技术领域：
本发明属于微生物应用领域，具体涉及大肠杆菌cf16在产谷氨酸或谷氨酸钠中的应用。
背景技术：
：
谷氨酸钠作为一种天然添加剂广泛应用于食品、生物医药和化工合成等领域，近年来颇受人们关注。谷氨酸钠，生活中称之为味精。白色针状晶体粉末，以碳链为骨架的一种有机化合物。过去生产味精主要用小麦面筋(谷蛋白)水解法进行，现改用微生物发酵法来进行大规模生产，因此筛选到合适的菌株是生产质量过硬的谷氨酸钠的前提。
技术实现要素：
：
本发明的目的是提供一种大肠杆菌(escherichiacoli)cf16高效生产谷氨酸中的应用。
本发明通过实验发现，大肠杆菌cf16可以发酵生产谷氨酸。而谷氨酸与钠盐反应可以生成谷氨酸钠。
因此本发明的第一个目的是提供大肠杆菌cf16在生产谷氨酸或谷氨酸钠中的应用。
本发明的第二个目的是提供一种生产谷氨酸的方法，以大肠杆菌cf16作为发酵菌株进行发酵培养，从发酵培养物中分离出谷氨酸。
优选，是将大肠杆菌cf16接种于发酵培养基中进行培养，所述的发酵培养基每升水中加入糖蜜废水15ml、蛋白胨5g、氯化钠7g、柠檬酸1g、氯化铵2g、琼脂15g，混合均匀，调ph7.6～8.2。
所述的培养，其培养条件是28℃下培养。
本发明的出发点就是在微生物发酵产物利用的研究热点趋势下，在用于谷氨酸钠产品生产的微生物资源缺乏的背景下，从资源筛选的角度，提供高效、方便的菌种资源，为添加剂产业的推广贡献基础资源。
本发明发现大肠杆菌(escherichiacoli)cf16可以高效生产谷氨酸，因此可以将其应用于谷氨酸和谷氨酸钠的生产。为谷氨酸钠添加剂产业的推广贡献基础资源。
本发明的大肠杆菌(escherichiacoli)cf16于2018年07月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，其保藏编号为：gdmcc1.1478。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：大肠杆菌(escherichiacoli)cf16菌株的分离和鉴定
1.大肠杆菌(escherichiacoli)cf16菌株的分离
筛选培养基：
tsa培养基：胰酪胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，将上述成分混合均匀，调ph7.1～7.5；
本发明的大肠杆菌(escherichiacoli)cf16菌株是从广州南方医院的体检人群的粪便中分离、纯化而得。其分离纯化方法如下：
取1g粪便样本在100ml的tsa培养基中密闭富集培养。富集过程中通过不同时间查看发酵液的浑浊度。富集培养是先在37℃，培养1天，观察到有明显的浑浊后，转接到新配置好的筛选培养基中相同条件下继续培养1天。然后从上步富集培养的培养液里取混合菌群涂布到含有琼脂的固体筛选培养基中37℃厌氧工作中进行培养，从中挑取快速生长的菌落进行纯化，和油污去除试验，最后获得一株对油渍具有快速、高效的降解能力的菌株cf16。
2.菌株cf16的理化参数如下：
1、菌株特性
a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，菌株cf16为革兰氏阴性，杆状，氧化酶阴性，不能运动。
b.在tsa培养基平板上培养20h后，菌落表面呈米黄色，圆形，无凸起。
2、大肠杆菌(escherichiacoli)cf16的主要理化特性：
菌株cf16的16srrna基因测序，blast比对发现，本发明的菌株cf1616srrna基因序列与escherichiacoli已有模式菌株具有较高的相似性。其中与escherichiacolidsm30083t的序列相似性为99％。
综合上述的生理生化特性、16srrna基因序列结果，本发明菌株cf16应归属escherichiacoli，命名为大肠杆菌(escherichiacoli)cf16，于2018年07月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，其保藏编号为：gdmcc1.1478，该菌株是公开共享的菌株，任何人都可以去该广东省微生物菌种保藏中心购买。
实施例2：
1.发酵液的制备：
将大肠杆菌(escherichiacoli)cf16接种到1l谷氨酸种子液体培养基中，培养24h即为发酵种子液。然后以体积分数8％接种量将发酵种子液接种到5l发酵培养基中发酵，发酵温度控制在28℃，发酵时间为24小时，得到谷氨酸发酵液。
所述的谷氨酸种子液体培养基和发酵培养基的配方都为：糖蜜废水15ml，蛋白胨5g，氯化钠7g，柠檬酸1g，氯化铵2g，蒸馏水1000ml，将各成分混合均匀，调ph7.6～8.2，灭菌即得。
2.谷氨酸的测定
2.1溶液配制
谷氨酸标准溶液的配制：准确称取干燥谷氨酸0.2000g，定容至100ml，作为母液。
准确吸取10ml母液加水定容至100ml即得谷氨酸标准液200μg/ml。2％茚三酮溶液的配制：将1g茚三酮溶于35ml热水中，加入40mg氯化亚锡，搅拌均匀后置于暗处，隔夜放置，过滤后加水定容至50ml。磷酸盐缓冲溶液：分别配制ph为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的磷酸盐缓冲溶液。
2.2样品处理：液体样品先经5000r/min离心15min，去除菌体等杂质。取5ml上层清液，加入等量的6mol/l盐酸溶液到比色管中，放入110℃鼓风式干燥箱水解24h。水解后，先用6mol/l的naoh溶液进行中和反应，调至ph为7左右，再将其倒入200ml的容量瓶中做定量稀释即可。
2.3实验方法
在25ml的比色管中吸入1ml稀释后的样品，再加入一定量的磷酸缓冲液和茚三酮溶液，补入适量的去离子水，放入水浴摇床中加热。冷却后定容至25ml，在570nm处测定其吸光度。
2.4标准曲线
取谷氨酸标准液(200μg/ml)0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml置于25ml容量瓶，加水补充至容积为4ml，加入茚三酮(20g/l)和ph8.04缓冲液各1ml，放入100℃水浴摇床中加热20min。冷却10min后用去离子水补满25ml，在分光光度计570nm处测得数值。以标准谷氨酸浓度为横坐标，吸光度a为纵坐标，绘制标准曲线。从表1可知，谷氨酸溶液浓度与吸光度呈线性相关，其回归方程为y＝0.0022x-0.0388，相关系数r2＝0.9977。
表1
2.5发酵液中谷氨酸的浓度检测
取1ml不加菌的发酵培养基作为对照，置于25ml容量瓶，加水补充至容积为4ml，加入茚三酮(20g/l)和ph8.04缓冲液各1ml，放入100℃水浴摇床中加热20min。冷却10min后用去离子水补满25ml，在分光光度计570nm处测得数值为0.0203。根据回归方程计算1ml培养基中含有谷氨酸26.86μg。
取1ml谷氨酸发酵液，置于25ml容量瓶，加水补充至容积为4ml，加入茚三酮(20g/l)和ph8.04缓冲液各1ml，放入100℃水浴摇床中加热20min。冷却10min后用去离子水补满25ml，在分光光度计570nm处测得数值为0.279。根据回归方程计算1ml发酵液中含有谷氨酸144.45μg。
取2ml谷氨酸发酵液，置于25ml容量瓶，加水补充至容积为4ml，加入茚三酮(20g/l)和ph8.04缓冲液各1ml，放入100℃水浴摇床中加热20min。冷却10min后用去离子水补满25ml，在分光光度计570nm处测得数值为0.512。根据回归方程计算1ml发酵液中含有谷氨酸125.18μg。
取3ml谷氨酸发酵液，置于25ml容量瓶，加水补充至容积为4ml，加入茚三酮(20g/l)和ph8.04缓冲液各1ml，放入100℃水浴摇床中加热20min。冷却10min后用去离子水补满25ml，在分光光度计570nm处测得数值为0.786。根据回归方程计算1ml发酵液中含有谷氨酸124.97μg。
1.大肠杆菌cf16在生产谷氨酸或谷氨酸钠中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，是将大肠杆菌cf16接种于发酵培养基中培养，所述的发酵培养基每升水中加入糖蜜废水15ml、蛋白胨5g、氯化钠7g、柠檬酸1g、氯化铵2g、琼脂15g，混合均匀，调ph7.6～8.2。
3.一种生产谷氨酸的方法，其特征在于，以大肠杆菌cf16作为发酵菌株进行发酵培养，从发酵培养物中分离出谷氨酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，是将大肠杆菌cf16接种于发酵培养基中进行培养，所述的发酵培养基每升水中加入糖蜜废水15ml、蛋白胨5g、氯化钠7g、柠檬酸1g、氯化铵2g、琼脂15g，混合均匀，调ph7.6～8.2。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的培养，其培养条件是28℃下培养。
技术总结