本发明属于微通道、双相催化、生物催化技术领域，具体涉及一种利用微通道酶催化产磷脂酰乙醇胺的方法。
背景技术：
磷脂酰乙醇胺一种优良的天然活性剂，具有特有的生物活性和生理功能。研究表明，口服磷脂酰乙醇胺能直接为人脑利用，修复神经细胞膜，回复神经元的正常代谢，具有较好的医疗保健价值。国外已经将磷脂酰乙醇胺作为一种添加剂添加到脑类保健品当中去。然而目前国内外制备磷脂酰乙醇胺的方法主要是从油脚中直接提取，直接提取步骤复杂、耗时长，且提取出来的磷脂酰乙醇胺纯度不高。因此，酶法合成磷脂酰乙醇胺的方法值得去研究探索。
利用磷脂酶d具有宽泛的底物谱这一特性，从磷脂酰胆碱出发，添加乙醇胺作为转酰基小分子底物，生产磷脂酰乙醇胺。传统的生产工艺中，磷脂酰胆碱均匀分散于有机溶剂中，酶分子和乙醇胺均匀分散于水系中，在两相界面上，通过震荡、高速搅拌等手段加大两相接触几率，同样可以提高酶与两个底物的接触几率，达到同样高效的转酯反应效果。然而不断混合的过程需要大量能源的消耗，不符合绿色化学的发展宗旨。
微通道反应器是特征尺寸在10-1000微米之间的微型反应器。微通道反应器有着极好传质能力，可以实现物料的瞬间均匀混合，因此许多在常规反应器中无法实现的反应都可以微反应器中实现，非常适合油水两相的酶催化反应。本发明将生物催化与微通道技术相结合，在微通道管内填充大量的小体积大比表面积的固定化酶载体，由于两相在狭窄的微通道内部不断经受载体的切削作用，获得了一个不断混合的过程。本发明解决了转酯反应的中有机-水两相混合不充分的问题，提高了磷脂酰乙醇胺的生产效率。
技术实现要素：
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术有机-水两相酶催化反应中，酶与底物的接触几率直接决定了酶催化的反应速率，传统的震荡混合或者高速搅拌都不能获得较好的有机-水两相混合效果，而且耗能巨大，不符合绿色化学的发展的问题，提供一种利用微通道酶催化产磷脂酰乙醇胺的方法。
发明思路：本发明提供一种微通道酶催化法生产磷脂酰乙醇胺的方法，该方法对于有机-水两相混合效果有了明显的提升。由于两相在狭窄的微通道内部不断经受小体积大比表面积的固定化载体的切削作用，获得了一个不断混合的过程，两相溶液均以小液滴的形式进行传质，提高了磷脂酶d对于底物的接触面，在不同温度下对于磷脂酰乙醇胺的产率有了明显的提升作用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种利用微通道酶催化产磷脂酰乙醇胺的方法，其包括如下步骤：
(1)将磷脂酶d加入到pbs缓冲液中，得到蛋白稀释液；将蛋白稀释液与载体混合，离心，所得沉淀即为载体固载的磷脂酶d；
(2)将步骤(1)得到的载体固载的磷脂酶d装填到两端用微滤膜封口的微通道管道内，即为填充载体固载磷脂酶d的微反应器，再将其接入微通道反应装置中；
(3)将有机相、磷脂酰胆碱和乙醇胺制备成均相溶液a；
(4)将水相和步骤(3)制得的均相溶液a分别同时泵入微通道反应装置中的微混合器中，混合后通入步骤(2)制得的微反应器中反应，收集微反应器流出液，得到产物磷脂酰乙醇胺。
步骤(1)中，磷脂酶d的培育过程为将穗色链霉菌进行斜面培养、种子液培养和摇瓶培养后，取发酵液上清浓缩分离后得到磷脂酶d。
其中穗色链霉菌为穗色链霉菌(streptomycesracemochromogenes)4.331，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(ccgmc)
步骤(1)中，pbs缓冲液的ph为7.2；蛋白稀释液中磷脂酶d的浓度为0.08～0.15g/l(优选0.1g/l)。
步骤(1)中，所述的载体为石墨烯、碳纳米管、碳纳米片中的任意一种或其他具有小尺寸和较大比表面积的和固定化材料；优选碳纳米管；蛋白稀释液与载体的体积质量比为27～35ml/g(优选30ml/g)。
步骤(1)中，所述的混合为以在3～8℃超声混合0.6～2min，再在300～800rpm的速率下搅拌1～3min为一个循环，重复8～12个循环；优选地，所述的混合为以在4℃超声混合1min，再在500rpm的速率下搅拌2min为一个循环，重复10个循环；其中，对超声频率没有具体的要求，仅需满足混合即可。
步骤(1)中，所述的离心为6000～10000rpm的转速下离心8～12min；优选地，所述的离心为8000rpm的转速下离心10min。
步骤(2)中，微滤膜的孔径为0.22μm；微滤膜的材质为水膜；所述的微通道管道的材质为不锈钢、玻璃、塑料等传统材料；所述的微通道管道的内径控制在50～500μm，长度控制在1～100cm；优选地，内径为100μm，长度为50cm。
步骤(2)中，载体固载的磷脂酶d与微通道的质量体积比为0.01～0.02mg/ml。
步骤(3)中，所述的乙醇胺的ph值为7.0，优选地，用盐酸调节其ph值为7.0；磷脂酰胆碱和乙醇胺的摩尔比为1.5～2.5:1(优选2:1)；所述的有机相为氯仿、三氯甲烷、甲苯、乙酸乙酯和醋酸丁酯中的任意一种；磷脂酰胆碱和乙醇胺的摩尔浓度比为5～20mmol/l/2.5～10mmol/l(优选15mmol/l:10mmol/l)。
步骤(4)中，所述的水相为去离子水和缓冲液中的任意一种；其中，所述的缓冲液为pbs缓冲液或乙酸-乙酸钠缓冲液或其他缓冲溶液；上述缓冲液的ph值均为4～8；其中，pbs缓冲液的ph值为7.2；乙酸-乙酸钠缓冲液的ph值为4.6～6。
步骤(4)中，控制有机相与水相的体积比为1:1～3:1(优选1:1)。
步骤(4)中，所述水相泵入微通道反应装置中的混合器的流速为0.01～0.02ml/min(优选0.013ml/min)；均相溶液a泵入微通道反应装置中的微混合器的流速为0.01～0.02ml/min(优选0.013ml/min)。
步骤(4)中，控制水相与均相溶液a的总体积，使磷脂酶d的浓度为0.4～0.6u/ml(优选0.575u/ml)。酶活定义：采用两相反应体系作为酶催化的反应体系，即水相为0.2m的乙酸-乙酸钠缓冲液，有机相为二氯甲烷，磷脂酰胆碱与乙醇胺的混合溶液；其中，磷脂酰胆碱与乙醇胺摩尔浓度比15mmol/l:10mmol/l(乙醇胺需用盐酸调节至ph＝7.0)。二氯甲烷与水相乙酸-乙酸钠缓冲液体积比为1:1，ph为6.5，反应温度30℃，反应时间为1h。本实验中，规定在此条件下，每小时每生成0.74mg磷脂酰乙醇胺所需的酶量为一个酶活单位u。
步骤(4)中，所述的反应为在ph值为6～7，30～50℃下反应0.8～1.5h；优选地，所述的反应为在ph值为6.5，35℃下反应1h。
步骤(4)中，所述的微通道反应装置包括第一进料泵、第二进料泵、微混合器、微反应器和接收器。
其中，第一进料泵和第二进料泵通过管道以并联的方式连接到微混合器上，微混合器依次与微反应器、接收器串联，所述的连接为通过管道连接。
其中，所述的微反应器为步骤(2)制备的填充载体固载磷脂酶d的微反应器。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
1.利用微通道技术，在低耗能的情况下，获得了较好的有机-水两相混合效果。
2.该方法适用性好，原材料获取方便，制备简单，使用寿命长，有效的降低了酶催化剂的生产成本。
3.本方法对于磷脂酰乙醇胺的产率有了明显的提升作用，具有较好的经济价值。
4.在微通道内部的酶的耐受性由于固定化材料的保护而获得了较为明显的提升作用。
附图说明
图1为微通道酶催化法生产磷脂酰乙醇胺反应器的示意图；
图2为检测方法的梯度方法表；
图3为微通道酶催化法生产磷脂酰乙醇胺效果图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1菌株的培育过程
1.1菌株
穗色链霉菌(streptomycesracemochromogenes)4.331，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(ccgmc)。
1.2培养基
斜面培养基：葡萄糖5g/l，蛋白胨5g/l，k2hpo42g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，琼脂25g/l，溶剂为水。
种子培养基：葡萄糖10g/l，酵母粉5g/l，鱼粉蛋白胨5g/l，吐温-6010g/l，氯化钙3g/l，k2hpo42g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，溶剂为水。
发酵培养基：葡萄糖10g/l，酵母粉5g/l，鱼粉蛋白胨5g/l，吐温-6010g/l，氯化钙3g/l，k2hpo42g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，溶剂为水。
灭菌方法：离子溶液进行过滤除菌，其余进行高压蒸汽灭菌，灭菌条件为121℃，15min。
1.3斜面培养
将储存于-80℃冰箱内的菌株取出，在超净台内进行斜面划线操作，然后将平板置于30℃恒温培养箱内，培养3d。
1.4种子液培养
以1ml0.9％(体积浓度)的无菌生理盐水轻轻冲洗经斜面培养基上活化的穗色链霉菌孢子，吸取转移至50ml种子培养基中，200rpm转速，30℃条件下恒温振荡培养1d。
1.5摇瓶培养
将种子液以1％(体积浓度)的接种量接于50ml发酵培养基中，在200rpm，30℃条件下培养2d后，离心弃细胞，取发酵液上清浓缩分离后得到磷脂酶d。
实施例2
将实施例1中得到的浓缩分离的磷脂酶d，加入ph为7.2的pbs缓冲液配制成浓度为0.1g/l的蛋白稀释液。量取15ml的蛋白稀释液与0.5g的碳纳米管，在4℃温度下，按照以超声混合1min，500rmp搅拌2min为一个循环，混合10个循环后，8000rpm离心10min保留沉淀，即得到碳纳米管固载的磷脂酶d。
将碳纳米管固载的磷脂酶d，注射入50厘米长、内径为100微米、一端用0.22微米规格的微滤膜(水膜)封口的微通道(塑料)内，注射装填完毕后将另一端用0.22微米规格的微滤膜封口。最后将两端封口内部填充碳纳米管固载的磷脂酶d的微通道接入y型反应器中，即得到微通道酶催化法生产磷脂酰乙醇胺反应器，示意图见图1。
实施例3分析方法
3.1酶活的检测方法
采用两相反应体系作为酶催化的反应体系，即水相为0.2m的乙酸-乙酸钠缓冲液，有机相为二氯甲烷，磷脂酰胆碱与乙醇胺的摩尔浓度比15mmol/l:10mmol/l(乙醇胺需用盐酸调节至ph＝7.0)。有机相二氯甲烷与水相乙酸-乙酸钠缓冲液体积比为1:1，ph为6.5，反应温度30℃，反应时间为1h。本实验中，规定在此条件下，每小时每生成0.74mg磷脂酰乙醇胺所需的酶量为一个酶活单位u。
在反应过程中，生成的产物同样是亲脂性的，不断溶解于有机相中，这样就及时将产物从酶表面移除了，将会推动反应朝着有利的产物生成方向进行。
3.2分析方法
高效液相色谱方法为agilent1260高效液相色谱；
色谱柱为zorbaxrx-silcolumns；
流动相a为：甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(85:15:0.45:0.05)；
流动相b为：正己烷-异丙醇-流动相a(20:48:32)；
进行梯度洗脱(具体方法见图2)；
柱温39℃，用蒸发光散射检测器检测(参考条件：漂移管温度65℃，载气流量为每分钟2.0ml)。
实施例4催化活性对比
采用微通道反应装置进行反应，其包括第一进料泵、第二进料泵、微混合器、微反应器和接收器；其中，第一进料泵和第二进料泵通过管道以并联的方式连接到微混合器上，微混合器依次与微反应器、接收器串联，所述的连接为通过管道连接。
其中，进料泵为汶颢wh-sp-01；微混合器为汶颢wh-indmixer。
取实施例2中的微通道酶催化法生产磷脂酰乙醇胺反应器，在有机相进口处加入0.013mm3/min流速的实施例3中的有机相溶液，在水相进口处加入0.013mm3/min流速的实施例3中的水相溶液。其余反应条件参见实施例3中的3.1酶活的检测方法，在产物出口取得反应液，以实施例3中的3.2的分析方法进行检测。游离磷脂酶d的获取参见实施例1，催化方法参见实施例3中的3.1酶活的检测方法[1]。两者在20～50℃下进行催化反应得到图3。从图3的数据上可以得出，两者的最适温度都为35℃，其中微通道酶催化法生产磷脂酰乙醇胺的产量可以达到游离酶的2.1倍，且在40～50℃表现出更好的温度耐受性。
[1]钱娟,庞洋,王昕.磷脂酶d的制备及催化磷脂酰胆碱合成磷脂酰丝氨酸[j].中国油脂,2017,42(9):66-71.
综上所述，本发明一种微通道酶催化法生产磷脂酰乙醇胺的方法，首先利用碳纳米管等小体积大比表面积的固定化载体对磷脂酶d进行固定化，利用固定化载体对酶实现较好的封装和保护，提高了磷脂酶d的温度耐受性；其次这些作为微通道填充料的载体在双相催化中可以充当微型混合器，有机-水双相溶液进过挤压冲入微通道内，受到这些填充材料的切削，进而获得了一个不断混合的过程，两相溶液均以小液滴的形式进行传质，提高了磷脂酶d对于底物的接触面，进而提升了磷脂酰乙醇胺的产率；此外整个过程不需要额外提供震荡、搅拌等额外机械力支持，节能环保。
本发明提供了一种利用微通道酶催化产磷脂酰乙醇胺的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
1.一种利用微通道酶催化产磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将磷脂酶d加入到pbs缓冲液中，得到蛋白稀释液；将蛋白稀释液与载体混合，离心，所得沉淀即为载体固载的磷脂酶d；
(2)将步骤(1)得到的载体固载的磷脂酶d装填到两端用微滤膜封口的微通道管道内，即为填充载体固载磷脂酶d的微反应器；
(3)将有机相、磷脂酰胆碱和乙醇胺制备成均相溶液a；
(4)将水相和步骤(3)制得的均相溶液a分别同时泵入微通道反应装置中的微混合器中，混合后通入步骤(2)制得的微反应器中反应，收集微反应器流出液，得到产物磷脂酰乙醇胺。
2.根据权利要求1所述的利用微通道酶催化产磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于，步骤(1)中，蛋白稀释液中磷脂酶d的浓度为0.08～0.15g/l。
3.根据权利要求1所述的利用微通道酶催化产磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的载体为石墨烯、碳纳米管、碳纳米片中的任意一种；蛋白稀释液与载体的体积质量比为27～35ml/g。
4.根据权利要求1所述的利用微通道酶催化产磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于，步骤(2)中，微滤膜的孔径为0.22μm；载体固载的磷脂酶d与微通道的质量体积比为0.01～0.02mg/ml。
5.根据权利要求1所述的利用微通道酶催化产磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的有机相为氯仿、三氯甲烷、甲苯、乙酸乙酯和醋酸丁酯中的任意一种；乙醇胺的ph值为7.0；磷脂酰胆碱和乙醇胺的摩尔浓度比为5～20mmol/l/2.5～10mmol/l。
6.根据权利要求1所述的利用微通道酶催化产磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的水相为去离子水和缓冲液中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的利用微通道酶催化产磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于，步骤(4)中，控制有机相与水相的体积比为1:1～3:1。
8.根据权利要求1所述的利用微通道酶催化产磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于，步骤(4)中，控制水相与均相溶液a的总体积，使磷脂酶d的浓度为0.4～0.6u/ml。
9.根据权利要求1所述的利用微通道酶催化产磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的反应为在ph值为6～7，30～50℃下反应0.8～1.5h。
10.根据权利要求1所述的利用微通道酶催化产磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的微通道反应装置包括第一进料泵、第二进料泵、微混合器、微反应器和接收器；其中，第一进料泵和第二进料泵通过管道以并联的方式连接到微混合器上，微混合器依次与微反应器、接收器串联，所述的连接为通过管道连接。
技术总结