本发明涉及生物制药技术领域，特别是涉及一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12高产菌株的筛选方法和筛选培养基。
背景技术：
维生素b12又称钴胺素，它是一系列含有以钴原子为中心的咕啉核和以5，6～二甲苯并咪唑为碱基的核苷酸，并对人和动物具有生物活性的类咕啉同功维生素总称，主要活性品种有氰钴铵、羟钻铵、腺苷钴铵和甲钴铵。
人类和动植物都不能合成维生素b12，而维生素b12又是人体组织代谢过程中必需的维生素，是人和其它哺乳动物维持生长和促进红细胞生长的重要因子，具有广泛的生理作用，参与体内甲基转换及叶酸代谢，促进神经髓鞘中脂蛋白的形成，保持中枢神经和外围髓鞘神经纤维的功能完整。因此，维生素b12主要用于治疗恶性贫血,亦与叶酸合用用于治疗各种巨幼红细胞性贫血、抗叶酸药引起的贫血及脂肪泻。还用于神经系统疾病(如神经炎、神经萎缩)的治疗等。
目前国内外商品化的维生素b12生产，几乎都是通过微生物发酵法进行的。其中，因脱氮假单胞杆菌好氧合成维生素b12的途径清晰明了且维生素b12产率高，因此几乎都是使用脱氮假单胞杆菌来作为生产维生素b12的工业菌株。脱氮假单胞杆菌好氧发酵生产维生素b12的过程控制条件比较严格，一旦控制不好就会导致菌体发虚早衰进而影响维生素b12的产量。因此，发酵过程中选择高产的菌株并维持脱氮假单胞杆菌的形态及活力至关重要。此外，在生产实践中，选育出产物产量高,遗传性状稳定和发酵条件优良的菌株对于维生素b12的微生物发酵生产具有非常现实的意义。
现有工艺一般将冷冻保藏的菌株活化后即用于发酵生产，由于脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12菌株突变率较高，多次传代后，发酵单位忽高忽低，不利于工业生产。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明根据脱氮假单胞菌的生长特性，提供了一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12高产菌株的筛选方法以及筛选培养基，采用温和的菌株逐级活化的方法对生产菌株进行复筛，筛选出高产菌株，可有效避免菌株活化不足，生产能力降低导致生产成本偏高。
本发明提供的技术方案为一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12高产菌株的筛选方法，包括下述步骤：
步骤一：将一级固体种子培养基消毒灭菌，分装到无菌平皿中；平皿中培养基冷却凝固后，在无菌室使用产维生素b12脱氮假单胞菌菌株进行平板稀释涂布；平板稀释涂布完成，将平皿置入恒温培养箱中进行培养；
步骤二：将二级固体种子培养基消毒灭菌，分装到无菌试管中，制成二级固体种子培养基试管斜面；二级固体种子培养基试管中培养基冷却凝固后，挑选步骤一中培养完成的脱氮假单胞菌单菌落，在无菌室中分别划线接种到二级固体种子培养基试管斜面中；二级固体种子培养基试管斜面分别接种单菌落完成后，将其置入恒温培养箱中进行培养；
步骤三：将三级固体种子培养基消毒灭菌，分装到无菌试管中，制成三级固体种子培养基试管斜面；三级固体种子培养基试管中培养基冷却凝固后，将步骤二中培养完成的试管斜面内脱氮假单胞菌菌体，在无菌室中分别划线接种到三级固体种子培养基试管斜面中，每个试管斜面分别编号；接种完成后，将三级固体种子培养基试管斜面置入恒温培养箱中进行培养；
步骤四：配制摇瓶种子液体培养基，并分装到种子摇瓶中；分装完成后进行消毒灭菌，灭菌完成后的摇瓶种子液体培养基冷却后，将步骤三中培养完成的三级固体种子培养基试管斜面内脱氮假单胞菌菌体，在无菌室中分别接种到摇瓶种子液体培养基中，每个种子摇瓶分别编号并与三级固体种子培养基试管斜面一一对应；接种完成后，将三级固体种子培养基试管斜面在无菌室密封好后冷藏，将种子摇瓶置入恒温摇床中进行培养；
步骤五：配制摇瓶液体发酵培养基，并分装到发酵摇瓶中；分装完成后进行消毒灭菌，灭菌完成后的摇瓶液体发酵培养基冷却后，将步骤四中培养完成的脱氮假单胞菌摇瓶种子液，在无菌室中分别接种到摇瓶液体发酵培养基中，每个发酵摇瓶分别编号并与种子摇瓶一一对应；接种完成后，将发酵摇瓶置入恒温摇床中进行培养；
步骤六：摇瓶发酵培养完成后，使用高压液相色谱法检测每个编号的发酵摇瓶中维生素b12的含量，得到含量最高的发酵摇瓶编号；
步骤七：将含量最高的发酵摇瓶编号对应的三级固体种子培养基试管斜面取出，用做生产发酵的菌株。
而且，配制摇瓶补料液体培养基，分装完成后进行消毒灭菌，灭菌完成后的摇瓶补料液体培养基置于无菌室冷却；步骤五中，脱氮假单胞菌摇瓶发酵培养至第四天开始，每天在无菌室向每个发酵摇瓶补料，所述补料为向发酵摇瓶中补入摇瓶补料液体。
而且，步骤一中平板稀释涂布稀释倍数最高在107～109，平板培养温度为28～30℃，培养时间为2～3天；步骤二中挑选脱氮假单胞菌单菌落个数为10～50个，试管斜面培养温度为28～30℃，培养时间为2～3天；步骤三中三级固体种子培养基试管斜面培养温度为28～30℃，培养时间为2～3天；步骤四中摇瓶种子液体培养基容器为250ml锥形瓶，每个锥形瓶装液54～60ml，摇瓶培养温度为28～30℃，转速为70～120rpm，培养时间为20～28小时；步骤五中摇瓶液体发酵培养基容器为250ml锥形瓶，每个锥形瓶装液54～60ml，每个摇瓶接种量为4～6ml，摇瓶培养温度为31～33℃，转速为100～150rpm，培养时间为7～10天；每个发酵摇瓶补充摇瓶补料液体培养基4～6ml。
一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12高产菌株的筛选培养基，其特征在于：包括一级固体种子培养基、二级固体种子培养基、三级固体种子培养基、摇瓶液体种子培养基、摇瓶液体发酵培养基和摇瓶发酵补料培养基，所述一级固体种子培养基、二级固体种子培养基、三级固体种子培养基、摇瓶种子液体培养基、摇瓶液体发酵培养基和摇瓶发酵补料培养基均含有由甜菜根压榨制得的红糖。
而且，所述一级固体种子培养基的组成至少包括：红糖56～64g/l，甜菜碱1～2g/l，磷酸氢二钾1.4～2.1g/l，硫酸铵0.2～0.3g/l，硫酸镁0.6～0.8g/l，硫酸锌0.73～0.92g/l，琼脂20～30g/l。
而且，所述二级固体种子培养基的组成至少包括：红糖68～92g/l，玉米浆1.5～3.5g/l，甜菜碱9.8～12.2g/l，磷酸氢二钾1.4～2.1g/l，硫酸铵0.2～0.3g/l，硫酸镁0.6～0.8g/l，氧化镁0.04～0.06g/l，硫酸锌1.2～2.4g/l，琼脂20～30g/l。
而且，所述三级固体种子培养基的组成至少包括：红糖80～100g/l，甜菜碱10～12g/l，磷酸氢二钾1.5～3g/l，硫酸铵0.4～0.6g/l，硫酸镁0.8～1.2g/l，硫酸锌1.6～1.8g/l，5，6-二甲基苯并咪唑0.15～0.3g/l，氯化钴0.2～0.4g/l，琼脂20～30g/l。
而且，所述摇瓶液体种子培养基组成至少包括：红糖30～50g/l，玉米浆8～12g/l，甜菜碱3～5g/l，磷酸氢二钾1.5～3g/l，硫酸铵0.9～1.3g/l，硫酸镁1.8～2.2g/l，氧化镁0.04～0.06g/l，硫酸锌0.3～0.4g/l，5，6-二甲基苯并咪唑0.3～0.4g/l，氯化钴0.45～0.6g/l。
而且，所述摇瓶发酵培养基组成至少包括：红糖60～100g/l，玉米浆26～34g/l，甜菜碱6～10g/l，磷酸氢二钾3～6g/l，硫酸铵1.8～2.6g/l，硫酸镁1.8～2.2g/l，氧化镁0.04～0.06g/l，硫酸锌0.6～0.8g/l，5，6-二甲基苯并咪唑0.6～0.8g/l，氯化钴0.9～1.2g/l，碳酸钙0.6～1.2g/l，聚醚性消泡剂gpe0.4～0.6g/l。
而且，所述摇瓶补料培养基组成至少包括：红糖260～340g/l，甜菜碱96～124g/l，5，6-二甲基苯并咪唑0.1～0.2g/l，氯化钴0.1～0.2g/l。
本发明所提供的脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12高产菌株筛选培养基逐渐变化配方成分，使用该培养基可以使菌株的生命活性逐渐恢复，回复菌株生产活性，使菌株更能适应于发酵生产，避免了菌株活化不足，生产能力降低的问题，而且该筛选培养基中不含抗生素。相对于其他抗生素抗性筛选、营养缺陷细胞筛选等方法，使用本发明所提供的脱氮假单胞菌菌株筛选方法符合该菌株的特点，避免造成抗生素污染的同时，又可以很好的筛选出高产维生素b12菌株，保证用于发酵生产的菌株能力不断趋于最高最强，提高了发酵生产水平，还避免了菌株突变，导致发酵生产单位突然降低，生产成本上升的问题。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1
一级固体种子培养基的配置及单菌落培养：
精确称取红糖28g，甜菜碱0.5g，磷酸氢二钾0.7g，硫酸铵0.1g，硫酸镁0.3g，硫酸锌0.365g。将以上原料分别加少量水完全溶解，混合后定容到500ml；再精确称取琼脂10g，加入到混合液中，并加热使琼脂混合均匀，使一级固体种子培养基整体呈糊状。将一级固体种子培养基分装到两个500ml锥形瓶中，每个装250ml，分装完成后，将锥形瓶用棉塞牛皮纸封口；同时准备20个平皿用牛皮纸包好，和一级固体种子培养基一起放入灭菌锅消毒灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。灭菌完成后将装有一级固体种子培养基的两个500ml锥形瓶及包好的20个平皿放入无菌室等待培养基冷却凝固。
平皿中一级固体种子培养基冷却凝固后，即可在无菌室使用产维生素b12脱氮假单胞菌菌株进行平板稀释涂布；使用无菌水将脱氮假单胞菌菌株甘油管菌液稀释，稀释倍数从10、102、103依次至107倍，并分别涂布在一级固体种子培养基平皿上；涂布完成后将平皿放置在温度设置为28℃的恒温培养箱中进行培养；待培养3天后，进行下一步。
二级固体种子培养基的配置及种子活化培养：
精确称取红糖34g，玉米浆0.75g，甜菜碱4.9g，磷酸氢二钾0.7g，硫酸铵0.1g，硫酸镁0.3g，氧化镁0.02g，硫酸锌0.6g。将以上原料分别加少量水完全溶解，混合后定容到500ml；再精确称取琼脂10g，加入到混合液中，并加热使琼脂混合均匀，使二级固体种子培养基整体呈糊状。将二级固体种子培养基分装到20个试管中，每个装20ml；分装完成后，将试管用棉塞牛皮纸封口再放入灭菌锅消毒灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。灭菌完成后将装有二级固体种子培养基的试管倾斜摆放入无菌室等待培养基冷却凝固。
试管中培养基冷却凝固后，挑选培养完成的脱氮假单胞菌单菌落20个，在无菌室中分别划线接种到试管斜面中，并将试管依次编号为a1、a2、a3至a20；试管斜面分别接种单菌落完成后，将其置入温度设置为28℃的恒温培养箱中进行培养；待培养3天后，进行下一步。
三级固体种子培养基的配置及种子活化培养：
精确称取红糖40g，甜菜碱5g，磷酸氢二钾0.75g，硫酸铵0.2g，硫酸镁0.4g，硫酸锌0.8g，5，6-二甲基苯并咪唑0.75g，氯化钴0.1g。将以上原料分别加少量水完全溶解，混合后定容到500ml；再精确称取琼脂10g，加入到混合液中，并加热使琼脂混合均匀，使三级固体种子培养基整体呈糊状。将三级固体种子培养基分装到20个试管中，每个装20ml；分装完成后，将试管用棉塞牛皮纸封口再放入灭菌锅消毒灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。灭菌完成后将装有三级固体种子培养基的试管倾斜摆放入无菌室等待培养基冷却凝固。
试管中培养基冷却凝固后，将试管斜面a1、a2、a3至a20内脱氮假单胞菌菌体，在无菌室中分别划线接种到三级固体种子培养基试管斜面中，每个试管斜面分别编号为b1、b2、b3至b20；接种完成后，将三级固体种子培养基试管斜面置入温度设置为28℃的恒温培养箱中进行培养；待培养3天后，进行下一步。
摇瓶液体种子培养基的配置及摇瓶种子液制备：
精确称取红糖45g，玉米浆12g，甜菜碱4.5g，磷酸氢二钾2.25g，硫酸铵1.35g，硫酸镁2.7g，氧化镁0.06g，硫酸锌0.45g，5，6-二甲基苯并咪唑0.45g，氯化钴0.675g。将以上原料分别加少量水完全溶解，混合后定容到1500ml；在将混合液分装到20个250ml锥形瓶中，每瓶装60ml，并用纱布牛皮纸封口；分装完成后，将锥形瓶放入灭菌锅消毒灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。灭菌完成后将装有摇瓶液体种子培养基的锥形瓶放入无菌室等待培养基冷却。
摇瓶液体种子培养基冷却后，将b1、b2、b3至b20试管斜面内脱氮假单胞菌菌体，在无菌室中分别接种到摇瓶种子液体培养基中，每个摇瓶分别依次编号c1、c2、c3至c20；接种完成后，将三级固体种子培养基试管斜面在无菌室密封好后置于﹣4℃冰箱冷藏，将摇瓶置入温度设置为28℃，转速为70rpm的恒温摇床中进行培养；待培养28小时后，进行下一步。
摇瓶液体发酵培养基的配置及摇瓶发酵培养：
精确称取红糖90g，玉米浆39g，甜菜碱9g，磷酸氢二钾4.5g，硫酸铵2.7g，硫酸镁2.7g，氧化镁0.06g，硫酸锌0.9g，5，6-二甲基苯并咪唑0.9g，氯化钴1.35g。将以上原料分别加少量水完全溶解，混合后定容到1500ml，再加碳酸钙0.9g以及入聚醚性消泡剂gpe0.6g；在将混合液分装到20个250ml锥形瓶中，每瓶装60ml，并用纱布牛皮纸封口；分装完成后，将锥形瓶放入灭菌锅消毒灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。灭菌完成后将装有摇瓶液体种子培养基的锥形瓶放入无菌室等待培养基冷却。
摇瓶液体发酵培养基冷却后，将c1、c2、c3至c20号摇瓶内的的脱氮假单胞菌摇瓶种子液，在无菌室中分别接种到摇瓶液体发酵培养基中，每个摇瓶接种量为6ml，每个发酵摇瓶分别依次编号为d1、d2、d3至d20；接种完成后，将摇瓶置入温度设置为31℃，转速为100rpm的恒温摇床中培养10天。
摇瓶补料培养基的配置及发酵摇瓶补料：
精确称取红糖390g，甜菜碱144g，5，6-二甲基苯并咪唑0.15g，氯化钴0.15g。将以上原料分别加部分水完全溶解，混合后定容到1500ml；在将混合液分装到7个250ml锥形瓶中，每瓶装150ml，并用纱布牛皮纸封口；分装完成后，将锥形瓶放入灭菌锅消毒灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。灭菌完成后将装有摇瓶补料培养基的锥形瓶放入无菌室等待培养基冷却。
从摇瓶发酵培养第四天开始，每天在无菌室使用移液枪向每个发酵摇瓶补充冷却后的摇瓶补料培养基，每个发酵摇瓶补充6ml，直至第10天，结束摇瓶发酵培养。
摇瓶发酵液检测与高产菌株选取：摇瓶发酵培养完成后，将d1、d2、d3至d20的摇瓶发酵液取样检测，使用高压液相色谱法检测每个编号的发酵摇瓶中维生素b12的含量，得到含量最高的摇瓶编号为d5，vb12含量为220mg/l；选取b5作为生产发酵菌株，最终生产发酵单位为275mg/l。
实施例2
一级固体种子培养基的配置及单菌落培养：
精确称取红糖32g，甜菜碱1g，磷酸氢二钾1.05g，硫酸铵0.15g，硫酸镁0.4g，硫酸锌0.46g。将以上原料分别加少量水完全溶解，混合后定容到500ml；再精确称取琼脂15g，加入到混合液中，并加热使琼脂混合均匀，使一级固体种子培养基整体呈糊状。将一级固体种子培养基分装到两个500ml锥形瓶中，每个装250ml，分装完成后，将锥形瓶用棉塞牛皮纸封口；同时准备20个平皿用牛皮纸包好，和一级固体种子培养基一起放入灭菌锅消毒灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。灭菌完成后将装有一级固体种子培养基的两个500ml锥形瓶及包好的20个平皿放入无菌室等待培养基冷却凝固。
平皿中一级固体种子培养基冷却凝固后，即可在无菌室使用产维生素b12脱氮假单胞菌菌株进行平板稀释涂布；使用无菌水将脱氮假单胞菌菌株甘油管菌液稀释，稀释倍数从10、102、103依次至107倍，并分别涂布在一级固体种子培养基平皿上；涂布完成后将平皿放置在温度设置为28℃的恒温培养箱中进行培养；待培养3天后，进行下一步。
二级固体种子培养基的配置及种子活化培养：
精确称取红糖46g，玉米浆1.75g，甜菜碱6.1g，磷酸氢二钾1.05g，硫酸铵0.15g，硫酸镁0.4g，氧化镁0.03g，硫酸锌1.2g。将以上原料分别加少量水完全溶解，混合后定容到500ml；再精确称取琼脂15g，加入到混合液中，并加热使琼脂混合均匀，使二级固体种子培养基整体呈糊状。将二级固体种子培养基分装到20个试管中，每个装20ml；分装完成后，将试管用棉塞牛皮纸封口再放入灭菌锅消毒灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。灭菌完成后将装有二级固体种子培养基的试管倾斜摆放入无菌室等待培养基冷却凝固。
试管中培养基冷却凝固后，挑选培养完成的脱氮假单胞菌单菌落20个，在无菌室中分别划线接种到试管斜面中，并将试管依次编号为a1、a2、a3至a20；试管斜面分别接种单菌落完成后，将其置入温度设置为28℃的恒温培养箱中进行培养；待培养3天后，进行下一步。
三级固体种子培养基的配置及种子活化培养：
精确称取红糖50g，甜菜碱6g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸铵0.3g，硫酸镁0.6g，硫酸锌0.9g，5，6-二甲基苯并咪唑0.15g，氯化钴0.2g。将以上原料分别加少量水完全溶解，混合后定容到500ml；再精确称取琼脂15g，加入到混合液中，并加热使琼脂混合均匀，使三级固体种子培养基整体呈糊状。将三级固体种子培养基分装到20个试管中，每个装20ml；分装完成后，将试管用棉塞牛皮纸封口再放入灭菌锅消毒灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。灭菌完成后将装有三级固体种子培养基的试管倾斜摆放入无菌室等待培养基冷却凝固。
试管中培养基冷却凝固后，将试管斜面a1、a2、a3至a20内脱氮假单胞菌菌体，在无菌室中分别划线接种到三级固体种子培养基试管斜面中，每个试管斜面分别编号为b1、b2、b3至b20；接种完成后，将三级固体种子培养基试管斜面置入温度设置为28℃的恒温培养箱中进行培养；待培养3天后，进行下一步。
摇瓶液体种子培养基的配置及摇瓶种子液制备：
精确称取红糖75g，玉米浆18g，甜菜碱7.5g，磷酸氢二钾4.5g，硫酸铵1.95g，硫酸镁3.3g，氧化镁0.09g，硫酸锌0.6g，5，6-二甲基苯并咪唑0.6g，氯化钴0.95g。将以上原料分别加少量水完全溶解，混合后定容到1500ml；在将混合液分装到20个250ml锥形瓶中，每瓶装60ml，并用纱布牛皮纸封口；分装完成后，将锥形瓶放入灭菌锅消毒灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。灭菌完成后将装有摇瓶液体种子培养基的锥形瓶放入无菌室等待培养基冷却。
摇瓶液体种子培养基冷却后，将b1、b2、b3至b20试管斜面内脱氮假单胞菌菌体，在无菌室中分别接种到摇瓶种子液体培养基中，每个摇瓶分别依次编号c1、c2、c3至c20；接种完成后，将三级固体种子培养基试管斜面在无菌室密封好后置于﹣4℃冰箱冷藏，将摇瓶置入温度设置为28℃，转速为70rpm的恒温摇床中进行培养；待培养28小时后，进行下一步。
摇瓶液体发酵培养基的配置及摇瓶发酵培养：
精确称取红糖150g，玉米浆51g，甜菜碱15g，磷酸氢二钾9g，硫酸铵3.9g，硫酸镁3.3g，氧化镁0.09g，硫酸锌1.2g，5，6-二甲基苯并咪唑1.2g，氯化钴1.8g。将以上原料分别加少量水完全溶解，混合后定容到1500ml，再加入碳酸钙1.8g以及聚醚性消泡剂gpe0.9g；在将混合液分装到20个250ml锥形瓶中，每瓶装60ml，并用纱布牛皮纸封口；分装完成后，将锥形瓶放入灭菌锅消毒灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。灭菌完成后将装有摇瓶液体种子培养基的锥形瓶放入无菌室等待培养基冷却。
摇瓶液体发酵培养基冷却后，将c1、c2、c3至c20号摇瓶内的的脱氮假单胞菌摇瓶种子液，在无菌室中分别接种到摇瓶液体发酵培养基中，每个摇瓶接种量为6ml，每个发酵摇瓶分别依次编号为d1、d2、d3至d20；接种完成后，将摇瓶置入温度设置为31℃，转速为100rpm的恒温摇床中培养10天。
摇瓶补料培养基的配置及发酵摇瓶补料：
精确称取红糖510g，甜菜碱186g，5，6-二甲基苯并咪唑0.3g，氯化钴0.3g。将以上原料分别加部分水完全溶解，混合后定容到1500ml；在将混合液分装到7个250ml锥形瓶中，每瓶装150ml，并用纱布牛皮纸封口；分装完成后，将锥形瓶放入灭菌锅消毒灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。灭菌完成后将装有摇瓶补料培养基的锥形瓶放入无菌室等待培养基冷却。
从摇瓶发酵培养第四天开始，每天在无菌室使用移液枪向每个发酵摇瓶补充冷却后的摇瓶补料培养基，每个发酵摇瓶补充6ml，直至第10天，结束摇瓶发酵培养。
摇瓶发酵液检测与高产菌株选取：摇瓶发酵培养完成后，将d1、d2、d3至d20的摇瓶发酵液取样检测，使用高压液相色谱法检测每个编号的发酵摇瓶中维生素b12的含量，得到含量最高的摇瓶编号为d18，vb12含量为230mg/l；选取b18作为生产发酵菌株，最终生产发酵单位为281mg/l。
实施例3
一级固体种子培养基的配置及单菌落培养：
精确称取红糖60g，甜菜碱1.5g，磷酸氢二钾1.8g，硫酸铵0.25g，硫酸镁0.7g，硫酸锌0.83g。将以上原料分别加少量水完全溶解，混合后定容到1000ml；再精确称取琼脂25g，加入到混合液中，并加热使琼脂混合均匀，使一级固体种子培养基整体呈糊状。将一级固体种子培养基分装到4个500ml锥形瓶中，每个装250ml，分装完成后，将锥形瓶用棉塞牛皮纸封口；同时准备20个平皿用牛皮纸包好，和一级固体种子培养基一起放入灭菌锅消毒灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。灭菌完成后将装有一级固体种子培养基的4个500ml锥形瓶及包好的30个平皿放入无菌室等待培养基冷却凝固。
平皿中一级固体种子培养基冷却凝固后，即可在无菌室使用产维生素b12脱氮假单胞菌菌株进行平板稀释涂布；使用无菌水将脱氮假单胞菌菌株甘油管菌液稀释，稀释倍数从10、102、103依次至109倍，并分别涂布在一级固体种子培养基平皿上；涂布完成后将平皿放置在温度设置为28℃的恒温培养箱中进行培养；待培养2天后，进行下一步。
二级固体种子培养基的配置及种子活化培养：
精确称取红糖80g，玉米浆2.5g，甜菜碱11.1g，磷酸氢二钾1.8g，硫酸铵0.25g，硫酸镁0.7g，氧化镁0.05g，硫酸锌1.8g。将以上原料分别加少量水完全溶解，混合后定容到1000ml；再精确称取琼脂25g，加入到混合液中，并加热使琼脂混合均匀，使二级固体种子培养基整体呈糊状。将二级固体种子培养基分装到20个试管中，每个装25ml；分装完成后，将试管用棉塞牛皮纸封口再放入灭菌锅消毒灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。灭菌完成后将装有二级固体种子培养基的试管倾斜摆放入无菌室等待培养基冷却凝固。
试管中培养基冷却凝固后，挑选培养完成的脱氮假单胞菌单菌落30个，在无菌室中分别划线接种到试管斜面中，并将试管依次编号为a1、a2、a3至a30；试管斜面分别接种单菌落完成后，将其置入温度设置为28℃的恒温培养箱中进行培养；待培养2天后，进行下一步。
三级固体种子培养基的配置及种子活化培养：
精确称取红糖90g，甜菜碱11g，磷酸氢二钾2.25g，硫酸铵0.5g，硫酸镁1g，硫酸锌1.7g，5，6-二甲基苯并咪唑0.225g，氯化钴0.3g。将以上原料分别加少量水完全溶解，混合后定容到1000ml；再精确称取琼脂25g，加入到混合液中，并加热使琼脂混合均匀，使三级固体种子培养基整体呈糊状。将三级固体种子培养基分装到30个试管中，每个装25ml；分装完成后，将试管用棉塞牛皮纸封口再放入灭菌锅消毒灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。灭菌完成后将装有三级固体种子培养基的试管倾斜摆放入无菌室等待培养基冷却凝固。
试管中培养基冷却凝固后，将试管斜面a1、a2、a3至a30内脱氮假单胞菌菌体，在无菌室中分别划线接种到三级固体种子培养基试管斜面中，每个试管斜面分别编号为b1、b2、b3至b30；接种完成后，将三级固体种子培养基试管斜面置入温度设置为28℃的恒温培养箱中进行培养；待培养2天后，进行下一步。
摇瓶液体种子培养基的配置及摇瓶种子液制备：
精确称取红糖85g，玉米浆20.4g，甜菜碱8.5g，磷酸氢二钾5.1g，硫酸铵2.21g，硫酸镁3.74g，氧化镁0.102g，硫酸锌0.68g，5，6-二甲基苯并咪唑0.68g，氯化钴1.02g。将以上原料分别加少量水完全溶解，混合后定容到1700ml；在将混合液分装到30个250ml锥形瓶中，每瓶装54ml，并用纱布牛皮纸封口；分装完成后，将锥形瓶放入灭菌锅消毒灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。灭菌完成后将装有摇瓶液体种子培养基的锥形瓶放入无菌室等待培养基冷却。
摇瓶液体种子培养基冷却后，将b1、b2、b3至b30试管斜面内脱氮假单胞菌菌体，在无菌室中分别接种到摇瓶种子液体培养基中，每个摇瓶分别依次编号c1、c2、c3至c30；接种完成后，将三级固体种子培养基试管斜面在无菌室密封好后置于﹣4℃冰箱冷藏，将摇瓶置入温度设置为28℃，转速为120rpm的恒温摇床中进行培养；待培养20小时后，进行下一步。
摇瓶液体发酵培养基的配置及摇瓶发酵培养：
精确称取红糖170g，玉米浆57.8g，甜菜碱17g，磷酸氢二钾10.2g，硫酸铵4.42g，硫酸镁3.74g，氧化镁0.102g，硫酸锌1.36g，5，6-二甲基苯并咪唑1.36g，氯化钴2.04g。将以上原料分别加少量水完全溶解，混合后定容到1700ml，再加入碳酸钙2.04g以及聚醚性消泡剂gpe1.02g；在将混合液分装到30个250ml锥形瓶中，每瓶装54ml，并用纱布牛皮纸封口；分装完成后，将锥形瓶放入灭菌锅消毒灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。灭菌完成后将装有摇瓶液体种子培养基的锥形瓶放入无菌室等待培养基冷却。
摇瓶液体发酵培养基冷却后，将c1、c2、c3至c30号摇瓶内的的脱氮假单胞菌摇瓶种子液，在无菌室中分别接种到摇瓶液体发酵培养基中，每个摇瓶接种量为6ml，每个发酵摇瓶分别依次编号为d1、d2、d3至d30；接种完成后，将摇瓶置入温度设置为31℃，转速为150rpm的恒温摇床中培养10天。
摇瓶补料培养基的配置及发酵摇瓶补料：
精确称取红糖510g，甜菜碱186g，5，6-二甲基苯并咪唑0.3g，氯化钴0.3g。将以上原料分别加部分水完全溶解，混合后定容到1500ml；在将混合液分装到7个250ml锥形瓶中，每瓶装150ml，并用纱布牛皮纸封口；分装完成后，将锥形瓶放入灭菌锅消毒灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。灭菌完成后将装有摇瓶补料培养基的锥形瓶放入无菌室等待培养基冷却。
从摇瓶发酵培养第四天开始，每天在无菌室使用移液枪向每个发酵摇瓶补充冷却后的摇瓶补料培养基，每个发酵摇瓶补充6ml，直至第10天，结束摇瓶发酵培养。
摇瓶发酵液检测与高产菌株选取：摇瓶发酵培养完成后，将d1、d2、d3至d30的摇瓶发酵液取样检测，使用高压液相色谱法检测每个编号的发酵摇瓶中维生素b12的含量，得到含量最高的摇瓶编号为d23，vb12含量为243mg/l；选取b23作为生产发酵菌株，最终生产发酵单位为283mg/l。
1.一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12高产菌株的筛选方法，其特征在于包括下述步骤：
步骤一：将一级固体种子培养基消毒灭菌，分装到无菌平皿中；平皿中培养基冷却凝固后，在无菌室使用产维生素b12脱氮假单胞菌菌株进行平板稀释涂布；平板稀释涂布完成，将平皿置入恒温培养箱中进行培养；
步骤二：将二级固体种子培养基消毒灭菌，分装到无菌试管中，制成二级固体种子培养基试管斜面；二级固体种子培养基试管中培养基冷却凝固后，挑选步骤一中培养完成的脱氮假单胞菌单菌落，在无菌室中分别划线接种到二级固体种子培养基试管斜面中；二级固体种子培养基试管斜面分别接种单菌落完成后，将其置入恒温培养箱中进行培养；
步骤三：将三级固体种子培养基消毒灭菌，分装到无菌试管中，制成三级固体种子培养基试管斜面；三级固体种子培养基试管中培养基冷却凝固后，将步骤二中培养完成的试管斜面内脱氮假单胞菌菌体，在无菌室中分别划线接种到三级固体种子培养基试管斜面中，每个试管斜面分别编号；接种完成后，将三级固体种子培养基试管斜面置入恒温培养箱中进行培养；
步骤四：配制摇瓶种子液体培养基，并分装到种子摇瓶中；分装完成后进行消毒灭菌，灭菌完成后的摇瓶种子液体培养基冷却后，将步骤三中培养完成的三级固体种子培养基试管斜面内脱氮假单胞菌菌体，在无菌室中分别接种到摇瓶种子液体培养基中，每个种子摇瓶分别编号并与三级固体种子培养基试管斜面一一对应；接种完成后，将三级固体种子培养基试管斜面在无菌室密封好后冷藏，将种子摇瓶置入恒温摇床中进行培养；
步骤五：配制摇瓶液体发酵培养基，并分装到发酵摇瓶中；分装完成后进行消毒灭菌，灭菌完成后的摇瓶液体发酵培养基冷却后，将步骤四中培养完成的脱氮假单胞菌摇瓶种子液，在无菌室中分别接种到摇瓶液体发酵培养基中，每个发酵摇瓶分别编号并与种子摇瓶一一对应；接种完成后，将发酵摇瓶置入恒温摇床中进行培养；
步骤六：摇瓶发酵培养完成后，使用高压液相色谱法检测每个编号的发酵摇瓶中维生素b12的含量，得到含量最高的发酵摇瓶编号；
步骤七：将含量最高的发酵摇瓶编号对应的三级固体种子培养基试管斜面取出，用做生产发酵的菌株。
2.根据权利要求1所述的脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12高产菌株的筛选方法，其特征在于：配制摇瓶补料液体培养基，分装完成后进行消毒灭菌，灭菌完成后的摇瓶补料液体培养基置于无菌室冷却；步骤五中，脱氮假单胞菌摇瓶发酵培养至第四天开始，每天在无菌室向每个发酵摇瓶补料，所述补料为向发酵摇瓶中补入摇瓶补料液体。
3.根据权利要求2所述的脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12高产菌株的筛选方法，其特征在于：步骤一中平板稀释涂布稀释倍数最高在107～109，平板培养温度为28～30℃，培养时间为2～3天；步骤二中挑选脱氮假单胞菌单菌落个数为10～50个，试管斜面培养温度为28～30℃，培养时间为2～3天；步骤三中三级固体种子培养基试管斜面培养温度为28～30℃，培养时间为2～3天；步骤四中摇瓶种子液体培养基容器为250ml锥形瓶，每个锥形瓶装液54～60ml，摇瓶培养温度为28～30℃，转速为70～120rpm，培养时间为20～28小时；步骤五中摇瓶液体发酵培养基容器为250ml锥形瓶，每个锥形瓶装液54～60ml，每个摇瓶接种量为4～6ml，摇瓶培养温度为31～33℃，转速为100～150rpm，培养时间为7～10天；每个发酵摇瓶补充摇瓶补料液体培养基4～6ml。
4.一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12高产菌株的筛选培养基，其特征在于：包括一级固体种子培养基、二级固体种子培养基、三级固体种子培养基、摇瓶液体种子培养基、摇瓶液体发酵培养基和摇瓶发酵补料培养基，所述一级固体种子培养基、二级固体种子培养基、三级固体种子培养基、摇瓶种子液体培养基、摇瓶液体发酵培养基和摇瓶发酵补料培养基均含有由甜菜根压榨制得的红糖。
5.根据权利要求4所述的脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12高产菌株的筛选培养基，其特征在于：所述一级固体种子培养基的组成至少包括：红糖56～64g/l，甜菜碱1～2g/l，磷酸氢二钾1.4～2.1g/l，硫酸铵0.2～0.3g/l，硫酸镁0.6～0.8g/l，硫酸锌0.73～0.92g/l，琼脂20～30g/l。
6.根据权利要求4所述的脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12高产菌株的筛选培养基，其特征在于：所述二级固体种子培养基的组成至少包括：红糖68～92g/l，玉米浆1.5～3.5g/l，甜菜碱9.8～12.2g/l，磷酸氢二钾1.4～2.1g/l，硫酸铵0.2～0.3g/l，硫酸镁0.6～0.8g/l，氧化镁0.04～0.06g/l，硫酸锌1.2～2.4g/l，琼脂20～30g/l。
7.根据权利要求4所述的脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12高产菌株的筛选培养基，其特征在于：所述三级固体种子培养基的组成至少包括：红糖80～100g/l，甜菜碱10～12g/l，磷酸氢二钾1.5～3g/l，硫酸铵0.4～0.6g/l，硫酸镁0.8～1.2g/l，硫酸锌1.6～1.8g/l，5，6-二甲基苯并咪唑0.15～0.3g/l，氯化钴0.2～0.4g/l，琼脂20～30g/l。
8.根据权利要求4所述的脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12高产菌株的筛选培养基，其特征在于：所述摇瓶液体种子培养基组成至少包括：红糖30～50g/l，玉米浆8～12g/l，甜菜碱3～5g/l，磷酸氢二钾1.5～3g/l，硫酸铵0.9～1.3g/l，硫酸镁1.8～2.2g/l，氧化镁0.04～0.06g/l，硫酸锌0.3～0.4g/l，5，6-二甲基苯并咪唑0.3～0.4g/l，氯化钴0.45～0.6g/l。
9.根据权利要求4所述的脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12高产菌株的筛选培养基，其特征在于：所述摇瓶发酵培养基组成至少包括：红糖60～100g/l，玉米浆26～34g/l，甜菜碱6～10g/l，磷酸氢二钾3～6g/l，硫酸铵1.8～2.6g/l，硫酸镁1.8～2.2g/l，氧化镁0.04～0.06g/l，硫酸锌0.6～0.8g/l，5，6-二甲基苯并咪唑0.6～0.8g/l，氯化钴0.9～1.2g/l，碳酸钙0.6～1.2g/l，聚醚性消泡剂gpe0.4～0.6g/l。
10.根据权利要求4所述的脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12高产菌株的筛选培养基，其特征在于：所述摇瓶补料培养基组成至少包括：红糖260～340g/l，甜菜碱96～124g/l，5，6-二甲基苯并咪唑0.1～0.2g/l，氯化钴0.1～0.2g/l。
技术总结