本发明属于生物技术领域,涉及一种小分子肽螯合铁的制备方法,具体涉及一种林蛙皮小分子肽螯合铁的制备方法。
背景技术：
林蛙是我国著名的经济蛙种，大部分生活在我国东北部，尤其以吉林省林蛙数量最多、分布最广、质量最好。现今，林蛙多被人们用于医药、美容及美食行业，具有极高的营养保健价值和医疗价值。据报道，林蛙年产量很高，但绝大部分用于食用和林蛙油的提取上，而由于林蛙产品深加工技术缺乏，研发投入不足、可持续发展能力较弱，林蛙的加工利用度极低。其中，林蛙的皮中含有大量丰富的胶原蛋白和透明质酸，林蛙皮中胶原蛋白含量可多达48％，多肽类含量可达12％以上。因此，由调查得到启示，提出一种林蛙皮提取小分子肽与铁螯合制备螯合铁的方法，对促进我国林蛙产业的发展具有重要的推动作用。
自然界中天然存在的活性多肽在生物体中含量低，由于直接提取活性多肽工程复杂,难以实现工厂大量生产供给所需，另一方面人工化学合成多肽成本昂贵，时间较长，效率较低。所以人们更多地把目光投向开发蛋白酶解产物获得活性肽这条途径上来。
人们饮食主要以植物性食物为主，无法满足人体对铁的需求，因此需要额外补铁。铁元素为人体必须的微量元素，血红蛋白，肌红蛋白，很多酶的合成都不能离开它,而大多数人会出现缺铁的相关症状，缺铁会引发缺铁性贫血，儿童生长发育迟缓，出现肌肉软弱、运动能力下降、易疲劳，更易使人呼吸道感染。同时，缺铁会影响其他微量元素的正常吸收。制备小分子肽螯合铁，就是添加铁源的一种方法，它既有利于微量元素以螯合物的形势完整的被转运吸收，又能有效的把铁离子释放出来。目前市场中小分子螯合铁类的产品较为少见，小分子肽比蛋白多肽更易被人体吸收，同时有利于微量元素以螯合物的形式被人体消化，达到补铁的作用。由于螯合制剂吸收效率好，生物学效价高，成为近年来研究螯合铁制剂的热门方向。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用林蛙皮提取小分子肽，并针对目前市售的补铁产品具有一定的刺激性，且身体吸收缓慢需长期服用，提供了一种林蛙皮小分子肽螯合铁的制备方法。
为解决以上技术问题,本发明采用的技术方案是：
(1)预处理：对林蛙皮进行清洗，45-60℃烘干2-3h，将林蛙皮放入超细粉碎机中进行粉碎，过100-200目筛子，得到林蛙皮细粉。
(2)脱色：脱色剂采用过氧化氢，ph需维持在弱碱环境下，为保证脱色效率较高同时不影响肽的活性，脱色过程采用含1％h2o2的0.18mol/l氢氧化钠调节ph，脱色时间控制在6-18h。为了脱色完全，可借助超声破碎仪，使林蛙皮粉末能够与脱色液充分混合，达到脱色最佳效果。
(3)脱脂：乳化法进行脱脂，乳化剂采用20％吐温-80，控制料液比在1:10-1:50，脱脂时间控制在3-6h。
(4)酶固化：借助光辐射物理技术对内肽酶、丝氨酸氨肽酶和风味蛋白酶进行定点固定化达到提高复合酶的稳定性，三种酶质量比为2:2:1，固定化时间控制在2-6h，固定化温度控制在50-60℃。
(5)提取：将林蛙皮放置于恒温水浴锅中，加入蒸馏水溶解林蛙皮，加入复合酶，m复合蛋白酶：m原料＝1:50-1:100，采用双光波-水浴复合酶辅助法水解林蛙皮，酶解温度控制在40-60℃，料液比(质量体积比g/ml)为1:10-1:30；红光和红外光双色灯照射时间为20-60min；，酶解时间控制在1.5-4h，ph为6.5-8；酶解完成后90℃高温灭酶活15min，8000r/min离心20min，取上清液即获得酶解多肽液。
(6)分离：采用超滤，收集滤液，即得到分子量在1000da以下的林蛙皮小分子肽液。
(7)螯合：将林蛙小分子肽液加入金属螯合剂生产设备中，加入适量的5％抗坏血酸，向进料口添加无水fecl2，肽铁比(质量体积比g/ml)为5：1-10:1，调节螯合温度为30-50℃，鳌合时间为40-60min，螯合结束后进入离心罐中，由于小分子肽螯合铁质量较fe2 重被分离出来；将得到的小分子肽螯合铁加入到含有6-8倍体积的异丙醇沉降罐中，于4℃条件下沉降2h，进行5000r/min离心15min，真空冷冻干燥后即得林蛙皮小分子肽螯合铁。
作为优选，所述步骤(1)中，将洗净的林蛙皮置于温度为55℃的烘箱中烘干2h，过筛得200目的林蛙皮细粉。
作为优选，所述步骤(2)中，将过氧化氢作为脱色剂，脱色时间控制在10h，用氢氧化钠调节ph，维持在弱碱环境中。
作为优选，所述步骤(3)中，脱脂料液比为1:30，脱脂时间为5h。
作为优选，所述步骤(4)中，以壳聚糖为载体固定内肽酶、丝氨酸氨肽酶和风味蛋白酶，三种酶质量比为2:2:1，固化时间为3h，温度为60℃。
作为优选，所述步骤(5)中，采用双光波-水浴复合酶辅助法，双光波为红光和红外光综合光波照射，能加速复合酶的协同作用，提高酶活。酶解温度50℃，料液比为1:20g/ml，m复合蛋白酶：m原料＝1:50，酶解时间为2h，ph为7。
作为优选，所述步骤(7)中，螯合罐温度为40℃，螯合时间为40min，肽铁比为10：1ml/g，无水乙醇添加倍数为7。
所述林蛙皮小分子肽螯合铁在普通食品中的应用。
所述林蛙皮小分子肽螯合铁在营养保健品中的应用。
所述林蛙皮小分子肽螯合铁在生物制药中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)利用壳聚糖固定化技术稳定酶活性，采用双光波-水浴复合酶辅助法酶解林蛙皮，酶解时间短，易操作，效率高，应用广。
(2)本发明采用小分子肽液与亚铁离子进行螯合，比冷冻干燥成林蛙粉再进行螯合，所需的时耗短、螯合率高、成本低、生物效价高。
(3)利用大量的林蛙皮，进行林蛙皮小分子肽螯合铁的制备，不仅妥善处理了皮的问题，避免了林蛙整体资源的浪费，还能够提高林蛙皮的利用率，同时避免了生态污染，提高了经济效益，为林蛙的广阔应用前景作出贡献。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1
(1)预处理：将50g林蛙皮洗净，50℃烘干2.5h，将林蛙皮放入超细粉碎机中进行粉碎，过200目筛，得到林蛙皮细粉44g。
(2)脱色：脱色剂采用过氧化氢，借助超声破碎仪，脱色过程采用含1％h2o2的0.18mol/l氢氧化钠调节ph，脱色时间控制在8h。
(3)脱脂：加入1.32l的20％吐温-80，脱脂4h，得林蛙皮粉41.8g。
(4)酶固化：借助光辐射物理技术对内肽酶、丝氨酸氨肽酶和风味蛋白酶进行定点固定化达到提高复合酶的稳定性，三种酶质量比为2:2:1，固定化时间控制在3h，固定化温度控制在50℃。
(5)提取：将41.8g林蛙皮粉置于恒温水浴锅中，按照1:20加入蒸馏水溶解，m复合蛋白酶：m原料＝1:50加入复合蛋白酶，采用双光波-水浴复合酶辅助法水解林蛙皮，酶解温度为40℃，红光和红外光双色灯照射时间为30min；，酶解时间控制在2h，ph为6.5；酶解完成后90℃高温灭酶活15min，8000r/min离心20min，取上清液即获得酶解多肽液809ml和残渣6.7g。
(6)分离：采用超滤，收集滤液，即得到分子量在1000da以下445ml林蛙皮小分子肽液。
(7)螯合：将445ml林蛙小分子肽液加与44.5g无水fecl2加入金属螯合剂生产设备中，加入适量的5％抗坏血酸，调节螯合温度为40℃，鳌合时间为50min，螯合结束后进入离心罐中，将得到的小分子肽螯合铁加入到含有7倍体积的异丙醇沉降罐中，于4℃条件下沉降2h，进行5000r/min离心15min，真空冷冻干燥后即得林蛙皮小分子肽螯合铁165.4g。
实施例2
(1)预处理：将100g林蛙皮洗净，50℃烘干3h，将林蛙皮放入超细粉碎机中进行粉碎，过200目筛，得到林蛙皮细粉88.6g。
(2)脱色：脱色剂采用过氧化氢，借助超声破碎仪，脱色过程采用含1％h2o2的0.18mol/l氢氧化钠调节ph，脱色时间控制在9h。
(3)脱脂：加入886ml的20％吐温-80，脱脂6h，得林蛙皮粉84.1g。
(4)酶固化：借助光辐射物理技术对内肽酶、丝氨酸氨肽酶和风味蛋白酶进行定点固定化达到提高复合酶的稳定性，三种酶质量比为2:2:1，固定化时间控制在3h，固定化温度控制在55℃。
(5)提取：将84.1g林蛙皮粉置于恒温水浴锅中，按照1:20加入蒸馏水溶解，m复合蛋白酶：m原料＝1:100加入复合蛋白酶，采用双光波-水浴复合酶辅助法水解林蛙皮，酶解温度为50℃，红光和红外光双色灯照射时间为20min；，酶解时间控制在2.5h，ph为7.5；酶解完成后90℃高温灭酶活15min，8000r/min离心20min，取上清液即获得酶解多肽液1587ml和残渣14.3g。
(6)分离：采用超滤，收集滤液，即得到分子量在1000da以下802ml林蛙皮小分子肽液。
(7)螯合：将802ml林蛙小分子肽液加与80.2g无水fecl2加入金属螯合剂生产设备中，加入适量的5％抗坏血酸，调节螯合温度为50℃，鳌合时间为40min，螯合结束后进入离心罐中，将得到的小分子肽螯合铁加入到含有7倍体积的异丙醇沉降罐中，于4℃条件下沉降2h，进行5000r/min离心15min，真空冷冻干燥后即得林蛙皮小分子肽螯合铁310.2g。
实施例3
(1)预处理：将100g林蛙皮洗净，50℃烘干2.5h，将林蛙皮放入超细粉碎机中进行粉碎，过200目筛，得到林蛙皮细粉88.6g。
(2)脱色：脱色剂采用过氧化氢，借助超声破碎仪，脱色过程采用含1％h2o2的0.18mol/l氢氧化钠调节ph，脱色时间控制在10h。
(3)脱脂：加入1772ml的20％吐温-80，脱脂5h，得林蛙皮粉84g。
(4)酶固化：借助光辐射物理技术对内肽酶、丝氨酸氨肽酶和风味蛋白酶进行定点固定化达到提高复合酶的稳定性，三种酶质量比为2:2:1，固定化时间控制在4h，固定化温度控制在60℃。
(5)提取：将84g林蛙皮粉置于恒温水浴锅中，按照1:20加入蒸馏水溶解，m复合蛋白酶：m原料＝1:50加入复合蛋白酶，采用双光波-水浴复合酶辅助法水解林蛙皮，酶解温度为55℃，红光和红外光双色灯照射时间为25min；，酶解时间控制在2h，ph为7.5；酶解完成后90℃高温灭酶活15min，8000r/min离心20min，取上清液即获得酶解多肽液1630ml和残渣12.3g。
(6)分离：采用超滤，收集滤液，即得到分子量在1000da以下886ml林蛙皮小分子肽液。
(7)螯合：将886ml林蛙小分子肽液加与88.6g无水fecl2加入金属螯合剂生产设备中，加入适量的5％抗坏血酸，调节螯合温度为55℃，鳌合时间为40min，螯合结束后进入离心罐中，将得到的小分子肽螯合铁加入到含有7倍体积的异丙醇沉降罐中，于4℃条件下沉降2h，进行5000r/min离心15min，真空冷冻干燥后即得林蛙皮小分子肽螯合铁344.3g。
实施例4
(1)预处理：将200g林蛙皮洗净，50℃烘干2h，将林蛙皮放入超细粉碎机中进行粉碎，过200目筛，得到林蛙皮细粉175.4g。
(2)脱色：脱色剂采用过氧化氢，借助超声破碎仪，脱色过程采用含1％h2o2的0.18mol/l氢氧化钠调节ph，脱色时间控制在10h。
(3)脱脂：加入4.39l的20％吐温-80，脱脂5h，得林蛙皮粉165.6g。
(4)酶固化：借助光辐射物理技术对内肽酶、丝氨酸氨肽酶和风味蛋白酶进行定点固定化达到提高复合酶的稳定性，三种酶质量比为2:2:1，固定化时间控制在4h，固定化温度控制在55℃。
(5)提取：将165.6g林蛙皮粉置于恒温水浴锅中，按照1:20加入蒸馏水溶解，m复合蛋白酶：m原料＝1:50加入复合蛋白酶，采用双光波-水浴复合酶辅助法水解林蛙皮，酶解温度为60℃，红光和红外光双色灯照射时间为35min；，酶解时间控制在3h，ph为7.5；酶解完成后90℃高温灭酶活15min，8000r/min离心20min，取上清液即获得酶解多肽液3162ml和残渣26.6g。
(6)分离：采用超滤，收集滤液，即得到分子量在1000da以下1610ml林蛙皮小分子肽液。
(7)螯合：将1610ml林蛙小分子肽液加与161g无水fecl2加入金属螯合剂生产设备中，加入适量的5％抗坏血酸，调节螯合温度为60℃，鳌合时间为40min，螯合结束后进入离心罐中，将得到的小分子肽螯合铁加入到含有7倍体积的异丙醇沉降罐中，于4℃条件下沉降2h，进行5000r/min离心15min，真空冷冻干燥后即得林蛙皮小分子肽螯合铁678.3g。
实施例5
(1)预处理：将200g林蛙皮洗净，45℃烘干2h，将林蛙皮放入超细粉碎机中进行粉碎，过200目筛，得到林蛙皮细粉157.8g。
(2)脱色：脱色剂采用过氧化氢，借助超声破碎仪，脱色过程采用含1％h2o2的0.18mol/l氢氧化钠调节ph，脱色时间控制在12h。
(3)脱脂：加入3.16l的20％吐温-80，脱脂5h，得林蛙皮粉151.4g。
(4)酶固化：借助光辐射物理技术对内肽酶、丝氨酸氨肽酶和风味蛋白酶进行定点固定化达到提高复合酶的稳定性，三种酶质量比为2:2:1，固定化时间控制在3h，固定化温度控制在55℃。
(5)提取：将151.4g林蛙皮粉置于恒温水浴锅中，按照1:20加入蒸馏水溶解，m复合蛋白酶：m原料＝1:50加入复合蛋白酶，采用双光波-水浴复合酶辅助法水解林蛙皮，酶解温度为45℃，红光和红外光双色灯照射时间为40min；，酶解时间控制在2h，ph为7.5；酶解完成后90℃高温灭酶活15min，8000r/min离心20min，取上清液即获得酶解多肽液2876ml和残渣34.4g。
(6)分离：采用超滤，收集滤液，即得到分子量在1000da以下1237ml林蛙皮小分子肽液。
(7)螯合：将1237ml林蛙小分子肽液加与247.4g无水fecl2加入金属螯合剂生产设备中，加入适量的5％抗坏血酸，调节螯合温度为55℃，鳌合时间为40min，螯合结束后进入离心罐中，将得到的小分子肽螯合铁加入到含有8倍体积的异丙醇沉降罐中，于4℃条件下沉降2h，进行5000r/min离心15min，真空冷冻干燥后即得林蛙皮小分子肽螯合铁487.8g。
1.一种林蛙皮小分子肽螯合铁的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：林蛙皮的预处理
对林蛙皮进行清洗，45-60℃烘干2-3h，将林蛙皮放入超细粉碎机中进行粉碎，过100-200目筛子，得到林蛙皮细粉；
步骤二：脱色
脱色剂采用过氧化氢，ph值需维持在弱碱环境下，为保证脱色效率较高同时不影响肽的活性，脱色过程采用含1％h2o2的0.18mol/l氢氧化钠调节ph，脱色时间控制在6-18h,为了脱色完全，可借助超声破碎仪，使林蛙皮粉末能够与脱色液充分混合，达到脱色最佳效果；
步骤三：脱脂
乳化法进行脱脂，乳化剂采用20％吐温-80，控制料液比在1:10-1:50，脱脂时间控制在3-6h；
步骤四：酶固化
借助光辐射物理技术对内肽酶、丝氨酸氨肽酶和风味蛋白酶进行定点固定化达到提高复合酶的稳定性，三种酶质量比为2:2:1，固定化时间控制在2-6h，固定化温度控制在50-60℃；
步骤五：提取
将林蛙皮放置于恒温水浴锅中，加入蒸馏水溶解林蛙皮，加入复合酶，m复合蛋白酶：m原料＝1:50-1:100，采用双光波-水浴复合酶辅助法水解林蛙皮，酶解温度控制在40-60℃，料液比(质量体积比g/ml)为1:10-1:30，红光和红外光双色灯照射时间为20-60min，酶解时间控制在1.5-4h，ph为6.5-8；酶解完成后90℃高温灭酶活15min，8000r/min离心20min，取上清液即获得酶解多肽液；
步骤六：分离
采用超滤，收集滤液，即得到分子量在1000da以下的林蛙皮小分子肽液；
步骤七：螯合
将林蛙小分子肽液加入金属螯合剂生产设备中，加入适量的5％抗坏血酸，向进料口添加无水fecl2，肽铁比(质量体积比g/ml)为5：1-10:1，调节螯合温度为30-50℃，鳌合时间为40-60min，螯合结束后进入离心罐中，由于小分子肽螯合铁质量较fe2 重被分离出来,将得到的小分子肽螯合铁加入到含有6-8倍体积的异丙醇沉降罐中，于4℃条件下沉降2h，进行5000r/min离心15min，真空冷冻干燥后即得林蛙皮小分子肽螯合铁。
2.根据权利要求1所述的一种林蛙皮小分子肽螯合铁的制备方法,其特征在于，所述步骤一中烘干温度55℃，时间2h，粉碎数目为200目。
3.根据权利要求1所述的一种林蛙皮小分子肽螯合铁的制备方法,其特征在于，所述步骤二中将过氧化氢作为脱色剂，脱色时间控制在10h，用氢氧化钠调节ph，维持在弱碱环境中。
4.根据权利要求1所述的一种林蛙皮小分子肽螯合铁的制备方法,其特征在于，所述步骤三中脱脂料液比为1:30，脱脂时间为5h。
5.根据权利要求1所述的一种林蛙皮小分子肽螯合铁的制备方法,其特征在于，所述步骤四中以壳聚糖为载体固定内肽酶、丝氨酸氨肽酶和风味蛋白酶，三种酶质量比为2:2:1，固化时间为3h，温度为60℃。
6.根据权利要求1所述的一种林蛙皮小分子肽螯合铁的制备方法,其特征在于，所述步骤五中采用双光波-水浴复合酶辅助法，双光波为红光和红外光综合光波照射，酶解温度50℃，料液比为1:20g/ml，m复合蛋白酶：m原料＝1:50，酶解时间为2h，ph为7。
7.根据权利要求1所述的一种林蛙皮小分子肽螯合铁的制备方法,其特征在于，所述步骤七中螯合罐温度为40℃，螯合时间为40min，肽铁比为10：1ml/g，无水乙醇添加倍数为7。
8.根据权利要求1所述方法制备的林蛙皮小分子肽螯合铁在普通食品中的应用。
9.根据权利要求1所述方法制备的林蛙皮小分子肽螯合铁在营养保健品中的应用。
10.根据权利要求1所述方法制备的林蛙皮小分子肽螯合铁在生物制药中的应用。
技术总结