本发明属于细胞生物学和转化医学领域，尤其涉及一种midkine蛋白稳定高表达细胞系的构建和鉴定方法。
背景技术：
midkine蛋白是一种可分泌蛋白，在翻译完成后，去除信号肽的midkine分子量约为13kd。研究显示，midkine在人体组织中广泛表达，并可以通过分泌进入循环系统在体内进行转运。midkine广泛参与到免疫炎症反应，神经发育，血压调控等多种生理过程的调控中。最新的临床样本数据显示，在乳腺癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌等多种恶性肿瘤中，midkine的表达水平呈现上调趋势，且高表达midkine的病人组生存率显著下调，表明midkine是一种促癌因子。基于上述现象，midkine的功能研究一直都是研究的热点。
根据报道，midkine蛋白属于多效生长因子(pleiotrophin,ptn)家族。经典理论认为，分泌到细胞外的midkine蛋白通过与细胞膜上的受体相互结合调控下游信号通路，影响细胞的生理行为。已经发现的细胞膜midkine受体包括alk(anaplasticlymphomakinase)，ptpζ(proteintyrosinephosphataseζ),notch2，低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein，ldl)受体lrp1(ldlreceptorprotein1)等。midkine可以通过与这些受体结合，激活下游akt，erk等信号通路，促进细胞增殖等活动，但这些机制尚未与肿瘤的发生发展建立直接的联系。
此外，也有一些研究认为，细胞外的midkine单蛋白可以通过结合lrp1受体，通过胞吞作用进入细胞；进入细胞后midkine蛋白主要进入溶酶体降解，少数midkine蛋白可以进入细胞核，调控核糖体rna(rrna)的合成核修饰。但关于midkine在细胞内地功能研究很少，是关于midkine功能核作用机制研究的重大不足。
midkine是一种肝素(heparin)结合蛋白，可强烈而稳定地与heparin分子互作。由于肝素是一种由多糖构成地多聚体，分子量在15kd左右，不能被细胞吸收，因此，在细胞外与肝素结合地midkine蛋白即失去进入细胞地能力。
我们在研究中发现细胞外的midkine蛋白可以快速高效地转运进入细胞，在细胞中，midkine蛋白主要定位于细胞质中，与报道不甚吻合，可能与细胞特异性有关。更重要的是，我们发现midkine在细胞中行使重要的功能，例如调控ampk信号通路。
ampk(amp-activatedproteinkinase)蛋白是真核生物特有的能量感受和调节因子，在细胞的代谢平衡调控中处于核心地位。ampk是由α，β，γ三个亚基组成的异三聚体，其中β和γ亚基为调节亚基，γ亚基结合amp(5’-adenosinemonophosphate)使催化亚基α发生变构，被上游激酶lkb1(liverkinase1)激活。当能量胁迫发生，细胞中amp/atp(5'-adenylatetriphosphate)比例发生变化时，ampk大量磷酸化激活，进而发挥激酶活性通过磷酸化激活或抑制众多不同的下游底物，调控糖酵解，脂肪酸合成和β氧化，氨基酸代谢，糖原合成，细胞自噬等众多通路，达到促进分解代谢，抑制合成代谢，终止耗能生理过程的目的，使细胞适应能量胁迫的环境。如果在能量胁迫环境中ampk不能很好地激活，细胞会由于能量缺乏受损，发生细胞凋亡。
我们在研究中发现，midkine通过抑制上游lkb1蛋白的活性阻止lkb1对ampk蛋白的磷酸化作用，从而抑制ampk通路的激活。通过研究，我们发现midkine蛋白对lkb1-ampk通路的抑制作用发生于细胞内，即midkine蛋白需要进入细胞才可以对ampk的激活产生抑制作用。
基于以上研究现状，获得有活性的midkine蛋白，用于处理细胞，是研究midkine蛋白在细胞内功能的必要手段，对于进一步揭示midkine的作用机制具有极大的推动作用，对早日实现midkine在临床转化中的应用大有助益。
技术实现要素：
1.本发明的目的是提供一种体外收集midkine蛋白并用于处理细胞的方法，此方法获得的midkine蛋白，可用于研究midkine蛋白在细胞内的功能核作用机制。
2.本发明提供体外收集的midkine蛋白，是通过收集midkine该表达细胞的培养基，进行过滤核超滤浓缩获得的；这种midkine蛋白浓缩液可以用于处理midkine地表达细胞，使midkine蛋白进入细胞内；利用heparin，可以阻止浓缩液中的midkine进入细胞；通过westernblot检测细胞内外midkine蛋白水平ampk的磷酸化程度，可以验证midkine蛋白是否成功收集并进入细胞发挥功能。
3.本发明提供了一种体外收集midkine蛋白并用于处理细胞的方法，其步骤如下：
(1)通过westernblot实验找到midkine高表达核低表达的细胞系，并确认其具备分泌midkine蛋白至细胞外的能力(图1a，b)；
(2)选择midkine高表达细胞，按照2-5x106细胞/皿的数量将细胞接种到10cm培养皿中，用含有10％胎牛血清(fbs，serana，s-fbs-sa-015)的培养基进行培养；
(3)待24小时，细胞贴壁后，将细胞的培养基替换成无胎牛血清的培养基进行培养，使midkine蛋白分泌至培养基中；
(4)培养midkine低表达细胞，使用无胎牛血清培养基培养midkine高表达细胞24小时后，按照0.5-1.5x106细胞/皿的数量将midkine低表达细胞接种到6cm培养皿中；
(5)使用无胎牛血清培养基培养midkine高表达细胞48小时后，用注射器吸取含有midkine蛋白的培养基，使用0.22μm滤膜(millipore,slgp033rb)过滤，去除死细胞，细胞碎片等杂质；
(6)过滤后，将含有midkine蛋白的培养基转移至10kd超滤管(millipore,ufc901096)中，以3000-5000g离心力离心0.5-3小时，将10ml细胞培养基浓缩至250-1000μl，获得midkine蛋白浓缩液；
(7)将获得的midkine蛋白浓缩液加入midkine低表达细胞培养基中，可在加入midkine浓缩液时同时加入终浓度为10-50μg/ml的heparin，处理0-4小时；
(8)处理后，每个midkine低表达细胞的培养皿加入1-2mlpbs(hyclone，sh30256.01)洗去剩余培养基，吸走pbs，将细胞培养皿置于液氮中淬灭；
(9)每个培养皿加入100-200μl的ripa裂解液(cst，9806s)，用细胞刮铲将细胞刮下，转移至1.5ml离心管中，4℃静止0.5至1小时，裂解细胞；
(10)4℃，12000rpm离心15min，吸取上清，获得细胞蛋白样品，按比例加入4xloadingbuffer(takara，9173)，97℃变性10分钟，做好上样准备；
(11)将蛋白样品加入上样孔中进行sds-page电泳，电泳结束后用湿转法将丙烯酰胺凝胶上的蛋白转印至0.45μm的pvdf膜上，使用5％脱脂奶粉(bd，232100)孵育1-3小时进行封闭，分别使用β-actin(proteintech，20536-1-ap)和midkine(origene，ta310977)，ampkα(cst，5831)，p-ampkαt72(cst，2535)，p-lkb1s428(cst，3482),lkb1(cst,3047),p-akts473(cst,4060),akt(cst,4691)特异兔源一抗4℃孵育过夜.第二天，回收一抗，用tbstbuffer(10mmtris-hcl，150mmnacl，0.1％tween-20)洗pvdf膜三次，每次10min，加入溶于5％脱脂奶粉(bd，232100)的羊抗兔二抗(millipore，ap-132-p)，室温反应1小时，用tbstbuffer(10mmtris-hcl，150mmnacl，0.1％tween-20)洗pvdf膜三次，每次10min，完成发光准备工作；
(12)使用ecl发光液(tanon，180-501)进行化学发光反应，检测蛋白表达水平。可检测到外部施加的midkine蛋白已经转移到细胞内部，并引起lkb1和ampk蛋白磷酸化程度降低(图1c，d)，在加入heparin的实验组中，midkine未能进入细胞，使ampk磷酸化维持在较高水平(图1d)；
(14)与现有技术相比，应用本发明利用midkine蛋白的分泌特性，使用midkine高表达细胞为来源，保证了midkine蛋白的生物学活性；通过无血清培养，使获得的midkine浓缩液中减少了其它生长因子的干扰，同时降低生长因子总浓度，便于超滤操作；本发明利用midkine蛋白与heparin结合的特性，在培养基中加入肝素分子，改变midkine蛋白进入细胞的能力，丰富了实验设计的灵活性；本发明为研究midkine在细胞内的功能和作用机制提供了新的方法，为实现midkine的临床转化应用埋下了基石。
附图说明
图1：体外收集midkine蛋白并用于处理细胞的方法。(a)利用westernblot实验检测不同细胞中midkine表达水平；(b)利用westernblot检测不同细胞中培养基中midkine分泌情况；(c)体外收集midkine蛋白后用于处理mhcc97h细胞，在不同时间通过westernblot实验检测midkine蛋白转运进入细胞地情况以及相应lkb1，ampk蛋白地磷酸化水平改变；(d)体外收集midkine蛋白后用于处理mhcc97h细胞，同时加入heparin处理，通过westernblot实验检测midkine蛋白转运进入细胞地情况以及相应lkb1，ampk蛋白地磷酸化水平改变。
具体实施方式
下面通过体外收集midkine蛋白并用于处理细胞的实例，详细描述本发明的效果
实例1
体外收集lm3细胞分泌的midkine蛋白并用于处理mhcc97h细胞
1)使用westernblot的方法检测不同细胞中midkine的表达水平，发现在lm3和hepg2细胞中midkine蛋白表达水平远高于正常细胞thle-2(图1a)，同时，在lm3和hepg2细胞的培养基中也可以检测到大量分泌的midkine蛋白(图1b)，说明这两种细胞可以作为midkine蛋白的供体，而在7402和mhcc97h细胞中，midkine表达水平远低于正常细胞thle-2，可作为midkine蛋白的接受细胞；
(2)选择midkine高表达细胞lm3进行培养，按照2x106细胞/皿的数量将lm3细胞接种到10cm培养皿中，用含有10％胎牛血清(serana，s-fbs-sa-015)的dmem培养基(gibco，c11995500bt)进行培养；
(3)待24小时后，通过显微镜观察到lm3细胞已经贴壁生长，将lm3细胞的培养基替换成无胎牛血清的dmem培养基(gibco，c11995500bt)进行培养，使midkine蛋白分泌至培养基中；
(4)培养midkine低表达细胞mhcc97h，在使用无胎牛血清dmem培养基(gibco，c11995500bt)培养lm3细胞24小时后，按照1.2x106细胞/皿的数量将mhcc97h细胞接种到6cm培养皿中，使用含10％胎牛血清(serana，s-fbs-sa-015)的rpmi-1640培养基(gibco，c11875500bt)进行培养；
(5)在使用无胎牛血清dmem培养基(gibco，c11995500bt)培养lm3细胞48小时后，用注射器吸取含有midkine蛋白的培养基，使用0.22μm滤膜(millipore,slgp033rb)过滤，去除死细胞，细胞碎片等杂质；
(6)过滤后，将含有midkine蛋白的培养基转移至10kd超滤管(millipore,ufc901096)中，以4800g离心力离心1.5小时，将10ml细胞培养基浓缩至250μl，获得midkine蛋白浓缩液；
(7)将获得的midkine蛋白浓缩液加入3个培养mhcc97h细胞的6cm培养皿中，分别处理0，0.5和1小时；
(8)处理后，向mhcc97h细胞的培养皿中加入1-2mlpbs(hyclone，sh30256.01)洗去剩余培养基，吸走pbs，将细胞培养皿置于液氮中淬灭；
(9)每个培养皿加入100-200μl的ripa裂解液(cst，9806s)，用细胞刮铲将细胞刮下，转移至1.5ml离心管中，4℃静止0.5小时，裂解细胞；
(10)4℃，12000rpm离心15min，吸取上清，获得细胞蛋白样品，按比例加入4xloadingbuffer(takara，9173)，97℃变性10分钟，做好上样准备；
(11)将蛋白样品加入上样孔中进行sds-page电泳，电泳结束后用湿转法将丙烯酰胺凝胶上的蛋白转印至0.45μm的pvdf膜(millipore，ipvh00010)上，使用5％脱脂奶粉(bd，232100)孵育1-3小时进行封闭，分别使用β-actin(proteintech，20536-1-ap)和midkine(origene，ta310977)，ampkα(cst，5831)，p-ampkαt72(cst，2535)，p-lkb1s428(cst，3482),lkb1(cst,3047),p-akts473(cst,4060),akt(cst,4691)特异兔源一抗4℃孵育过夜；第二天，回收一抗，用tbstbuffer(10mmtris-hcl，150mmnacl，0.1％tween-20)洗pvdf膜三次，每次10min，加入溶于5％脱脂奶粉(bd，232100)的羊抗兔二抗(millipore，ap-132-p)，室温反应1小时，用tbstbuffer(10mmtris-hcl，150mmnacl，0.1％tween-20)洗pvdf膜三次，每次10min，完成发光准备工作；
(12)使用ecl发光液(tanon，180-501)进行化学发光反应，检测蛋白表达水平。可检测到外部施加的midkine蛋白已经转移到细胞内部，并引起lkb1和ampk蛋白磷酸化程度降低，而akt磷酸化程度升高(图1c)，与已知midkine的功能吻合，证明收集midkine并处理细胞的操作成功。
实例2
体外收集lm3细胞分泌的midkine蛋白并结合heparin用于处理mhcc97h细胞
(1)使用westernblot的方法检测不同细胞中midkine的表达水平，发现在lm3和hepg2细胞中midkine蛋白表达水平远高于正常细胞thle-2(图1a)，同时，在lm3和hepg2细胞的培养基中也可以检测到大量分泌的midkine蛋白(图1b)，说明这两种细胞可以作为midkine蛋白的供体，而在7402和mhcc97h细胞中，midkine表达水平远低于正常细胞thle-2，可作为midkine蛋白的接受细胞；
(2)选择midkine高表达细胞lm3进行培养，按照2x106细胞/皿的数量将lm3细胞接种到10cm培养皿中，用含有10％胎牛血清(serana，s-fbs-sa-015)的dmem培养基(gibco，c11995500bt)进行培养；
(3)待24小时后，通过显微镜观察到lm3细胞已经贴壁生长，将lm3细胞的培养基替换成无胎牛血清的dmem培养基(gibco，c11995500bt)进行培养，使midkine蛋白分泌至培养基中；
(4)培养midkine低表达细胞mhcc97h，在使用无胎牛血清dmem培养基(gibco，c11995500bt)培养lm3细胞24小时后，按照1.2x106细胞/皿的数量将mhcc97h细胞接种到6cm培养皿中，使用含10％胎牛血清(serana，s-fbs-sa-015)的rpmi-1640培养基(gibco，c11875500bt)进行培养；
(5)在使用无胎牛血清dmem培养基(gibco，c11995500bt)培养lm3细胞48小时后，用注射器吸取含有midkine蛋白的培养基，使用0.22μm滤膜(millipore,slgp033rb)过滤，去除死细胞，细胞碎片等杂质；
(6)过滤后，将含有midkine蛋白的培养基转移至10kd超滤管(millipore,ufc901096)中，以4800g离心力离心1.5小时，将10ml细胞培养基浓缩至250μl，获得midkine蛋白浓缩液；
(7)将获得的midkine蛋白浓缩液加入2个培养mhcc97h细胞的6cm培养皿中，并在其中一个皿中加入终浓度为30μg/ml的肝素，处理2小时；
(8)处理后，向mhcc97h细胞的培养皿中加入1-2mlpbs(hyclone，sh30256.01)洗去剩余培养基，吸走pbs，将细胞培养皿置于液氮中淬灭；
(9)每个培养皿加入100-200μl的ripa裂解液(cst，9806s)，用细胞刮铲将细胞刮下，转移至1.5ml离心管中，4℃静止0.5小时，裂解细胞；
(10)4℃，12000rpm离心15min，吸取上清，获得细胞蛋白样品，按比例加入4xloadingbuffer(takara，9173)，97℃变性10分钟，做好上样准备；
(11)将蛋白样品加入上样孔中进行sds-page电泳，电泳结束后用湿转法将丙烯酰胺凝胶上的蛋白转印至0.45μm的pvdf膜(millipore，ipvh00010)上，使用5％脱脂奶粉(bd，232100)孵育1-3小时进行封闭，分别使用β-actin(proteintech，20536-1-ap)和midkine(origene，ta310977)，ampkα(cst，5831)，p-ampkαt72(cst，2535)特异兔源一抗4℃孵育过夜；第二天，回收一抗，用tbstbuffer(10mmtris-hcl，150mmnacl，0.1％tween-20)洗pvdf膜三次，每次10min，加入溶于5％脱脂奶粉(bd，232100)的羊抗兔二抗(millipore，ap-132-p)，室温反应1小时，用tbstbuffer(10mmtris-hcl，150mmnacl，0.1％tween-20)洗pvdf膜三次，每次10min，完成发光准备工作；
(12)使用ecl发光液(tanon，180-501)进行化学发光反应，检测蛋白表达水平。可检测到外部施加的midkine蛋白已经转移到细胞内部，并导致ampk蛋白磷酸化程度降低，而加入heparin处理阻止了midkine蛋白进入细胞，从而维持了ampk的磷酸化激活状态(图1d)，与已知midkine的功能吻合，证明收集midkine并处理细胞，以及用heparin干扰midkine进入细胞的操作成功。
1.体外收集midkine蛋白并用于处理细胞的方法，其特征在于，
1)培养高表达midkine蛋白的细胞，利用midkine蛋白的分泌特性，在培养基中收集midkine蛋白；收集细胞培养基中分泌的midkine蛋白，过滤除去细胞碎片；超滤浓缩后得midkine蛋白浓缩液；
2)采用midkine蛋白浓缩液处理低表达midkine蛋白的细胞，mk蛋白可以转运至细胞内，并抑制ampk的磷酸化水平；
或，在细胞外施加midkine蛋白浓缩液的同时加入肝素(heparin)，检测发现heparin抑制了midkine蛋白进入细胞，并提高了ampk蛋白的活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
包括以下步骤：
(1)使用无血清培养基培养高表达midkine的细胞，收集其培养基；
(2)对含有midkine的培养基进行过滤除杂质，超滤浓缩获得midkine蛋白浓缩液，用于加入midkine低表达细胞的培养基中进行处理；
(3)使用midkine蛋白浓缩液处理midkine低表达细胞，同时加入肝素(heparin)，阻止midkine蛋白进入细胞；
(4)使用westernblot实验检测midkine低表达细胞中midkine蛋白水平和ampk蛋白磷酸化水平，证明细胞外施加的midkine蛋白是否进入细胞并发挥功能；
提取细胞蛋白，进行westernblot实验，证明midkine蛋白未能进入细胞，不能影响ampk蛋白的磷酸化，并提高了ampk蛋白的活性。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，培养midkine高表达细胞的方法，包含以下步骤：
(1)选择midkine高表达细胞，接种到10cm培养皿；
(2)24小时后，使用无血清培养基培养细胞，使midkine蛋白分泌到培养基中；
(3)培养48小时后，获得含有midkine蛋白的细胞培养基。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述高表达midkine的细胞为midkine蛋白表达水平高于正常组织细胞的细胞株，midkine低表达细胞为midkine表达水平低于正常组织细胞的细胞株。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用含midkine的培养基处理细胞的方法，包含以下步骤：
(1)对含有midkine蛋白的培养基进行过滤去除死细胞等杂质；
(2)对含有midkine的培养基进行超滤浓缩，制成midkine蛋白浓缩液；
(3)将midkine蛋白浓缩液加入到midkine低表达细胞培养基中，使midkine进入细胞；
(4)提取细胞蛋白，进行westernblot实验，通过特异抗体检测细胞中midkine表达水平以及ampk蛋白磷酸化水平，证明midkine蛋白是否进入细胞并发挥功能；蛋白可以转运至midkine低表达细胞内，并抑制ampk的磷酸化水平。
技术总结