本发明属于d-塔格糖生产技术领域，尤其涉及一种由乳清生产d-塔格糖的方法。
背景技术：
随着人民生活水平的提高，健康问题也越来越受到人们的关注，食品中传统甜味剂的添加由于其高热量引起了糖尿病、肥胖、癌症和心血管等疾病，使得寻找可替代传统甜味剂的低热量功能性甜味剂迫在眉睫。2002年的第一届国际糖协会(isrs)会议提出了对稀有糖的定义，即自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物，其甜味类似于蔗糖，但具有热量低、稳定性高、甜昧协调、无吸湿性、无致龋齿性、耐受性高等优点，可以弥补传统甜味剂的不足，对改善特殊人群的饮食起到重要作用。
d-塔格糖(d-tagatose)是一种自然界中较为稀有的天然己酮糖，分子式为c6h12o6，不仅是d-果糖在c-4位上的差向异构体，还是d-半乳糖的酮糖异构体。纯净的d-塔格糖为白色的晶体状物质，其甜味类似于蔗糖，而热量仅为蔗糖的1/3。d-塔格糖是一种具有低热量值、零血糖生成指数、血糖钝化作用、无龋齿性、益生元作用和抗氧化活性等优良营养特性的低热量甜味剂，并且具有改善肠道菌群、治疗ⅱ型糖尿病、降低胆固醇、预防结肠癌等生理功效。2001年，美国fda批准其为普遍公认安全食品(gras)，因此被作为蔗糖的代替品应用于健康饮料及酸乳、果汁等产品中；同时还被广泛应用于糖尿病专用食品、减肥食品、口香糖、谷物食品、饮料、肉制品、糖果等工业中，并在医药行业被用于咳嗽糖浆、粉剂、起泡剂、固定假牙的豁合剂及口腔消毒剂中。
d-塔格糖的生产有化学法和生物法两种，化学法是以乳清或乳糖为原料，在酸或乳糖水解酶的作用下被水解为d-半乳糖和d-葡萄糖，再利用可溶性碱金属盐或碱土金属盐、铝酸钾等化学催化剂将d-半乳糖异构化成d-塔格糖。此方法存在副产物多、纯化烦琐和污染大等缺点，不利于工业化生产。生物法可以有效的克服这些缺点，目前报道的生物法生产d-塔格糖按原料不同分为两种方法。第一种是由izumori课题组提出的，以半乳糖醇为原料，利用半乳糖醇脱氢酶将其氧化成d-塔格糖；或者以d-山梨糖为原料，在d-阿洛酮糖-3-差向异构酶和d-塔格糖-3-差向异构酶的催化下生成d-塔格糖。但是半乳糖醇和d-山梨糖的价格很高，该方法的商业应用价值不大。第二种是cheetham等在1993年提出的，即以相对低成本的d-半乳糖为原料，利用l-阿拉伯糖异构酶(l-arabinoseisomerase，l-ai)将其转化为d-塔格糖，有文献报道，l-ai是目前用于转化d-半乳糖生产d-塔格糖最有效的酶，因此，目前研究最多的用于d-塔格糖的制备方法即是以d-半乳糖为原料利用l-ai进行生物催化合成d-塔格糖。但d-半乳糖作为原料不算廉价，以更加廉价的工业废弃物乳清或乳糖替代d-半乳糖作为生产d-塔格糖的原料越来越受到关注，成为市场化的选择。因此，为实现d-塔格糖的低成本工业化生产，可以乳清中的乳糖或纯净的乳糖为原料，经β-半乳糖苷酶水解产生d-半乳糖和d-葡萄糖，生成的d-半乳糖经过l-ai催化生成功能性甜味剂d-塔格糖，实现变废为宝。
据文献报道，目前利用由乳糖水解生成的d-半乳糖转化合成d-塔格糖仅能达到不足50％的转化率，也就是多于一半的经乳糖水解生成的d-半乳糖未被有效转化为d-塔格糖，被滞留到了转化液中，造成了产物d-塔格糖的产量不高，底物利用率不高等问题，引起了资源浪费，未能实现最大程度的变废为宝。有鉴于此，如何提高乳糖水解产生的d-半乳糖到d-塔格糖的转化率，提高d-塔格糖的产量，也就是以乳糖为底物生成d-塔格糖的利用率值得被进一步研究。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种由乳清生产d-塔格糖的方法，采用本发明提供的方法提高了d-塔格糖的转化率和产量。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种由乳清生产d-塔格糖的方法，包括以下步骤：
1)以乳糖质量含量为70％的乳清粉为原料，利用磷酸钠缓冲液制备含120～160g/l乳糖的乳清粉溶液，得到底物溶液；
2)将编码l-阿拉伯糖异构酶的araa基因克隆到表达载体pany1中，经转化、筛选阳性克隆子获得重组e.colibl21/pany1-araa菌株，将所述菌株进行液体培养，当培养液的od600值为0.4～0.6时添加iptg诱导l-阿拉伯糖异构酶表达，离心后收集细胞，得到含l-阿拉伯糖异构酶的重组静息细胞；
3)将β-半乳糖苷酶与所述步骤1)得到的底物溶液、步骤2)得到的重组静息细胞混合，得到第一反应液，所述第一反应液在45～55℃下转化36～60h，得到第一转化液，除去重组静息细胞后，得到除去重组静息细胞液；
所述底物溶液中乳糖的质量与β-半乳糖苷酶的酶活比为1g:250u；
所述第一反应液中重组静息细胞的质量浓度为15～30g/l；
4)将所述步骤3)得到的除去重组静息细胞液与β-半乳糖苷酶、所述步骤2)重组静息细胞混合，得到第二反应液，所述第二反应液在45～55℃下转化36～60h，得到d-塔格糖；
所述除去重组静息细胞液中乳糖的质量与β-半乳糖苷酶的酶活比为1g:250u；
所述第二反应液中重组静息细胞的质量浓度为15～30g/l。
优选的，所述步骤1)磷酸钠缓冲液含有4～6mm的mnso4，所述磷酸钠缓冲液的ph值为6～7。
优选的，扩增步骤2)araa基因使用的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示。
优选的，扩增步骤2)araa基因使用的程序为：98℃3min；98℃10s，58℃30s；72℃22s，35个循环；72℃10min。
优选的，所述步骤2)培养液添加iptg混合，所述培养液中iptg中添加的终浓度为1mm。
优选的，所述步骤2)诱导的条件包括：所述诱导的温度为25℃，所述诱导的转速为120rpm。
优选的，所述步骤2)离心后收集细胞后还包括：用含质量百分含量为2％triton-x-100的磷酸钠缓冲液处理细胞30min后，离心收集细胞，得到含l-阿拉伯糖异构酶的重组静息细胞。
优选的，所述步骤2)液体培养的条件包括：所述液体培养的温度为37℃，所述液体培养的转速为200rpm。
优选的，所述步骤2)离心的条件包括：所述离心的转速为8000rpm，所述离心的温度为4℃，所述离心的时间为10min。
优选的，所述步骤2)液体培养使用的培养基包括lb液体培养基。
本发明提供了一种由乳清生产d-塔格糖的方法，本发明以含有乳糖的乳清为底物，添加含l-阿拉伯糖异构酶的重组静息细胞后进行第一次转化后，在添加新的含l-阿拉伯糖异构酶的重组静息细胞后进行第二次转化，在转化条件下提高了d-塔格糖的转化率，进而提高了d-塔格糖的产量。
根据本发明实施例的结果可知：本发明以两阶段转化高效生物合成d-塔格糖，最大程度的将乳清中的乳糖水解生成的d-半乳糖转化为d-塔格糖，d-塔格糖的产量从第一阶段的35.4g/l提高到60.6g/l，d-半乳糖到d-塔格糖的转化率由第一阶段的52.4％提高到86.4％，乳糖到d-塔格糖的转化率由第一阶段的25.2％提高到43.3％。
附图说明
图1为pcr扩增植物乳杆菌的araa；
图2为iptg诱导l-ai表达的sds-page；
图3为三种不同技术路线用于生产d-塔格糖的比较。
具体实施方式
本发明提供了一种由乳清生产d-塔格糖的方法，包括以下步骤：
1)以乳糖质量含量为70％的乳清粉为原料，利用磷酸钠缓冲液制备含120～160g/l乳糖的乳清粉溶液，得到底物溶液；
2)将编码l-阿拉伯糖异构酶的araa基因克隆到表达载体pany1中，经转化、筛选阳性克隆子获得重组e.colibl21/pany1-araa菌株，将所述菌株进行液体培养，当培养液的od600值为0.4～0.6时添加iptg诱导l-阿拉伯糖异构酶的表达，离心后收集细胞，得到含l-阿拉伯糖异构酶的重组静息细胞；
3)将β-半乳糖苷酶与所述步骤1)得到的底物溶液、步骤2)得到的重组静息细胞混合，得到第一反应液，所述第一反应液在45～55℃下转化36～60h，得到第一转化液，除去重组静息细胞后，得到除去重组静息细胞液；
所述底物溶液中乳糖的质量与β-半乳糖苷酶的酶活比为1g:250u；
所述第一反应液中重组静息细胞的质量浓度为15～30g/l；
4)将所述步骤3)得到的除去重组静息细胞液与β-半乳糖苷酶、所述步骤2)重组静息细胞混合，得到第二反应液，所述第二反应液在45～55℃下转化36～60h，得到d-塔格糖；
所述除去重组静息细胞液中乳糖的质量与β-半乳糖苷酶的酶活比为1g:250u；
所述第二反应液中重组静息细胞的质量浓度为15～30g/l，优选为20g/l。
本发明以乳糖质量含量为70％的乳清粉为原料，利用磷酸钠缓冲液制备含120～160g/l乳糖的乳清粉溶液，得到底物溶液，优选含140g/l乳糖的乳清粉溶液。本发明对所述乳糖质量含量为70％的乳清粉的来源没有特殊限定，采用常规来源即可。在本发明中，所述磷酸钠缓冲液优选含4～6mm的mnso4，更优选含5mm的mnso4，所述硫酸锰中的锰离子具有激活酶活的作用，所述磷酸钠缓冲液的ph值优选为6～7，更优选为6.5，所述磷酸钠缓冲液的摩尔浓度优选为100mm。
本发明将编码l-阿拉伯糖异构酶的araa基因克隆到表达载体pany1中，经转化、筛选阳性克隆子获得重组e.colibl21/pany1-araa菌株，将所述菌株进行液体培养，当培养液的od600值为0.4～0.6时添加iptg诱导l-阿拉伯糖异构酶的表达，离心后收集细胞，得到含l-阿拉伯糖异构酶的重组静息细胞。
在本发明中，扩增araa基因使用的程序优选为：98℃3min；98℃10s，58℃30s；72℃22s，35个循环；72℃10min。本发明对扩增araa基因使用的体系没有特殊限定，本领域技术人员根据常规设置即可。在本发明中，扩增araa基因使用的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，具体如下：
所述下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示，具体如下：
本发明对将araa基因克隆到表达载体pany1中，经转化、筛选阳性克隆子获得重组e.colibl21/pany1-araa菌株的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。
本发明优选使用lb液体培养基对重组e.colibl21/pany1-araa菌株进行液体培养，所述液体培养的条件优选包括：所述液体培养的温度优选为37℃，所述液体培养的转速优选为200rpm。
本发明将培养液与iptg混合，得到混合液，所述混合液中iptg的浓度优选为1mm。在本发明中，所述诱导的条件优选包括：所述诱导的温度优选为25℃，所述诱导的转速优选为120rpm。
在本发明中，所述离心后收集细胞后还优选包括：用含质量百分含量为2％triton-x-100的磷酸钠缓冲液处理细胞30min后，离心收集细胞，得到含l-阿拉伯糖异构酶的重组静息细胞。在本发明中，所述离心的条件优选包括：所述离心的转速优选为8000rpm，所述离心的温度优选为4℃，所述离心的时间优选为10min。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
重组e.colibl21/pany1-araa的构建与表达
1、根据植物乳杆菌的编码l-ai的araa基因序列和载体pany1上多克隆位点及同源臂的特征，利用生物信息学软件设计合成上游引物f(seqidno.1):
2、以筛选的植物乳杆菌基因组dna为模板，pcr扩增目的基因araa,pcr反应参数：预变性：98℃、3min，变性：98℃、10s，退火：58℃、30s，延伸：72℃、22s，终延伸：72℃、10min，35个循环；
3、所得的pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为1.5kb的电泳条带，如图1所示，将pcr产物利用产物纯化试剂盒获得纯化的araa基因；
4、pany1质粒经stui双酶切线性化后利用切胶纯化获得线性化质粒，按照一步克隆试剂盒的方法将步骤3中的araa基因与线性化质粒进行重组质粒构建；通过化学转化方法将重组质粒转化于e.coli中，通过pcr验证、提取质粒验证以及测序验证筛选转化成功的阳性克隆子，保存并命名为e.colibl21/pany1-araa；
5、将重组子e.colibl21/pany1-araa接种于lb培养基(酵母粉10g/l、胰蛋白胨20g/l、氯化钠20g/l)中，37℃、200rpm振荡培养至od600值为0.4～0.6之间，加入终浓度为1mm的iptg诱导物，25℃、120rpm低速过夜诱导后l-ai表达，利用sds-page检测l-ai的表达情况，以不加iptg诱导的重组菌为空白对照，如图2所示，可知l-ai得以正确高效表达。
实施例2
静息细胞的制备
1、将实施例1得到的重组e.colibl21/pany1-araa大体积培养至od600值为0.4～0.6后加入终浓度为1mm的iptg，25℃过夜诱导l-ai的表达；
2、8000rpm、4℃冷冻离心诱导表达后的菌液10min收集细胞，弃上清；
3、利用含2％triton-x-100的100mm磷酸钠缓冲液(ph7.4)室温处理30min，8000rpm、4℃冷冻离心10min再次收集细胞，弃上清；
4、利用100mm磷酸钠(ph7.4)缓冲液洗涤细胞两次，弃上清后制成含胞内酶l-ai的重组静息细胞。
实施例3
两阶段一步法(ssb)高效生产d-塔格糖
1、利用100mm、ph6.5、5mmmnso4的磷酸钠缓冲液制备含140g/l乳糖的乳清粉底物溶液；
2、以250uβ-半乳糖苷酶/g乳糖加入一定量β-半乳糖苷酶于底物溶液中，同时加入20g/l静息细胞于底物溶液中，混匀后50℃下低速摇匀转化48h，此为第一阶段的48h，取样测定转化液中剩余乳糖、水解产生的未被转化的d-半乳糖以及生成的d-塔格糖的含量。
结果显示，经48h转化后转化液中剩余乳糖的含量为5.21g/l、d-半乳糖的含量为32.1g/l及生成的d-塔格糖的含量为35.4g/l；此时d-半乳糖到d-塔格糖的转化率为52.4％，乳糖到d-塔格糖的转化率为25.2％。
3、离心去除第一阶段中已经用于生物转化乳糖水解生成的d-半乳糖合成d-塔格糖的含l-ai的静息细胞，以此混合液作为第二阶段的底物溶液；
4、按20g/l加入新鲜的含l-ai的静息细胞以及根据第一阶段所剩余的少量乳糖按250uβ-半乳糖苷酶/g乳糖加入一定量β-半乳糖苷酶于第二阶段的底物溶液中，混匀后50℃下低速摇匀转化48h，此为第二阶段的48h，测定转化液中剩余乳糖、d-半乳糖以及生成的d-塔格糖的含量。
结果显示，第二阶段转化48h后转化液中剩余乳糖含量为0.2g/l、水解生成的未被转化的d-半乳糖为9.5g/l及生成的d-塔格糖分别为和60.6g/l；此时d-半乳糖到d-塔格糖的转化率由第一阶段的52.4％提高到86.4％，乳糖到d-塔格糖的转化率由第一阶段的25.2％提高到43.3％。
实施例4
两阶段一步法生产d-塔格糖
1、利用100mm、ph6、4mmmnso4的磷酸钠缓冲液制备含120g/l乳糖的乳清粉底物溶液；
2、以250uβ-半乳糖苷酶/g乳糖加入一定量β-半乳糖苷酶于底物溶液中，同时加入15g/l静息细胞于底物溶液中，混匀后45℃下低速摇匀转化36h，此为第一阶段的36h，取样测定转化液中剩余乳糖、水解产生的未被转化的d-半乳糖以及生成的d-塔格糖的含量。
结果显示，经36h转化后转化液中剩余乳糖的含量为10.35g/l、d-半乳糖的含量为30.3g/l及生成的d-塔格糖的含量为24.4g/l；此时d-半乳糖到d-塔格糖的转化率为44.6％，乳糖到d-塔格糖的转化率为20.2％。
3、离心去除第一阶段中已经用于生物转化乳糖水解生成的d-半乳糖合成d-塔格糖的含l-ai的静息细胞，以此混合液作为第二阶段的底物溶液；
4、按15g/l加入新鲜的含l-ai的静息细胞以及根据第一阶段所剩余的少量乳糖按250uβ-半乳糖苷酶/g乳糖加入一定量β-半乳糖苷酶于第二阶段的底物溶液中，混匀后45℃下低速摇匀转化36h，此为第二阶段的36h，测定转化液中剩余乳糖、d-半乳糖以及生成的d-塔格糖的含量。
结果显示，第二阶段转化36h后转化液中剩余乳糖含量为0.5g/l、水解生成的未被转化的d-半乳糖为15.5g/l及生成的d-塔格糖分别为44.09g/l；此时d-半乳糖到d-塔格糖的转化率由第一阶段的44.6％提高到73.4％，乳糖到d-塔格糖的转化率由第一阶段的20.2％提高到36.3％。
实施例5
两阶段一步法生产d-塔格糖
1、利用100mm、ph7、6mmmnso4的磷酸钠缓冲液制备含160g/l乳糖的乳清粉底物溶液；
2、以250uβ-半乳糖苷酶/g乳糖加入一定量β-半乳糖苷酶于底物溶液中，同时加入30g/l静息细胞于底物溶液中，混匀后55℃下低速摇匀转化60h，此为第一阶段的60h，取样测定转化液中剩余乳糖、水解产生的未被转化的d-半乳糖以及生成的d-塔格糖的含量。
结果显示，经60h转化后转化液中剩余乳糖的含量为6.21g/l、d-半乳糖的含量为38.3g/l及生成的d-塔格糖的含量为38.8g/l；此时d-半乳糖到d-塔格糖的转化率为50.6％，乳糖到d-塔格糖的转化率为27.7％。
3、离心去除第一阶段中已经用于生物转化乳糖水解生成的d-半乳糖合成d-塔格糖的含l-ai的静息细胞，以此混合液作为第二阶段的底物溶液；
4、按30g/l加入新鲜的含l-ai的静息细胞以及根据第一阶段所剩余的少量乳糖按250uβ-半乳糖苷酶/g乳糖加入一定量β-半乳糖苷酶于第二阶段的底物溶液中，混匀后55℃下低速摇匀转化60h，此为第二阶段的60h，测定转化液中剩余乳糖、d-半乳糖以及生成的d-塔格糖的含量。
结果显示，第二阶段转化60h后转化液中剩余乳糖含量为0.5g/l、水解生成的未被转化的d-半乳糖为12.5g/l及生成的d-塔格糖分别为66.79g/l；此时d-半乳糖到d-塔格糖的转化率由第一阶段的50.6％提高到83.7％，乳糖到d-塔格糖的转化率由第一阶段的27.7％提高到41.7％。
对比例1
三种不同技术路线由乳清生产d-塔格糖的比较
由乳清生产d-塔格糖需经β-半乳糖苷酶水解乳糖生成半乳糖后再经l-ai生物催化合成d-塔格糖，因此，上述反应可分为分别水解和生物转化(separatehydrolysisandbiotransformation,shb),同时水解和生物转化(simultaneoussaccharificationandbiotransformation,ssb)。shb和ssb均有其优缺点，在shb中，水解和生物转化均能在最佳条件下进行，但是水解产物的积累可能会导致生物转化受到底物抑制，抑制酶活力最终导致转化率低；在ssb中，消除了水解产生的单糖积累引起的酶的抑制作用，提高产量，并且ssb操作简单，缩短了反应时间，但不能同时满足水解和生物转化的最优条件。有鉴于此，本发明通过研究不同程度的乳糖水解后进行生物转化进行探索，旨在得出最有利于由乳清生产d-塔格糖的技术路线。分别设定了100％乳糖水解后进行生物转化(shb)，50％乳糖水解后进行生物转化(semi-ssb)以及0％乳糖水解后进行生物转化(ssb)。对于shb，首先利用ph7的磷酸盐缓冲液制备60g/l乳糖含量的乳清粉底物溶液，加入250uβ-半乳糖苷酶/g乳糖在50℃下水浴反应12h实现100％的乳糖水解，而后加入20g/l含l-ai的基因工程菌静息细胞在50℃下生物转化48h后测定d-塔格糖的产量。对于semi-ssb，在ph7的底物溶液条件下，以150uβ-半乳糖苷酶/g乳糖条件下50℃反应7h实现乳糖水解50％后，随后加入20g/l的含l-ai的基因工程菌静息细胞以及100uβ-半乳糖苷酶/g乳糖进行生物转化48h后测定d-塔格糖的产量。对于ssb，制备相同乳糖含量的ph7的乳清粉底物溶液，同时添加250uβ-半乳糖苷酶/g乳糖以及20g/l的含l-ai的基因工程菌静息细胞，50℃下反应48h后测定d-塔格糖的产量。
如图3所示，在shb和semi-ssb中，d-塔格糖的产量为5.7g/l，但对于ssb，d-塔格糖产量约为前两者的两倍，为11.2g/l。即一步法(ssb)生产能最有效的生产d-塔格糖。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>江苏大学
<120>一种由乳清生产d-塔格糖的方法
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>36
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gggggatccactagtaggcctatgttatcagtacct36
<210>2
<211>36
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
caggagctcccatggaggcctttactttaagaatgc36
1.一种由乳清生产d-塔格糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以乳糖质量含量为70％的乳清粉为原料，利用磷酸钠缓冲液制备含120～160g/l乳糖的乳清粉溶液，得到底物溶液；
2)将编码l-阿拉伯糖异构酶的araa基因克隆到表达载体pany1中，经转化、筛选阳性克隆子获得重组e.colibl21/pany1-araa菌株，将所述菌株进行液体培养，当培养液的od600值为0.4～0.6时添加iptg诱导l-阿拉伯糖异构酶表达，离心后收集细胞，得到含l-阿拉伯糖异构酶的重组静息细胞；
3)将β-半乳糖苷酶与所述步骤1)得到的底物溶液、步骤2)得到的重组静息细胞混合，得到第一反应液，所述第一反应液在45～55℃下转化36～60h，得到第一转化液，除去重组静息细胞后，得到除去重组静息细胞液；
所述底物溶液中乳糖的质量与β-半乳糖苷酶的酶活比为1g:250u；
所述第一反应液中重组静息细胞的质量浓度为15～30g/l；
4)将所述步骤3)得到的除去重组静息细胞液与β-半乳糖苷酶、所述步骤2)重组静息细胞混合，得到第二反应液，所述第二反应液在45～55℃下转化36～60h，得到d-塔格糖；
所述除去重组静息细胞液中乳糖的质量与β-半乳糖苷酶的酶活比为1g:250u；
所述第二反应液中重组静息细胞的质量浓度为15～30g/l。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)磷酸钠缓冲液含有4～6mm的mnso4，所述磷酸钠缓冲液的ph值为6～7。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增步骤2)araa基因使用的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，扩增步骤2)araa基因使用的程序为：98℃3min；98℃10s，58℃30s；72℃22s，35个循环；72℃10min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)培养液添加iptg，所述培养液中添加的iptg的终浓度为1mm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)诱导的条件包括：所述诱导的温度为25℃，所述诱导的转速为120rpm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)离心后收集细胞后还包括：用含质量百分含量为2％triton-x-100的磷酸钠缓冲液处理细胞30min后，离心收集细胞，得到含l-阿拉伯糖异构酶的重组静息细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)液体培养的条件包括：所述液体培养的温度为37℃，所述液体培养的转速为200rpm。
9.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述步骤2)离心的条件包括：所述离心的转速为8000rpm，所述离心的温度为4℃，所述离心的时间为10min。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)液体培养使用的培养基包括lb液体培养基。
技术总结