此过程至酵母菌株正常生长并连续5次转接培养后依然保持稳定；
二级驯化：再将菌液转接至含50％生长抑制浓度的羟基肉桂酸的培养基中继续培养，期间不断更换新的培养基，重复此过程至酵母菌株正常生长并连续5次转接培养后依然保持稳定；
重复二级驯化步骤，直至所得菌株能够在含最小致死浓度的羟基肉桂酸的培养基中正常生长为止。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在初级驯化前，酿酒酵母还经过活化培养，所述活化培养是将酿酒酵母在培养基中30℃、150转/分的条件下培养12-18小时，使其菌体密度达到od600吸光值6.0-7.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基每升含有无水葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，硫酸铵1g，酵母浸粉10g；所述羟基肉桂酸是阿魏酸和/或p-香豆酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羟基肉桂酸为阿魏酸时，浓度为0.5-2.0g/l；所述羟基肉桂酸为p-香豆酸时，浓度为1.0-2.4g/l；所述羟基肉桂酸为阿魏酸和p-香豆酸时，阿魏酸浓度0.1-0.75g/l，p-香豆酸浓度0.2-0.82g/l。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述有机溶剂为十二烷和/或十四烷，有机溶剂占发酵体系的体积分数为10-30％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)使用木质纤维素预处理产物时，还在发酵体系中加入纤维素酶，纤维素酶加入量为10-30fpu/g干燥的木质纤维素预处理产物。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述经过糖化的木质纤维素预处理产物，是木质纤维素预处理产物在纤维素酶用量为10-30fpu/g干燥的木质纤维素预处理产物，35-55℃条件下进行48-72小时糖化反应后所得的产物。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素包括农作物秸秆、木屑、甘蔗渣、工业玉米芯废渣中的至少一种。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素预处理产物是木质纤维素通过稀酸法、碱法和蒸汽爆破法中的至少一种进行预处理后的产物。
技术总结